Генерация органоидов сетчатки из здоровых плюрипотентных стволовых клеток, вызванных заболеваниями сетчатки человека

Резюме

Этот протокол описывает эффективный метод дифференциации ИПСК в кластеры глазных полей и получения нейроретинальных органоидов с использованием упрощенных условий культивирования с участием как адгезивных, так и суспензионных систем культивирования. Другие типы глазных клеток, такие как RPE и эпителий роговицы, также могут быть выделены из зрелых глазных полей в культурах сетчатки.

Аннотация

Плюрипотентные стволовые клетки могут генерировать сложные тканевые органоиды, которые полезны для исследований моделирования заболеваний in vitro и для разработки регенеративной терапии. Этот протокол описывает более простой, надежный и ступенчатый метод генерации органоидов сетчатки в гибридной системе культивирования, состоящей из адгезивных монослойных культур в течение первых 4 недель дифференцировки сетчатки до появления отчетливых, самоорганизующихся первичных кластеров глазного поля (EFP). Кроме того, круглые и полупрозрачные нейроретинальные островки в форме пончика внутри каждого EFP вручную собирают и культивируют под суспензией с использованием неадгезивных культуральных чашек в среде дифференцировки сетчатки в течение 1-2 недель для получения многослойных 3D-оптических чашек (OC-1M). Эти незрелые органоиды сетчатки содержат пролиферирующие PAX6+ и ChX10⁺ мультипотентные предшественники сетчатки. Клетки-предшественники линейно самоорганизуются внутри органоидов и выглядят как отдельные радиальные бороздки. Через 4 недели после культивирования суспензии предшественники сетчатки подвергаются постмитотической остановке и дифференцировке линий с образованием зрелых органоидов сетчатки (OC-2M). Предшественники, зафиксированные фоторецепторами, развиваются в самых внешних слоях органоидов сетчатки. Эти фоторецепторные клетки CRX+ и RCVRN⁺ морфологически созревают, чтобы демонстрировать внутренние сегментоподобные расширения. Этот метод может быть использован для получения органоидов сетчатки с использованием эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Все шаги и процедуры четко объясняются и демонстрируются для обеспечения воспроизводимости и более широкого применения в фундаментальной науке и трансляционных исследованиях.

Введение

Сетчатка представляет собой светочувствительную ткань, присутствующую в задней части глаза позвоночных, которая преобразует световые сигналы в нервные импульсы с помощью биохимического явления, известного как путь фототрансдукции. Начальные нервные импульсы, генерируемые в фоторецепторных клетках сетчатки, передаются другим интернейронам сетчатки и ганглиозным клеткам сетчатки (RGC) и достигают зрительной коры головного мозга, что помогает в восприятии изображения и визуальной реакции.

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), примерно 1,5 миллиона детей слепы, из которых 1 миллион находится в Азии. Наследственная дистрофия сет....

протокол

Все эксперименты с использованием ИПСК проводились в асептическом режиме, в соответствии со стандартной лабораторной практикой, руководящими принципами по этике и биобезопасности, а также с одобрения регулирующих органов, таких как Институциональный комитет по этике (IEC), Институциональный комитет по исследованиям стволовых клеток (IC-SCR) и Институциональный комитет по биобезопасности (IBSC).

1. Приготовление среды для культивирования ИПСК и дифференцировки сетчатки и реагентов

1. Среда для культивирования и поддержания ИПСК
   1. Культивируйте и поддерживайте нормальную линию^{hiPSC 23} (hiPS....

Результаты

Дифференциация ИПСК в глазные линии достигается путем культивирования клеток в различных коктейлях питательной среды, содержащих добавки и факторы роста, последовательными шагами в разные моменты времени, как описано на рисунке 1. Культуры hiPSC поддерживаются в среде Ess.......

Обсуждение

ИПСК являются мощным инструментом для изучения развития органов и тканей in vitro. Повторение фенотипа заболевания путем дифференциации здоровых и специфических для заболевания ИПСК в сторону линии сетчатки может помочь получить новое представление о патофизиологии различных форм.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe filters	TPP	99722
15 mL centrifuge tube	TPP	91015
50 mL centrifuge tube	TPP	91050
6 well plates	TPP	92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal	Santa Cruz	SC365519	1:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal	Abcam	ab140603	1:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal	Abcam	ab3201	1:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal	Millipore	AB5585	1:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher	17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF)	Sigma Aldrich	F0291
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Coplin Jar (50 mL)	Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	354277
CryoTubes	Thermo Fisher	V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)	Thermo Fisher	10565-018
DreamTaq DNA polymerase	Thermo Fisher	EP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	14190144
Essential 8 medium kit	Thermo Fisher	A1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm	Corning	351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States	Gibco	26140079
GelDocXR+ with Image lab software	BIO-RAD		Agarose Gel documentation system
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11030	1:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546	Invitrogen	A11035	1:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1:300 dilution
HistoCore MULTICUT	Leica		For sectioning
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
L-Acsorbic acid	Sigma Aldrich	A92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
N2 supplement (100x)	Thermo Fisher	17502048
NanoDrop 2000	Thermo Fisher		To quantify RNA
Paraformaldehyde	Qualigens	23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged	Corning	7095D-9
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal	Abcam	ab183951	1:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal	Abcam	ab195045	1:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal	Abcam	ab231782	1:300 dilution
Recombinant Human Noggin Protein	R&D Systems	6057-NG
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Serological pipettes 10 mL	TPP	94010
Serological pipettes 5 mL	TPP	94005
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	S4641
Starfrost (silane coated) microscopic slides	Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	18080051
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector laboratories	H-1200
Vitronectin	Thermo Fisher	A27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)	Sigma Aldrich	Y0503
Zeiss LSM 880	Zeiss		Confocal microscope