תרבית תאים IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לטיפוח תאי IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (תלת-ממדית).

Abstract

אוסטיאוציטים נחשבים לתאים לא מתרבים המתמיינים באופן סופני מאוסטאובלסטים. אוסטאובלסטים המשובצים במטריצה החוץ תאית של העצם (אוסטיאואיד) מבטאים את הגן Pdpn ליצירת דנדריטים תאיים והופכים לפראוסטיאוציטים. מאוחר יותר, פראוסטיאוציטים מבטאים את הגן Dmp1 כדי לקדם מינרליזציה של מטריצה ובכך להפוך לאוסטיאוציטים בוגרים. תהליך זה נקרא אוסטיאוציטוגנזה. IDG-SW3 הוא קו תאים ידוע למחקרי מבחנה של אוסטיאוציטוגנזה. שיטות קודמות רבות השתמשו בקולגן I כמרכיב העיקרי או היחיד של מטריצת התרבית. עם זאת, בנוסף לקולגן I, האוסטאואיד מכיל גם חומר טחון, שהוא מרכיב חשוב בקידום גדילה, היצמדות ונדידה של תאים. בנוסף, חומר המטריצה שקוף, מה שמגביר את השקיפות של הג'ל שנוצר על ידי קולגן, ובכך מסייע לחקר היווצרות הדנדריטים באמצעות טכניקות הדמיה. לפיכך, מאמר זה מפרט פרוטוקול ליצירת ג'ל תלת-ממדי באמצעות מטריצה חוץ-תאית יחד עם קולגן I להישרדות IDG-SW3. בעבודה זו, היווצרות דנדריטים וביטוי גנים נותחו במהלך אוסטאוציטוגנזה. לאחר 7 ימים של תרבית אוסטאוגנית, נצפתה בבירור רשת דנדריטים נרחבת תחת מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי. PCR בזמן אמת הראה כי רמות mRNA של Pdpn ו - Dmp1 עלו ללא הרף במשך 3 שבועות. בשבוע 4, המיקרוסקופ הסטריאוסקופ גילה ג'ל אטום מלא בחלקיקים מינרליים, התואם את בדיקת קרני רנטגן פלואורסצנטיות (XRF). תוצאות אלה מצביעות על כך שמטריצת תרבית זו מקלה בהצלחה על המעבר מאוסטאובלסטים לאוסטיאוציטים בוגרים.

Introduction

אוסטיאוציטים הם תאים ממוינים סופניים שמקורם באוסטאובלסטים ^1,2. ברגע שהאוסטאובלסט נקבר על ידי האוסטאואיד, הוא עובר אוסטיאוציטוגנזה ומבטא את הגן Pdpn ליצירת פרה-אוסטיאוציטים, את הגן Dmp1^{כדי להפוך את האוסטיאואיד למינרליזציה, ואת הגנים} Sost ו-Fgf23 לתפקד כאוסטיאוציטים בוגרים ברקמת עצם³. כאן, מערכת תרבית תלת ממדית מוצגת כדי לזהות הרחבת דנדריט וביטוי גנים סמן בתהליך אוסטיאוציטוגנזה.

תאי IDG-SW3 הם קו תאים ראשוני אימורטלי שמקורו בעכברים טרנסגניים ויכולים להרחיב או לשכפל אוסטאובלסטים להתמיינות אוסטיאוציטים מאוחרת כאשר הם מתורבתים במדיות שונות⁴. בהשוואה ל- MLO-A5, MLO-Y4 וקווי תאים אחרים, פרופיל הביטוי של חלבונים פונקציונליים, היכולת לבצע שקיעת מלחי סידן והתגובות להורמונים שונים בתאי IDG-SW3 נוטים יותר להיות זהים לאלה של אוסטיאוציטים ראשוניים ברקמת העצם⁴.

בהשוואה למערכות דו-ממדיות, מערכות תרבית תלת-ממדיות מסוגלות יותר לחקות את סביבת הגידול התאית in vivo, כולל שיפוע חומרי המזון, קשיחות מכנית נמוכה והטווח המכני שמסביב (טבלה 1). רוב השיטות הקודמות לגידול תאים אוסטאובלסטיים במערכת תלת-ממדית השתמשו בקולגן I כמרכיב ייחודי בפורמולציות ^4,5,6, מכיוון שסיבי קולגן I משמשים כאתר של שקיעת סידן וזרחן. עם זאת, מרכיב חיוני באוסטאואיד, המטריצה החוץ תאית, מכיל קבוצה גדולה של גורמים תאיים המקדמים גדילה, הידבקות ונדידה תאית ^7,8 והוא שקוף ונוח לתצפית הדמיה. לפיכך, פרוטוקול זה משתמש במטריג'ל (להלן מטריצת קרום מרתף) כמרכיב משני למחקר אוסטאוציטוגנזה.

Protocol

פרוטוקול זה מתאים לגידול תאים בארבע בארות של לוחות 24 בארות. אם מכינים מספר דגימות או צלחות, יש להגדיל את כמויות הריאגנטים בהתאם.

1. הכנת תערובת קולגן I

הערה: קולגן I וג'ל מטריצת קרום מרתף במהירות בטמפרטורת החדר. לכן, קולגן צריך להיות מטופל על קרח (2 ° C עד 8 ° C). כל הטיפים והצינורות המשמשים חייבים להיות מקוררים אלא אם כן צוין אחרת. כל ההליכים צריכים להתבצע במכסה מנוע.

1. מניחים את כל הריאגנטים וצינורות הצנטריפוגות על קרח.
2. פיפטה איטית 0.48 מ"ל של קולגן I (5 מ"ג/מ"ל) ו-0.1 מ"ל של 10x מדיום חיוני מינימלי (MEM) (עם פנול אדום) לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל השמור על קרח. מערבבים היטב על ידי פיטינג בעדינות למעלה ולמטה.
3. על פי לוח הצבעים של מחוון פנול אדום, השתמש בנפח מתאים של 7.5% (w/v) NaHCO₃ (כ -0.2 מ"ל) כדי להתאים את מחוון אדום פנול לכתום, המציין כי ערך ה- pH הוא בטווח של 7.0-7.4.
   הערה: בהתאם ל- pH של המדיום, נפח של NaHCO₃ משמש כדי להביא את ה- pH ל- 7.0-7.4 בקירוב. בנוסף, NaOH משמש לנטרול pH.
4. הביאו את הנפח הסופי של התערובת עד 1 מ"ל על ידי הוספת נפח מתאים של ddH₂O. ערבבו היטב על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה כדי להתכונן לשימוש.
   הערה: הנפח הסופי של ddH₂O יהיה תלוי בכמות NaHCO 3 או NaOH בשימוש בשלב_1.3 .

2. הכנת תערובת מטריצת התא

1. לאט פיפטה 0.9 מ"ל של מטריצת קרום מרתף לתוך צינור צנטריפוגה חדש 15 מ"ל על הקרח.
2. תרבית את תאי IDG-SW3 בבקבוק T25 עם 4 מ"ל של תווך מלא (אלפא-MEM המכיל 10% סרום בקר עוברי [FBS]) בתוספת 50 U/mL INF-γ ב 33 ° C.
3. ברגע שתאי IDG-SW3 מגיעים למפגש של 90%, הסירו את התווך ושטפו את התאים במי מלח חוצצי פוספט (PBS, pH 7.4 לאורך כל הפרוטוקול) עם פיפטה. לעכל את התאים עם 0.5 מ"ל של 0.25% חומצה טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב 37 ° C במשך 30 שניות.
4. נטרל את הטריפסין על-ידי הוספת 3.5 מ"ל של מדיום מלא (אלפא-MEM המכיל 10% נסיוב בקר עוברי [FBS]). העבר את מתלה התא 4 מ"ל לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
5. סובב את מתלה התא ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של התווך המלא על קרח.
6. ספור את התאים באמצעות המוציטומטר והתאם את צפיפות התאים הסופית עם המדיום המלא ל 4 × 10⁵ תאים / מ"ל. הוסף 0.1 מ"ל של השעיית התא מוכן ל 0.9 מ"ל של המטריצה החוץ תאית משלב 2.1. מערבבים היטב על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה.
   הערה: אם יש צורך בבקרה נטולת תאים, הוסף 0.1 מ"ל של התווך המלא עד 0.9 מ"ל של מטריצה חוץ-תאית כבקרה שלילית.

3. ציפוי תערובת התא-ג'ל

1. בעדינות, מערבבים היטב את שתי התערובות משלב 2.6 ושלב 1.4 עד 2 מ"ל על ידי פיטום למעלה ולמטה על הקרח. פיפטה 0.5 מ"ל של התערובת הסופית לתוך כל באר (ארבע בארות של צלחת 24 בארות). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת ליצירת תערובת ג'ל תאים.
2. הוסף 0.5 מ"ל של תווך אוסטאוגני (מדיום שלם המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית ו-4 מ"מ β-גליצרופוספט, הידוע גם בשם מדיום אינדוקציה אוסטאוגני)⁴ לתערובת התא-ג'ל בכל באר כדי להתחיל את ההתמיינות האוסטאוגנית ב-37°C. חשבו על זה כיום 0.
3. כל יומיים, להחליף חצי בינוני עם תווך אוסטאוגני טרי נשמר ב 37 ° C. המשך את הטיפוח במשך 35 יום.

4. זיהוי כדאיות התא והדנדריטים התאיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

1. צביעת תאים
   הערה: Calcein אצטוקסימתיל אסטר (calcein AM) הוא צבע מתאים שניתן להשתמש בו כדי לקבוע את כדאיות התא. Ethidium homodimer-I (EthD-1) אינו חוצה את הממברנה של תאים שלמים/בני קיימא⁹. לפיכך, calcein AM/EthD-1 יכול לשמש לזיהוי כדאיות התא ודנדריטים תאיים.
   1. ביום הראשון וביום השביעי של התרבית, הוציאו מהמקפיא את תמיסת מלאי הקלצין AM (4 מילימטר ב-DMSO) ואת תמיסת המלאי EthD-1 (2 מילימטר ב-DMSO/H₂O 1:4 [v/v]) ואפשרו להם להתחמם לטמפרטורת החדר.
      הערה: למטריצה המינרלית יש אות אוטופלואורסצנטי חזק, כך ששלב הפראוסטיאוציטים ללא ביטוי Dmp1 תוך 7 ימים מגידול⁴ מתאים יותר לתצפית על צביעת תאים.
   2. הוסף 4 μL של תמיסת מלאי 2 mM EthD-1 ו- 5 μL של תמיסת מלאי 4 mM calcein AM ל- 2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (D-PBS) של Dulbecco, וערבב היטב. זה נותן בערך 2 מיקרומטר calcein AM ו 4 μM EthD-1 כפתרונות עבודה.
   3. פיפטה 0.5 מ"ל של פתרון העבודה לתוך הבארות בצלחת 24 בארות. יש לדגור במשך 30-45 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים את מטריצת הג'ל של התא.
   4. לאחר הדגירה, יש להוסיף כ-0.5 מ"ל של D-PBS טרי לצלחת תרבית חדשה בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית. מכסים את הכלי כדי למנוע זיהום או התייבשות של הדגימות.
   5. בעזרת מלקחיים עם מרפקים, העבירו בזהירות את מטריצת הג'ל התאית המוכתמת משלב 4.1.3 לצלחת התרבית בקוטר 35 מ"מ משלב 4.1.4. הימנע מפגיעה או גזירה של מטריצת הג'ל התאית.
   6. הצג את התאים המסומנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי לייזר.
2. סט סריקה במיקרוסקופ
   1. מניחים את צלחת 35 מ"מ על הבמה. בחר את האזורים של מטריצת ג'ל התא לסריקה דרך העינית באמצעות מטרה של 10x. מטרות הגדלה גבוהות יותר אינן מומלצות בשל גודל הדנדריטים המורחבים.
   2. בחר את המסננים האופטיים. ניתן לראות את הקלצין כירוק עם מסנן פסים פלואורסצאין סטנדרטי, וניתן לראות את EthD-1 כאדום עם מסננים עבור יודיד פרופידיום או צבע אדום טקסס. בחר את "מצב קו" לסריקה ולהגדיר את "חור סיכה" ל 2 מיקרומטר.
   3. בחר עומק נתונים של 8 סיביות ורזולוציית תמונה של 1,024 פיקסלים x 1,024 פיקסלים.
   4. תמונה באמצעות סריקת קו רציף עם הגדרות לייזר וגלאי אופטימליות (שמור על אנרגיית לייזר מינימלית כדי למנוע הלבנה פוטנציאלית).
      הערה: הגדרת הגלאי האופטימלית תלויה באותות הפלואורסצנטיים הסופיים.
3. איסוף "ערימת z" של תמונות
   1. על פי אות הערוץ הירוק, הגדר את המיקומים העליונים והתחתונים של מטריצת ג'ל התא לסריקה על ידי מיקוד דרך הדגימה תוך כדי סריקה רציפה, .
   2. לאחר ציון החלק העליון והתחתון של הדגימה, בחר במסגרת הסריקה הרצויה. התחל לסרוק. המדגם ייסרק מלמעלה למטה עם ההגדרות שנבחרו משלב 4.2, יצירת גלריה של תמונות.
4. זיהוי כדאיות התא.
   1. בחרו פרוסה אחת משלב 4.3. התעלות הירוקות והאדומות מציינות תאים חיים ומתים, בהתאמה.
5. זיהוי דנדריט תאים.
   1. בחר את הערוץ הירוק היחיד כדי ליצור שחזורים תלת-ממדיים באמצעות תוכנת רכישת התמונות. נתוני העומק מוצגים כסדרה של תמונות פסאודו-צבעוניות בצבעי הקשת. הדנדריטים הממוקמים בתחתית הג'ל מוצגים באדום, ואילו אלה בחלק העליון מוצגים בכחול.

5. זיהוי המראה באמצעות סטריאומיקרוסקופ

1. ביום 1, יום 7, יום 21 ויום 35 של התרבית, הסירו את מדיום הגידול, ושטפו את הג'לים בצלחת פעמיים עם D-PBS. הוסף 0.5 מ"ל של 4% (v/v) paraformaldehyde ב- D-PBS לבאר כדי לקבע את מטריצת התא ג'ל בצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. מוציאים את הפרפורמלדהיד בבאר ושוטפים את מטריצת ג'ל התא פעמיים נוספות עם D-PBS בצלחת. השאר 0.5 מ"ל של D-PBS בכל באר להדמיה.
3. הניחו את הצלחת על הבמה ובחרו את המיקום האופטימלי דרך העינית באמצעות מטרה של 0.5x. דמיינו את תצוגת השדה המלא של מטריצת ג'ל התא בלוח בנפרד באמצעות "חשיפה אוטומטית" מתחת לשדה הבהיר.

6. זיהוי שקיעת מינרלים באמצעות בדיקת XRF

1. ביום ה-35 של התרבית, בדקו אם החנקן הנוזלי מספיק. הפעל את מערכת XRF. פתח את חדר הדגימה והעבר את הג'לים עם מלקחיים עם מרפק מהצלחת לאמצע שלב הדגימה של המכשיר. סגור את חדר הדגימה והמתן 30 דקות כדי לאפשר למכשיר להתקרר לפני השימוש.
2. הגדר את "זמן החשיפה" ל- 35 אלפיות השנייה, את "טווח הספקטרום" ל- 0-40 keV, ואת "הזרם החשמלי" ל- 770 μA להגדרת רכישה.
3. בחר שלושה עד חמישה אתרי סריקה לניתוח על-ידי הזזת שלב הדגימה.
4. בחר את הרכיבים (Ca ו - P) לזיהוי. התחל את הזיהוי וייצא את התוצאות.
   הערה: Ca ו-P הם היסודות הנפוצים ביותר בהידרוקסיאפטיט.

7. זיהוי ביטוי גנים פונקציונלי

1. ביום 1, יום 7, יום 21, יום 28 ויום 35 של התרבית, הסירו את מדיום הגידול ושטפו את מטריצת הג'ל התאית פעמיים עם D-PBS קר כקרח בצלחת.
2. מעבירים את הג'לים עם מלקחיים עם מרפק מהצלחת לצינור של 2.0 מ"ל (בהתאם לזמן התרבית, מטריצת הג'ל התאית תתכווץ בהדרגה לכ-0.1 מ"ל ביום ה-35). ודא שג'ל אחד מונח בצינור אחד. הוסף 1 מ"ל של פנול-כלורופורם ושני חרוזי מכות סטריליים מפלדת אל-חלד (4 מ"מ, כמטריצה שוכבת) לכל צינור. הניחו את הצינורות באופן סימטרי בחריץ הדגימה המצונן מראש של ההומוגנייזר המכאני.
3. הגדר את הפעימות לתדר של 55 הרץ ומשרעת של 1 ס"מ בכל דקה של פעימה מכנית עם הפסקה של 10 שניות, עם שישה מחזורים בסך הכל. התחילו את מכות החרוזים.
4. חלץ את הרנ"א הכולל ממטריצת ג'ל התא בשיטת פנול-כלורופורם-איזואמילאכהול. תעתיק לאחור של 2 מיקרוגרם מסך הרנ"א ל-cDNA עם פריימרים אקראיים של הקסמר.
5. תכננו פריימרים המיועדים ל-β-actin, Pdpn, Dmp1, Sost ו-Fgf23 ל-PCR בזמן אמת (טבלה 2). β-Actin הוא גן משק הבית המשמש לנורמליזציה. הגנים Pdpn¹⁰ ו-Dmp1 11 מתבטאים בעיקר בקדם-אוסטיאוציטים ובאוסטיאוציטים מינרליים, בעוד ש-Sost¹² ו-Fgf23¹³ מתבטאים בעיקר באוסטיאוציטים בוגרים.
6. הניחו את הצינור על thermocycler כאשר המכסה המחומם מכוון ל-105°C ובצעו הגברה של PCR באמצעות הגדרות מחזור ה-PCR הבאות: 95°C עבור 5 שניות ו-60°C למשך 30 שניות למשך 35 מחזורים עם שלב דנטורציה ראשוני ב-95°C למשך 5 דקות ושלב הארכה אחרון ב-60°C למשך 30 שניות. נתח את שינויי הקיפול בשיטת ΔΔCt.

תוצאות

לאחר צביעת תאים חיים/מתים, התאים הודגמו באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. כל התאים היו קלצין AM-חיובי (צבע ירוק), וכמעט ולא היו תאים חיוביים ל-EthD-1 (צבע אדום) בשדה, מה שמצביע על כך שמערכת הג'ל המיוצרת בשיטה זו מתאימה מאוד לאוסטאוציטוגנזה (איור 1A, משמאל). כדי לקבוע טוב יותר את ההתפ...

Discussion

נקודה קריטית בפרוטוקול זה היא שיש לבצע את שלבים 1 ו-2 על קרח כדי למנוע קרישה ספונטנית. בשיטה זו, הריכוז הסופי של קולגן I היה 1.2 מ"ג/מ"ל. לפיכך, יש לחשב נפח אופטימלי של ddH₂O כך שיתאים לקולגן השונים של יצרנים שונים.

In vivo, אוסטאוציטוגנזה כוללת תנועה קוטבית של אוסטאובלסטים מפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422