Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة للتمييز بين hiPSCs إلى مجموعات مجال العين وتوليد عضويات عصبية شبكية باستخدام ظروف ثقافة مبسطة تتضمن أنظمة ثقافة ملتصقة ومعلقة. يمكن أيضا عزل أنواع خلايا العين الأخرى ، مثل RPE وظهارة القرنية ، من حقول العين الناضجة في مزارع الشبكية.

Abstract

يمكن للخلايا الجذعية متعددة القدرات أن تولد عضويات أنسجة معقدة مفيدة لدراسات نمذجة الأمراض في المختبر ولتطوير علاجات تجديدية. يصف هذا البروتوكول طريقة أبسط وقوية وتدريجية لتوليد عضويات شبكية العين في نظام مزرعة هجين يتكون من ثقافات أحادية الطبقة ملتصقة خلال أول 4 أسابيع من تمايز الشبكية حتى ظهور مجموعات أولية متميزة ومنظمة ذاتيا لمجال العين (EFPs). علاوة على ذلك ، يتم اختيار الجزر العصبية الشبكية الدائرية والشفافة على شكل دونات داخل كل EFP يدويا واستزراعها تحت التعليق باستخدام أطباق استزراع غير ملتصقة في وسط تمايز الشبكية لمدة 1-2 أسابيع لتوليد أكواب بصرية ثلاثية الأبعاد متعددة الطبقات (OC-1M). تحتوي هذه الكائنات العضوية غير الناضجة في شبكية العين على سلائف شبكية متعددة القدرات تتكاثر PAX6+ و ChX10 +. يتم تجميع خلايا السلائف خطيا ذاتيا داخل الكائنات العضوية وتظهر على شكل تشققات شعاعية متميزة. في 4 أسابيع بعد زراعة التعليق ، يخضع أسلاف الشبكية للتوقف بعد الانقسام وتمايز النسب لتشكيل عضويات شبكية ناضجة (OC-2M). تتطور السلائف الملتزم بها من سلالة المستقبلات الضوئية داخل الطبقات الخارجية من عضويات الشبكية. تنضج خلايا مستقبلات الضوء CRX + و RCVRN + هذه شكليا لعرض امتدادات تشبه الجزء الداخلي. يمكن اعتماد هذه الطريقة لتوليد عضويات شبكية العين باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). يتم شرح جميع الخطوات والإجراءات بوضوح وإثباتها لضمان إمكانية التكرار وللتطبيقات الأوسع في العلوم الأساسية والبحوث الانتقالية.

Introduction

شبكية العين هي نسيج حساس للضوء موجود في الجزء الخلفي من عين الفقاريات يحول إشارات الضوء إلى نبضات عصبية من خلال ظاهرة كيميائية حيوية تعرف باسم مسار نقل الضوء. يتم نقل النبضات العصبية الأولية المتولدة في الخلايا المستقبلة للضوء في شبكية العين إلى الخلايا العصبية الشبكية الأخرى وخلايا العقدة الشبكية (RGCs) وتصل إلى القشرة البصرية للدماغ ، مما يساعد في إدراك الصورة والاستجابة البصرية.

وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) ، يقدر أن 1.5 مليون طفل مصابون بالعمى ، منهم مليون طفل في آسيا. ضمور الشبكية الوراثي (IRD) هو مرض رئيسي يسبب العمى يصيب 1 من كل 4000 فرد في جميع أنحاء العالم 1،2،3 ، في حين أن انتشار العمى المرتبط بالضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) يتراوح بين 0.6٪ -1.1٪ في البلدان النامية4. تحدث IRDs بسبب عيوب وراثية موروثة في أكثر من 300 جين مختلف يشارك في نمو الشبكية ووظيفتها5. تؤدي هذه التغيرات الجينية إلى تعطيل وظائف الشبكية الطبيعية والتنكس التدريجي لخلايا الشبكية ، وهي الخلايا المستقبلة للضوء وظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) ، مما يؤدي إلى فقدان البصر الشديد والعمى. تم إحراز تقدم هائل في حالات العمى الأخرى التي تشمل القرنية والعدسة وما إلى ذلك. ومع ذلك ، فإن ضمور الشبكية وضمور العصب البصري ليس لديهم أي علاج مثبت حتى الآن. نظرا لأن شبكية العين البشرية البالغة لا تحتوي على خلايا جذعية6 ، فإن المصادر البديلة مثل الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من المريض (iPSCs) يمكن أن توفر إمدادات غير محدودة من أنواع الخلايا المرغوبة وتحمل وعدا كبيرا لتطوير عضويات الأنسجة المعقدة المطلوبة لدراسات نمذجة الأمراض في المختبر ولتطوير العلاجات التجديدية7 ، 8,9,10.

أدت عدة سنوات من أبحاث الشبكية إلى فهم أفضل للأحداث الجزيئية التي تنظم تطور الشبكية المبكر. تهدف معظم البروتوكولات لتوليد خلايا شبكية العين وعضويات 3D من PSCs إلى تلخيص هذه الأحداث التنموية في المختبر ، عن طريق زراعة الخلايا في مزيج معقد من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتعديل العمليات البيولوجية المعروفة بطريقة تدريجية. تتكون عضويات الشبكية المتولدة على هذا النحو من خلايا الشبكية الرئيسية: خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، والخلايا العصبية البينية ، والمستقبلات الضوئية ، وظهارة الشبكية المصطبغة (RPE)11،12،13،14،15،16،17،18،19. على الرغم من المحاولات الناجحة لنمذجة IRDs باستخدام عضويات الشبكية ، فإن متطلبات المزيج المعقد من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة أثناء التمايز والكفاءة المنخفضة نسبيا لتوليد عضويات الشبكية تشكل تحديا كبيرا مع معظم البروتوكولات. وهي تشمل بشكل رئيسي تكوين الأجسام الجنينية ، يليها تمايزها التدريجي إلى سلالات شبكية باستخدام ظروف الثقافة المعقدة في مراحل مختلفة من التطور في المختبر 20،21،22.

هنا ، تم الإبلاغ عن طريقة مبسطة وقوية لتطوير عضويات شبكية العين العصبية 3D المعقدة من التحكم الصحي و hiPSCs الخاصة بأمراض الشبكية. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا التمايز المباشر لثقافات hiPSC شبه المتقاربة دون الحاجة إلى تكوين جسم جنيني. أيضا ، يتم تبسيط تعقيد وسيط الاستزراع ، مما يجعله تقنية فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكرار يمكن اعتمادها بسهولة من قبل الباحثين الجدد. وهو ينطوي على نظام ثقافة هجين يتكون من ثقافات أحادية الطبقة ملتصقة خلال الأسابيع ال 4 الأولى من تمايز الشبكية حتى ظهور مجموعات أولية متميزة ومنظمة ذاتيا لمجال العين (EFPs). علاوة على ذلك ، يتم اختيار الجزر العصبية الشبكية الدائرية داخل كل EFP يدويا وزراعتها في مزارع معلقة لمدة 1-2 أسابيع لإعداد أكواب شبكية ثلاثية الأبعاد متعددة الطبقات أو عضويات تتكون من سلائف الشبكية العصبية الشبكية المتكاثرة PAX6 + و CHX10 +. أدت الزراعة الممتدة لعضويات الشبكية في وسط يحتوي على 100 ميكرومتر من التورين لمدة 4 أسابيع أخرى إلى ظهور سلائف مستقبلات الضوء RCVRN + و CRX + والخلايا الناضجة ذات امتدادات بدائية تشبه الجزء الداخلي.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب التي تنطوي على hiPSCs بشكل معقم ، وفقا للممارسات المختبرية القياسية ، والمبادئ التوجيهية الأخلاقية والسلامة البيولوجية ، وبموافقات الهيئات التنظيمية مثل لجنة الأخلاقيات المؤسسية (IEC) ، واللجنة المؤسسية لأبحاث الخلايا الجذعية (IC-SCR) ، ولجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBSC).

1. تحضير مستنبتة iPSC ووسط تمايز الشبكية والكواشف

  1. ثقافة iPSC ووسط الصيانة
    1. استزراع والحفاظ على خط hiPSC العادي23 (hiPSC-F2-3F1) وخط RB1-/- hiPSC المحرر بتقنية كريسبر (LVIP15-RB1-CS3 ، مع حذف ثنائي الإطار لإزاحة الإطار بمقدار 10 نقاط أساس داخل exon 18 لجين RB1 البشري) في وسط Essential 8 على ألواح الاستزراع المغلفة ب matrigel (مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة ؛ انظر جدول المواد) تحت ظروف الاستزراع الخالية من التغذية.
      ملاحظة: يمكن جعل هذا البروتوكول خاليا تماما من xeno عن طريق استبدال مصفوفة الغشاء القاعدي بطلاء vitronectin المؤتلف (VTN-N). قم بإعداد وسيط Essential 8 الكامل عن طريق إضافة مكمل 50x Essential 8 (مرفق مع مجموعة Essential 8 المتوسطة ؛ انظر جدول المواد) و 100 U / mL من محاليل البنسلين والستربتومايسين. بالتناوب ، يمكن أيضا استزراع hiPSCs باستخدام وسيط mTeSR1 الكامل.
  2. حل تفكك الخلايا (1x CDS)
    1. من أجل تفكك خال من الإنزيمات وتمرير iPSCs البشرية ، قم بإعداد CDS التي تحتوي على 0.5 mM EDTA و pH 8.0 و 30 mM NaCl في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) (انظر جدول المواد).
    2. لتحضير 100 مل من 1x CDS ، أضف 100 ميكرولتر من 0.5M EDTA و 1 مل من 3 M NaCl محاليل الأسهم إلى 99 مل من 1x DPBS ، واخلطها جيدا ، وقم بتعقيمها باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
  3. وسيط تحريض التمايز (DIM)
    1. تحضير DIM باستخدام الوسط القاعدي DMEM-F12 المكمل باستبدال مصل الضربة القاضية بنسبة 10٪ (KOSR) ، 1x حمض أميني غير أساسي (NEAA) ، 2 مللي متر جلوتا ماكس ، 100 وحدة / مل بنسلين-ستربتومايسين ، 200 ميكرومتر حمض الأسكوربيك ، ومكمل N2 1٪ (انظر جدول المواد).
  4. وسط تمايز الشبكية (RDM)
    1. قم بإعداد RDM باستخدام وسط DMEM-F12 القاعدي المكمل بمصل خروج المغلوب بنسبة 10٪ (KOSR) ، 1x حمض أميني غير أساسي (NEAA) ، 2 mM GlutaMax ، 100 U / mL Penicillin-Streptomycin ، 200 μM حمض L-Ascorbic ، و 2٪ مكمل B27 (مع فيتامين A) (انظر جدول المواد).
  5. أسطح زراعة الخلايا المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية
    1. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي المؤهلة ل hESC طوال الليل في دلو ثلج ، ويفضل أن يكون ذلك داخل الثلاجة عند 4-8 درجات مئوية. قم بتخفيف مخزون المصفوفة المذاب 100x (5 مل) بنسبة 1: 5 عن طريق إضافة 20 مل من الوسط القاعدي DMEM-F12 المثلج البارد واخلطه عن طريق الدوران اللطيف لتحضير محلول مخزون 20x.
      1. قم بإعداد 0.5 مل من القسامات على الثلج باستخدام أطراف ماصة مبردة مسبقا وأنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة. قم بتسمية القوارير على أنها مخزون 20x وقم بتخزينها مجمدة في فريزر -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. لطلاء أسطح زراعة الخلايا (أطباق الاستزراع أو أطباق 6 آبار) ، قم بإذابة حصة من مصفوفة 20x على الجليد وقم بتخفيفها بنسبة 1:20 باستخدام وسط قاعدي DMEM-F12 بارد لتحضير 10 مل من محلول طلاء مصفوفة 1x ، وهو ما يكفي لطلاء طبق 100 مم أو لوحة 6 آبار (1.5 مل / بئر).
      ملاحظة: قم بتبريد الماصات / الأطراف الدقيقة مسبقا عن طريق شفط DPBS المثلج والمعقم قبل التعامل مع محلول المصفوفة. يجب أن يتم الذوبان وجميع عمليات معالجة المصفوفة على الجليد ، باستخدام ماصات / أطراف دقيقة مبردة مسبقا لتجنب البلمرة والتبلور في درجات حرارة الغرفة.
    3. أضف 1.5 مل من محلول طلاء مصفوفة 1x إلى كل بئر من لوحة 6 آبار ، وقم بتدوير اللوحة برفق لضمان طلاء متساو ، واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪. اترك الألواح دون إزعاج لمدة لا تقل عن 1 ساعة لضمان طلاء موحد للمصفوفة على أسطح الاستزراع.
    4. قبل بذر الخلايا ، قم بشفط محلول الطلاء باستخدام ماصة معقمة سعة 5 مل وتخلص من النفايات السائلة. أضف وسط استزراع طازج على الفور (2 مل / بئر من صفيحة 6 آبار) وقم بزرع الخلايا بكثافة 150000-200000 خلية / بئر. لا تدع الألواح تجف أثناء المناولة.
      ملاحظة: بالتناوب ، يمكن استخدام طلاء الفيترونيكتين المؤتلف (VTN-N) بتركيز نهائي قدره 0.5 ميكروغرام / مل لبروتوكول استزراع خال من الأجانب.

2. إنشاء ثقافات iPSC البشرية

  1. ذوبان وإحياء hiPSCs
    1. قم بتغطية بئر واحد من لوحة 6 آبار بمحلول مصفوفة غشاء 1x. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح بالبلمرة والطلاء الموحد لسطح الاستزراع.
    2. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء وإضافة 1 مل من الوسط الأساسي 8 الكامل المسخن مسبقا الذي يحتوي على 10 ميكرومتر من مثبط Rho-kinase ، Y-27632 (1 ميكرولتر / مل من مخزون 10 mM ؛ انظر جدول المواد) ، قبل إحياء الخلايا.
    3. قم بإزالة مخزون التبريد hiPSC (1 × 106 خلايا / قارورة) من حاوية النيتروجين السائل. قم بإذابة الجليد بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف.
      ملاحظة: لا تذوب القارورة تماما. قم بتدوين رقم المقطع ، وقم بتعقيم القارورة على السطح ، وامسحها حتى تجف باستخدام مسحة خالية من النسالة تحتوي على 70٪ من كحول الأيزوبروبيل.
    4. باستخدام طرف ماصة معقم سعة 1 مل ، قم بشفط محتويات cryovial في أنبوب جديد سعة 15 مل يتكون من 2 مل من وسيط Essential 8 الكامل المسخن مسبقا بدون Y-27632. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 1000 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية.
    5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1.0 مل من الوسط الأساسي 8 الكامل الذي يحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632.
    6. أضف تعليق الخلية هذا على الأسطح المطلية بالمصفوفة دون إزعاج المصفوفة عن طريق توزيعها على طول الجدران. هز اللوحة برفق بالعرض لضمان التوزيع المتساوي للخلايا.
    7. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ للسماح للخلايا بالالتصاق والبدء في التكاثر.
    8. بعد 12-24 ساعة ، استبدل الوسط المستهلك وحافظ على الثقافات في وسط أساسي 8 كامل التسخين بدون Y-27632.
    9. قم بتغيير وسط الثقافة كل 24 ساعة ومرور الثقافات بمجرد وصولها إلى التقاء 70٪ -80٪.
      ملاحظة: يتم اتباع نسبة تقسيم 1: 6 بشكل روتيني لثقافات hiPSC ويتم تمريرها على فترات منتظمة من 3-4 أيام.
  2. تمرير وطلاء hiPSCs لبدء تمايز نسب الشبكية
    1. استنشاق الوسط المستهلك من 70٪ -80٪ من ثقافات iPSC البشرية المتقاربة في ألواح ذات 6 آبار.
    2. أضف 1 مل من CDS (الخطوة 1.2) إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق حتى تتقارب الخلايا. قم بإزالة CDS بعناية ، مع الحرص على عدم فصل الخلايا ، وإضافة 2 مل من وسط Essential 8 الطازج وسحنه برفق باستخدام ماصة.
    3. اجمع تعليق الخلية من بئر واحد من لوحة مكونة من 6 خلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وقم بتدوير الأنبوب عند 1000 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية.
    4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1.2 مل من الوسط الأساسي 8 وقم بتوزيع 200 ميكرولتر من الخلية 200 ميكرولتر من معلق الخلية (نسبة الانقسام 1: 6) في كل بئر من صفيحة 6 آبار مغلفة بالمصفوفة تحتوي على 1.5 مل من وسط استزراع iPSC يحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 ، كما هو موضح في الخطوة 1.5.
    5. بعد 12-24 ساعة ، استبدل الوسط المستهلك وحافظ على الثقافات في وسط أساسي 8 كامل التسخين بدون Y-27632.
    6. قم بتغيير وسط الثقافة كل 24 ساعة حتى تصل الثقافات إلى التقاء 70٪ -80٪.

3. تمايز hiPSCs في مجالات العين ونسب الشبكية

ملاحظة: يظهر مخطط تخطيطي لعملية التمايز في الشكل 1.

  1. ابدأ إجراء التمايز بمجرد أن تصل ثقافات hiPSC إلى التقاء 70٪ -80٪.
  2. في اليوم 0 ، قم بتغيير وسيط صيانة hiPSC إلى DIM (الخطوة 1.3) التي تحتوي على 1 نانوغرام / مل bFGF و 1 نانوغرام / مل Noggin. أضف 2.0 مل من الوسط لكل بئر من صفيحة 6 آبار وحافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    ملاحظة: يؤدي الانسحاب التدريجي ل bFGF إلى تمايز PSCs ، وإضافة تركيزات متزايدة من Noggin (مثبط للعديد من BMPs) خلال المراحل الأولية يؤدي إلى تمايز نسب الأديم الظاهر والعصبية11،12 ويمنع التزام الأديم المتوسط والأديم الباطن. بدلا من ذلك ، يمكن استبدال Noggin ب LDN193189. على عكس استراتيجية تثبيط SMAD المزدوجة التي تم الإبلاغ عنها سابقا20,21 ، لا يتطلب هذا البروتوكول إضافة Activin أو SB-431542.
  3. في اليوم الأول ، قم بتغيير الوسيط المستهلك وإضافة DIM الذي يحتوي على 1 نانوغرام / مل bFGF و 10 نانوغرام / مل Noggin. أضف 2.0 مل لكل بئر من لوحة 6 آبار. احتضان الخلايا والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
  4. في اليوم 2-3 ، قم بإزالة الوسيط المستهلك وإضافة DIM الذي يحتوي على 10 نانوغرام / مل فقط Noggin. أضف 2.0 مل لكل بئر من لوحة 6 آبار وقم بتغيير الوسط كل 24 ساعة. احتضان الخلايا والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    ملاحظة: قم دائما بتسخين وسط الاستزراع مسبقا إلى 30-37 درجة مئوية قبل الاستخدام. يمكن ملاحظة العوائم الزائدة والخلايا الميتة في مزارع التمايز المبكرة. في ظل هذه الظروف ، اغسل الثقافات مرة واحدة باستخدام 1x DPBS وأضف وسط تمايز الشبكية. يمكن إجراء اختبارات العقم على الوسط المستهلك أسبوعيا أو حسب الحاجة.
  5. في اليوم الرابع ، قم بإزالة الوسيط المستهلك وإضافة RDM (الخطوة 1.4). أضف 2.0 مل لكل بئر من صفيحة 6 آبار واستمر في الحفاظ على الثقافات في RDM عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ ، مع تغيير متوسط جديد كل يوم.
    ملاحظة: بالتناوب ، يمكن زراعة PSCs كمزارع معلقة من اليوم 1-3 ، في صفائح 96 بئرا غير ملتصقة ومستديرة القاع ، بكثافة خلية تبلغ 5 × 103 خلايا / 100 ميكرولتر / بئر لتشكيل أجسام جنينية (EBs) في ظل ظروف استزراع مماثلة في DIM. يمكن طلاء EBs جيدة التكوين في اليوم 4 على ألواح مغلفة بالمصفوفة تحتوي على RDM ويسمح لها بالالتصاق ، تتكاثر ، وتميز كما هو موضح أدناه.
  6. في حوالي اليوم 14-18 ، راقب الثقافات تحت المجهر عند تكبير 10x لظهور مجالات شبيهة بالوردة العصبية تتكون من أسلاف مجال العين المبكر (الشكل 2 ب).
  7. في حوالي اليوم 21-28 (3-4 أسابيع) ، راقب الثقافات تحت المجهر عند تكبير 4x و 10x لمراقبة ظهور EFPs ذاتية التنظيم ومتميزة ، مع جزيرة مركزية من الهياكل العصبية الشبكية ثلاثية الأبعاد الدائرية المحاطة بنواتج متجاورة من ظهارة عصبية وظهارة سطح العين (الشكل 2C ، D).
    ملاحظة: يمكن ملاحظة حوالي 20-30 عبوة ناسفة مفخخة لكل بئر من صفيحة 6 آبار من ثقافة تمايز الشبكية hiPSC الطبيعية. يمكن أن يختلف هذا الرقم مع خطوط hiPSC الأخرى الخاصة بالمرض ، بناء على خلفيتها الجينية وإمكانية تمايز نسب الشبكية.

4. حصاد عضويات الشبكية

  1. سحب اللهب من ماصات باستور الزجاجية للقطف اليدوي لأكواب الشبكية.
    ملاحظة: استخدم ماصات باستور الزجاجية المعقمة والمعقمة لاختيار مجال العين.
    1. قم بتشغيل موقد بنسن. خذ ماصة باستور معقمة وأمسك القاعدة بيد واحدة والطرف الشعري في اليد الأخرى. تعقيم اللهب وتسخين المنطقة بالقرب من منتصف الطرف الشعري ، مع حركات دورانية حتى يصبح الزجاج مرنا. ثم ابتعد عن اللهب واسحب للخارج بسرعة لإنشاء طرف شعري ناعم مع تجويف مغلق.
    2. أمسك الطرف الرفيع أفقيا أمام اللهب وقم بتمريره بسرعة عبر اللهب بحركة خارجية لإنشاء خطاف أملس أو طرف شعري على شكل حرف L.
    3. استخدم منطقة الانحناء الخارجي الأملس للخطاف الشعري كمغرفة دقيقة لرفع وفصل أكواب الشبكية العصبية السليمة برفق عن مجموعات EFP.
      ملاحظة: لا تتسبب الزاوية الملساء للخطاف الشعري الزجاجي في تلف الخلايا ولا تخلق خدوشا على أسطح الثقافة. يمكن أيضا استخدام هذه الأداة البسيطة بشكل فعال لتقسيم مستعمرة hiPSC الفردية في أنماط الشبكة ولتمريرها كمجموعات خلايا صغيرة أثناء التوسع النسيلي.
  2. ثقافة وصيانة أكواب الشبكية لتوليد عضويات الشبكية 3D.
    1. في اليوم 25-30 ، أضف 4.0 مل من وسط تمايز الشبكية المسخن مسبقا في طبق منخفض التعلق 60 مم قبل التحضير لحصاد أكواب الشبكية العصبية.
    2. اعمل تحت مجهر ستيريو عند تكبير 0.63x-4.5x لمراقبة واختيار أكواب الشبكية العصبية جيدة التكوين يدويا من EFPs الفردية.
      ملاحظة: يساعد ظهور نتوءات خلايا RPE المصطبغة في التعرف بسهولة على العبوات الناسفة الخارقة والأكواب العصبية الشبكية الموضوعة مركزيا. تظهر أكواب الشبكية على شكل دونات ، دائرية ، وهياكل 3D شفافة ، مع تشققات شعاعية واضحة ، تتكون من الخلايا الجذعية الشبكية المرتبة خطيا والمجمعة ذاتيا ، على عكس المجموعات المعبأة بإحكام والكروية أو غير المنتظمة التي تشكلها الخلايا العصبية للجهاز العصبي المركزي أو خلايا القمة العصبية23.
    3. استخدم خطافات ماصة المراعي التي يتم سحبها باللهب لدفع الجزيرة العصبية الشبكية المركزية وإخراجها برفق داخل العبوات الناسفة الخارقة الفردية.
    4. اضبط ماصة صغيرة سعة 1 مل لشفط 100 ميكرولتر واستخدم 1 مل ميكروتيبس مع فتحات واسعة التجويف لشفط ونقل أكواب الشبكية العائمة إلى أطباق الثقافة الطازجة منخفضة الالتصاق المعدة في الخطوة 4.2.1.
      ملاحظة: قد يؤدي استخدام أطراف ذات حجم تجويف أصغر وضغط شفط أعلى إلى القص ويؤثر على سلامة أكواب الشبكية. يبلغ قطر الأبعاد التقريبية لأكواب الشبكية حوالي 1-2 مم.
    5. الحفاظ على أكواب الشبكية في RDM كمزارع تعليق غير ملتصقة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    6. اليوم 30-45: قم بتغيير الوسط يوميا عن طريق إمالة الطبق برفق والسماح لأكواب الشبكية بالاستقرار لمدة 30 ثانية تقريبا. اتبع طريقة التغذية الجزئية ، وإزالة نصف كميات من الوسط المستهلك واستبدالها بكميات متساوية من الوسط الطازج.
      ملاحظة: تجنب الشفط المتكرر والتحويلات لمنع أي ضرر لأكواب الشبكية. بعد 1-2 أسابيع من ثقافة التعليق ، تنمو أكواب الشبكية قليلا في الحجم (1-3 مم) وتتطور إلى عضويات شبكية ثلاثية الأبعاد ذاتية التنظيم (OC-1M) تتكون من أسلاف شبكية عصبية مبكرة مرتبة خطيا تعبر عن PAX6 و CHX10 (الشكل 3Bi).
    7. اليوم 45-60: استزراع عضويات الشبكية لمدة 4 أسابيع أخرى في RDM تحتوي على 100 ميكرومتر توراين (انظر جدول المواد) لدعم بقاء أفضل وتمايز النسب لأسلاف الشبكية العصبية وتطوير نوع خلايا الشبكية الناضجة (OC-2M).
      ملاحظة: حوالي 70٪ -80٪ من أكواب الشبكية أو البصرية التي تم التقاطها من EFPs تظل سليمة ، وتحتفظ بتصفيحها ، وتتطور إلى عضويات شبكية ناضجة بعد 4 أسابيع من زراعة التعليق (OC-2M).
    8. تأكد من أن عضويات الشبكية الناضجة في 4 أسابيع من ثقافة التعليق تظهر ظهور سلائف مستقبلات الضوء RCVRN + و CRX + والخلايا الناضجة ذات امتداد بدائي يشبه الجزء الداخلي في طبقات الخلايا الخارجية ، وبالتالي تلخيص نمو الشبكية الطبيعي وعملية النضج في المختبر (الشكل 3Bii).
      ملاحظة: بعد إزالة الكؤوس العصبية الشبكية ، يمكن الحفاظ على ثقافات التمايز بشكل مستمر في RDM. تحتوي النتوءات الظهارية القريبة المحيطة بالشبكية العصبية على سلائف الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية (RPE) ، والتي تتوسع وتنضج بشكل أكبر لتشكيل طبقات أحادية RPE مصطبغة مع مورفولوجيا حصوية نموذجية (الشكل 4). تتكون النتوءات البعيدة في الغالب من ظهارة سطح العين التي تساهم في العدسةوظهارة القرنية.يمكن حصاد أنواع الخلايا المرغوبة من مناطق مختلفة من نواتج العبوات الناسفة الخارقة وإثرائها بشكل أكبر لإنشاء مزارع نقية.

5. توصيف عضويات الشبكية

  1. التوصيف المورفولوجي والجزيئي
    1. راقب العبوات الناسفة الخارقة الملتصقة وعضويات الشبكية العائمة تحت مجهر تباين الطور عند تكبير 4x و 10x وتوثيق مورفولوجيتها وأبعادها.
    2. اجمع حوالي 20 عضويا في شبكية العين في مراحل مختلفة من النضج (الخطوات 4.2.3-4.2.6) في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل باستخدام أطراف عريضة التجويف 1000 ميكرولتر. دع المواد العضوية تستقر في القاع وتستنشق الوسط. اغسل الكؤوس باستخدام 1x PBS.
    3. قم بإزالة PBS الزائد وأضف 1.0 مل من كاشف TRIzol (انظر جدول المواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تجانس الأنسجة باستخدام مدقة أنبوبية وسحنها باستخدام ماصة سعة 1.0 مل.
    4. قم بإعداد إجمالي الحمض النووي الريبي باتباع طريقة الكاشف القياسية لعزل الحمض النووي الريبي وتنقيته ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    5. تحقق من جودة الحمض النووي الريبي على هلام الأغاروز وقم بتحديده باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop (انظر جدول المواد).
    6. قم بتحويل 1-2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى cDNA باستخدام إنزيم النسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بالبادئات الخاصة بالجينات.
    7. باختصار ، قم بإعداد المزيج الرئيسي للحمض النووي الريبي التمهيدي في 10 ميكرولتر من الحجم الكلي كما هو مذكور في الجدول 2 واحتضان الأنبوب عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في دورة حرارية. انقل الأنبوب من جهاز التدوير الحراري إلى الثلج لمدة 2 دقيقة.
    8. في هذه الأثناء ، قم بإعداد المزيج الرئيسي 2 مع الكواشف المذكورة في الجدول 3. أضف هذا المزيج الرئيسي إلى أنبوب مزيج RNA-primer المحضر في الخطوة 5.1.7. تخلط بلطف.
    9. احتضان العينة عند 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ، ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم امسكها عند 4 درجات مئوية لإيقاف التفاعل.
    10. استخدم cDNA المركب كقالب في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحقق من التعبير عن السلف العصبي الشبكي وعلامات خلايا الشبكية الناضجة.
    11. تطبيع قوالب cDNA الإجمالية لكل عينة ، وهي F2-UD (hiPSC-F2-3F1 ؛ خلايا غير متمايزة) ، OC-1M (كوب بصري عمره أسبوع واحد في ثقافة التعليق) ، و OC-2M (كوب بصري عمره 4 أسابيع في ثقافة التعليق) عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي باستخدام جينات التدبير المنزلي مثل hE1fα أو GAPDH.
    12. قم بإعداد المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي ، كما هو مذكور في الجدول 4 ، وضع أنابيب عينة الاختبار للتضخيم في دورة حرارية. شروط تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل مذكورة في الجدول 5.
  2. علم الأنسجة والكيمياء المناعية
    1. اجمع الأكواب البصرية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل واشطب الوسط الزائد (الخطوات 4.2.3-4.2.6). شطف المواد العضوية مع 1x PBS ثم غسلها وتعليقها في 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لتثبيتها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
    2. في اليوم التالي ، اغسل الكؤوس في ماء منزوع الأيونات. اترك الأكواب تحتوي على 95٪ كحول (ثلاثة تغييرات ، 15-20 دقيقة لكل منها) ، متبوعة بالكحول بنسبة 100٪ (ثلاثة تغييرات ، 15-20 دقيقة لكل منها) ، مزيج 1: 1 من الكحول المطلق والزيلين لمدة 15 دقيقة ، الزيلين (تغييران ، 15 دقيقة لكل منهما) ، والبارافين (ثلاثة تغييرات ، 15 دقيقة لكل منهما). قم بتضمين هذا النسيج لتحضير كتلة البارافين باتباع الإجراءات القياسية. دعها تبرد وتصلب.
    3. قم بإعداد مقاطع رقيقة (~ سمك 4-5 ميكرومتر) باستخدام ميكروتوم ووضعها على شرائح مجهرية مغلفة بالسيلان (انظر جدول المواد) باتباع إجراءات الأنسجة القياسية.
    4. لإزالة البارافين ، سخني الشرائح على حرارة 70 درجة مئوية على كتلة تسخين لمدة 15-20 دقيقة. بمجرد ذوبان الشمع ، اغسل الشرائح بالزيلين (ثلاثة تغييرات ، 3-4 دقائق لكل منها) ، والتي ستزيل البارافين تماما.
      ملاحظة: تؤدي الإزالة غير الكاملة للبارافين إلى تلطيخ ضعيف / غير مكتمل للأقسام مع كمية هائلة من ضوضاء الخلفية.
    5. أعد ترطيب الشرائح باستخدام نسب مختلفة من الإيثانول (100٪ و 90٪ و 80٪) لمدة 3 دقائق لكل منها. شطف الشرائح بالماء المقطر والمضي قدما في استرجاع المستضد.
    6. قبل البدء في استرجاع المستضد ، قم بتسخين المخزن المؤقت للسيترات مسبقا (الرقم الهيدروجيني 6.0) في وعاء كوبلين (انظر جدول المواد) باستخدام فرن ميكروويف حتى يصل إلى 95-100 درجة مئوية.
    7. اغمر الشرائح في محلول سترات مسخن مسبقا وقم بتسخين البرطمان لمدة 15 دقيقة في فرن الميكروويف. أخرج برطمان كوبلين من الفرن واتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة.
    8. قم بسد أقسام البيروكسيديز الداخلي عن طريق إضافة خليط 1: 1 من الميثانول وبيروكسيد الهيدروجين لمدة 5 دقائق ، متبوعا بغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
    9. تخلل الأقسام باستخدام 0.5٪ Triton-X 100 لمدة 15 دقيقة. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
    10. منع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة الأولية عن طريق احتضان الأقسام بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) في 1x PBS لمدة 1 ساعة.
    11. احتضان الأقسام بالأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 3-5 دقائق لكل منها لإزالة الجسم المضاد غير المرتبط.
    12. أضف جسما مضادا ثانويا مناسبا مقترنا بالصبغة الفلورية واحتضانه لمدة 45 دقيقة. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 3-5 دقائق لكل منها.
      ملاحظة: الأجسام المضادة والتخفيفات الخاصة بها مذكورة في جدول المواد. تم تصنيف أقسام الشبكية العضوية المناعية باستخدام PAX6 و CHX10 للكشف عن خلايا السلائف العصبية الشبكية المبكرة ، واستخدام Recoverin و CRX للكشف عن خلايا السلائف الشبكية والمستقبلات الضوئية الملتزمة. وبالمثل ، تم استخدام anti-PAX6 و anti-MITF للكشف عن سلائف RPE ، وتم استخدام anti-CRALBP و anti-RPE65 للكشف عن خلايا RPE الناضجة المصطبغة عن طريق الكيمياء الخلوية المناعية لمزارع أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد.
    13. قم بتلطيخ الأقسام باستخدام DAPI أو PI وقم بتثبيتها على شريحة زجاجية باستخدام وسيط التثبيت المضاد للتلاشي (انظر جدول المواد).
    14. قم بتصوير وتوثيق الأقسام ذات العلامات المناعية لعضويات الشبكية ومزارع RPE باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر الفلوري أو متحد البؤر لفحص طبقات الخلايا المختلفة التي تعبر عن علامات شبكية مختلفة.

النتائج

يتم تحقيق تمايز hiPSCs إلى سلالات العين عن طريق زراعة الخلايا في مجموعات مختلفة من وسط الثقافة الذي يحتوي على مكملات وعوامل نمو في خطوات متسلسلة في نقاط زمنية مختلفة ، كما هو موضح في الشكل 1. يتم الحفاظ على ثقافات hiPSC في الوسط الأساسي 8 ، وسط صيانة الخلايا الجذعية متعدد القدرات. ...

Discussion

hiPSCs هي أداة قوية لدراسة تطور الأعضاء والأنسجة في المختبر. يمكن أن يساعد تلخيص النمط الظاهري للمرض من خلال التمييز بين hiPSCs الصحية مقابل hiPSCs الخاصة بالمرض تجاه سلالة الشبكية في اكتساب رؤى أحدث حول الفيزيولوجيا المرضية لأشكال مختلفة من ضمور الشبكية الموروث. تم وصف العديد من البروتوكولا...

Disclosures

جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح أو إفصاحات مالية.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بالدعم العلمي والتقني من الدكتورة شيترا كانابيران ، عالمة الوراثة. د. سوبهادرا جلالي، استشاري الشبكية. الدكتور ميليند ، جراح تجميل العين. والدكتور سواثي كاليكي ، أخصائي أورام العين في معهد LV Prasad للعيون ، حيدر أباد نحو توليد خطوط iPSC طبيعية ومحددة للمريض. يقر المؤلفون بمنح البحث والتطوير من مجلس أبحاث العلوم والهندسة ، قسم العلوم والتكنولوجيا (IM) ، (SB / SO / HS / 177/2013) ، قسم التكنولوجيا الحيوية (IM) ، (BT / PR32404 / MED / 30/2136/2019) ، وزمالات بحثية عليا من ICMR (S.M. ، D.P.) ، UGC (T.A.) ، و CSIR (V.K.P.) ، حكومة الهند.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Syringe filtersTPP99722 
15 mL centrifuge tubeTPP91015
50 mL centrifuge tubeTPP91050
6 well platesTPP92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonalSanta CruzSC3655191:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonalAbcamab1406031:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonalAbcamab32011:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal     MilliporeAB55851:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF)Sigma AldrichF0291
Centrifuge 5810REppendorf
Coplin Jar (50 mL)Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning354277
CryoTubesThermo FisherV7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)Thermo Fisher10565-018
DreamTaq DNA polymeraseThermo FisherEP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered SalineThermo Fisher14190144
Essential 8 medium kitThermo FisherA1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma AldrichE5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm Corning351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Gibco26140079
GelDocXR+ with Image lab softwareBIO-RADAgarose Gel documentation system 
GlutaMAX SupplementThermo Fisher35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110011:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546InvitrogenA110301:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546InvitrogenA110351:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110081:300 dilution
HistoCore MULTICUTLeicaFor sectioning
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher10828028
L-Acsorbic acidSigma AldrichA92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher11140-050
N2 supplement (100x)Thermo Fisher17502048
NanoDrop 2000Thermo FisherTo quantify RNA
ParaformaldehydeQualigens23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, UnpluggedCorning7095D-9
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonalAbcamab1839511:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit MonoclonalAbcamab1950451:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit MonoclonalAbcamab2317821:300 dilution
Recombinant Human Noggin ProteinR&D Systems6057-NG
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Serological pipettes 10 mLTPP94010
Serological pipettes 5 mLTPP94005
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrateSigma AldrichS4641
Starfrost (silane coated) microscopic slidesKnittel
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCRInvitrogen18080051
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector laboratoriesH-1200 
VitronectinThermo FisherA27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)Sigma AldrichY0503
Zeiss LSM 880ZeissConfocal microscope

References

  1. Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
  4. Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
  5. . RetNet - Retinal Information Network Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022)
  6. Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
  7. Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
  8. Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
  9. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
  10. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  11. Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
  12. Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  15. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  16. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  17. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  18. Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
  19. Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
  20. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  21. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  22. Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
  23. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190 iPSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved