АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает эффективный метод дифференциации ИПСК в кластеры глазных полей и получения нейроретинальных органоидов с использованием упрощенных условий культивирования с участием как адгезивных, так и суспензионных систем культивирования. Другие типы глазных клеток, такие как RPE и эпителий роговицы, также могут быть выделены из зрелых глазных полей в культурах сетчатки.

Аннотация

Плюрипотентные стволовые клетки могут генерировать сложные тканевые органоиды, которые полезны для исследований моделирования заболеваний in vitro и для разработки регенеративной терапии. Этот протокол описывает более простой, надежный и ступенчатый метод генерации органоидов сетчатки в гибридной системе культивирования, состоящей из адгезивных монослойных культур в течение первых 4 недель дифференцировки сетчатки до появления отчетливых, самоорганизующихся первичных кластеров глазного поля (EFP). Кроме того, круглые и полупрозрачные нейроретинальные островки в форме пончика внутри каждого EFP вручную собирают и культивируют под суспензией с использованием неадгезивных культуральных чашек в среде дифференцировки сетчатки в течение 1-2 недель для получения многослойных 3D-оптических чашек (OC-1M). Эти незрелые органоиды сетчатки содержат пролиферирующие PAX6+ и ChX10+ мультипотентные предшественники сетчатки. Клетки-предшественники линейно самоорганизуются внутри органоидов и выглядят как отдельные радиальные бороздки. Через 4 недели после культивирования суспензии предшественники сетчатки подвергаются постмитотической остановке и дифференцировке линий с образованием зрелых органоидов сетчатки (OC-2M). Предшественники, зафиксированные фоторецепторами, развиваются в самых внешних слоях органоидов сетчатки. Эти фоторецепторные клетки CRX+ и RCVRN+ морфологически созревают, чтобы демонстрировать внутренние сегментоподобные расширения. Этот метод может быть использован для получения органоидов сетчатки с использованием эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Все шаги и процедуры четко объясняются и демонстрируются для обеспечения воспроизводимости и более широкого применения в фундаментальной науке и трансляционных исследованиях.

Введение

Сетчатка представляет собой светочувствительную ткань, присутствующую в задней части глаза позвоночных, которая преобразует световые сигналы в нервные импульсы с помощью биохимического явления, известного как путь фототрансдукции. Начальные нервные импульсы, генерируемые в фоторецепторных клетках сетчатки, передаются другим интернейронам сетчатки и ганглиозным клеткам сетчатки (RGC) и достигают зрительной коры головного мозга, что помогает в восприятии изображения и визуальной реакции.

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), примерно 1,5 миллиона детей слепы, из которых 1 миллион находится в Азии. Наследственная дистрофия сетчатки (ВМД) является основным заболеванием, приводящим к слепоте, которое поражает 1 из 4 000 человек во всем мире 1,2,3, в то время как распространенность слепоты, связанной с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД), колеблется от 0,6% до 1,1% в развивающихся странах 4. IRD вызваны наследственными генетическими дефектами в более чем 300 различных генах, участвующих в развитии и функционировании сетчатки5. Такие генетические изменения приводят к нарушению нормальных функций сетчатки и постепенной дегенерации клеток сетчатки, а именно фоторецепторных клеток и пигментного эпителия сетчатки (RPE), что приводит к тяжелой потере зрения и слепоте. Огромный прогресс был достигнут в других условиях ослепления, связанных с роговицей, хрусталиком и т. Д. Однако дистрофии сетчатки и атрофии зрительного нерва на сегодняшний день не имеют доказанной терапии. Поскольку сетчатка взрослого человека не имеет стволовых клеток6, альтернативные источники, такие как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные от пациента, могут обеспечить неограниченный запас желаемых типов клеток и иметь большие перспективы для разработки сложных тканевых органоидов, необходимых для исследований моделирования заболеваний in vitro и для разработки регенеративной терапии7, 8,9,10.

Несколько лет исследований сетчатки привели к лучшему пониманию молекулярных событий, которые организуют раннее развитие сетчатки. Большинство протоколов для получения клеток сетчатки и 3D-органоидов из PSC направлены на повторение этих событий развития in vitro путем культивирования клеток в сложном коктейле факторов роста и малых молекул для поэтапной модуляции известных биологических процессов. Образующиеся таким образом органоиды сетчатки состоят из основных клеток сетчатки: ганглиозных клеток сетчатки (RGCs), интернейронов, фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Несмотря на успешные попытки моделирования IRD с использованием органоидов сетчатки, потребность в сложном коктейле факторов роста и малых молекул во время дифференцировки и относительно низкая эффективность генерации органоидов сетчатки представляют собой серьезную проблему для большинства протоколов. Они в основном включают образование эмбриоидных тел с последующей их ступенчатой дифференцировкой в линии сетчатки с использованием сложных условий культивирования на разных стадиях развития in vitro 20,21,22.

Здесь сообщается об упрощенном и надежном методе разработки сложных 3D-нейроретинальных органоидов из здоровых контрольных и специфических для заболевания сетчатки ИПСК. Описанный здесь протокол использует прямую дифференциацию почти сливающихся культур hiPSC без необходимости формирования эмбриоидных тел. Кроме того, сложность питательной среды упрощается, что делает ее экономически эффективным и воспроизводимым методом, который может быть легко принят новыми исследователями. Он включает в себя гибридную культуральную систему, состоящую из адгезивных монослойных культур в течение первых 4 недель дифференцировки сетчатки до появления отчетливых, самоорганизующихся первичных кластеров глазного поля (EFP). Кроме того, круглые нейроретинальные островки внутри каждого EFP вручную собирают и выращивают в суспензионных культурах в течение 1-2 недель для получения многослойных 3D-чашек сетчатки или органоидов, состоящих из пролиферирующих предшественников нейроретинальности PAX6+ и CHX10+. Расширенное культивирование органоидов сетчатки в 100 мкМ тауринсодержащей среде в течение еще 4 недель привело к появлению предшественников фоторецепторов RCVRN+ и CRX+ и зрелых клеток с рудиментарными внутренними сегментоподобными расширениями.

протокол

Все эксперименты с использованием ИПСК проводились в асептическом режиме, в соответствии со стандартной лабораторной практикой, руководящими принципами по этике и биобезопасности, а также с одобрения регулирующих органов, таких как Институциональный комитет по этике (IEC), Институциональный комитет по исследованиям стволовых клеток (IC-SCR) и Институциональный комитет по биобезопасности (IBSC).

1. Приготовление среды для культивирования ИПСК и дифференцировки сетчатки и реагентов

  1. Среда для культивирования и поддержания ИПСК
    1. Культивируйте и поддерживайте нормальную линиюhiPSC 23 (hiPSC-F2-3F1) и отредактированную CRISPR линию RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, с биаллельной делецией со сдвигом рамки 10.н. в экзоне 18 гена RB1 человека) в среде Essential 8 на культуральных планшетах, покрытых матригелем (матричное покрытие базальной мембраны; см. Таблицу материалов) в условиях культивирования без кормушки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол можно сделать полностью свободным от ксено, заменив матрицу базальной мембраны покрытием из рекомбинантного витронектина (VTN-N). Приготовьте полную среду Essential 8, добавив 50-кратную добавку Essential 8 (входит в комплект средств Essential 8; см. Таблицу материалов) и 100 ЕД/мл растворов пенициллина-стрептомицина. В качестве альтернативы, hiPSC также можно культивировать с использованием полной среды mTeSR1.
  2. Раствор для диссоциации клеток (1x CDS)
    1. Для бесферментной диссоциации и пассажирования ИПСК человека приготовьте CDS, содержащий 0,5 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 30 мМ NaCl в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе Дульбекко (DPBS) (см. Таблицу материалов).
    2. Чтобы приготовить 100 мл 1x CDS, добавьте 100 мкл 0,5 М ЭДТА и 1 мл 3 М исходных растворов NaCl к 99 мл 1x DPBS, хорошо перемешайте и стерилизуйте фильтр с помощью фильтра 0,22 мкм.
  3. Дифференциационная индукционная среда (DIM)
    1. Приготовьте DIM, используя базальную среду DMEM-F12 с добавлением 10% заменителя нокаутирующей сыворотки (KOSR), 1x заменимой аминокислоты (NEAA), 2 мМ GlutaMax, 100 ЕД / мл пенициллина-стрептомицина, 200 мкМ L-аскорбиновой кислоты и 1% добавки N2 (см. Таблицу материалов).
  4. Среда дифференцировки сетчатки (RDM)
    1. Приготовьте RDM, используя базальную среду DMEM-F12 с добавлением 10% нокаутирующей сыворотки (KOSR), 1x заменимой аминокислоты (NEAA), 2 мМ глутамакса, 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина, 200 мкМ L-аскорбиновой кислоты и 2% добавки B27 (с витамином А) (см. Таблицу материалов).
  5. Поверхности клеточных культур, покрытые внеклеточным матриксом
    1. Разморозьте матрицу базальной мембраны, отвечающую требованиям hESC, на ночь в ведре со льдом, желательно в холодильнике при температуре 4-8 °C. Разбавьте размороженный 100-кратный матричный материал (5 мл) в соотношении 1:5, добавив 20 мл ледяной базальной среды DMEM-F12, и перемешайте путем осторожного закручивания, чтобы получить 20-кратный исходный раствор.
      1. Приготовьте аликвоты объемом 0,5 мл на льду, используя предварительно охлажденные наконечники пипеток и стерильные микроцентрифужные пробирки. Маркируйте флаконы как 20-кратные запасы и храните их в замороженном виде в морозильной камере при температуре -80 °C до 6 месяцев.
    2. Для покрытия поверхностей клеточных культур (культуральных чашек или 6-луночных тарелок) разморозьте аликвоту 20-кратной матрицы на льду и разбавьте ее в соотношении 1:20, используя ледяную базальную среду DMEM-F12, чтобы приготовить 10 мл 1x раствора для покрытия матрицы, чего достаточно для покрытия 100-миллиметровой чашки или 6-луночной пластины (1,5 мл/лунка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед работой с матричным раствором предварительно охладите пипетки/микронаконечники с помощью аспирации ледяного и стерильного DPBS. Размораживание и вся обработка матрицы должны производиться на льду с использованием предварительно охлажденных пипеток / микронаконечников, чтобы избежать полимеризации и гелеобразования при комнатных температурах.
    3. Добавьте 1,5 мл 1x раствора матричного покрытия в каждую лунку 6-луночного планшета, осторожно перемешайте пластину, чтобы обеспечить равномерное покрытие, и инкубируйте планшеты при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2 . Оставьте пластины нетронутыми как минимум на 1 час, чтобы обеспечить равномерное покрытие матрицы на поверхностях культуры.
    4. Перед посевом клеток аспирируйте раствор покрытия с помощью стерильной пипетки объемом 5 мл и выбросьте жидкие отходы. Немедленно добавьте свежую питательную среду (2 мл на 6-луночную пластину) и засейте клетки с плотностью 150 000-200 000 клеток в лунку. Не допускайте высыхания пластин во время погрузочно-разгрузочных работ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы покрытие рекомбинантным витронектином (VTN-N) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл может быть использовано для протокола культивирования без ксено.

2. Создание человеческих культур iPSC

  1. Размораживание и возрождение ИПСК
    1. Покройте одну лунку 6-луночной пластины раствором 1x мембранной матрицы. Инкубировать при 37 °C в течение 1 ч, чтобы обеспечить полимеризацию и равномерное покрытие поверхности культуры.
    2. После 1 ч инкубации удалите раствор оболочки и добавьте 1 мл предварительно подогретой полной среды Essential 8, содержащей 10 мкМ ингибитора Rho-киназы, Y-27632 (1 мкл / мл 10 мМ запаса; см. Таблицу материалов), прежде чем оживлять клетки.
    3. Извлеките криовальный запас hiPSC (1 x 106 клеток/флакон) из контейнера с жидким азотом. Быстро разморозьте криовиал на водяной бане с температурой 37 °C с легким перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не размораживайте флакон полностью; Запишите номер прохода, простерилизуйте поверхность флакона и вытрите его насухо безворсовым тампоном, содержащим 70% изопропилового спирта.
    4. Используя стерильный наконечник пипетки объемом 1 мл, аспирируйте криовальное содержимое в свежую пробирку объемом 15 мл, состоящую из 2 мл предварительно разогретой полной среды Essential 8 без Y-27632. Центрифугируйте пробирку при 1 000 x g в течение 4 мин при комнатной температуре. Откажитесь от надосадочной жидкости.
    5. Ресуспендировать клеточную гранулу в 1,0 мл полной среды Essential 8, содержащей 10 мкМ Y-27632.
    6. Добавьте эту суспензию ячеек на поверхности, покрытые матрицей, не нарушая матрицу, распределяя ее вдоль стенок. Аккуратно покачайте тарелку крест-накрест, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
    7. Инкубируйте планшеты при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2 , чтобы клетки прилипли и начали размножаться.
    8. Через 12-24 ч замените отработанную среду и выдержите культуры в предварительно подогретой полной среде Essential 8 без Y-27632.
    9. Меняйте культуральную среду каждые 24 часа и проходите через культуры, как только они достигнут слияния 70%-80%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение разделения 1: 6 обычно соблюдается для культур hiPSC и проходит через регулярные промежутки времени в 3-4 дня.
  2. Пассажирование и нанесение ИПСК для инициации дифференцировки линии сетчатки
    1. Аспирируйте отработанную среду из 70%-80% сливающихся культур ИПСК человека в 6-луночные планшеты.
    2. Добавьте по 1 мл CDS (этап 1.2) в каждую лунку и инкубируйте при 37 ° C в течение 5-7 минут до округления клеток. Осторожно удалите CDS, стараясь не отрывать клетки, добавьте 2 мл свежей среды Essential 8 и аккуратно тритуируйте с помощью пипетки.
    3. Соберите клеточную суспензию из одной лунки 6-клеточной пластины в центрифужную пробирку объемом 15 мл и открутите пробирку при 1000 x g в течение 4 мин при комнатной температуре. Откажитесь от надосадочной жидкости.
    4. Ресуспендируют клеточную гранулу в 1,2 мл среды Essential 8 и дозируют 200 мкл ячейки 200 мкл клеточной суспензии (соотношение расщепления 1:6) в каждую лунку 6-луночной пластины с матричным покрытием, содержащей 1,5 мл питательной среды iPSC, содержащей 10 мкМ Y-27632, как описано на этапе 1.5.
    5. Через 12-24 ч замените отработанную среду и выдержите культуры в предварительно подогретой полной среде Essential 8 без Y-27632.
    6. Меняйте питательную среду каждые 24 часа до тех пор, пока культуры не достигнут 70-80% слияния.

3. Дифференциация ИПСК по глазным полям и происхождению сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое описание процесса дифференциации показано на рисунке 1.

  1. Инициируйте процедуру дифференцировки, как только культуры hiPSC достигнут слияния 70-80%.
  2. В день 0 замените поддерживающую среду hiPSC на DIM (шаг 1.3), содержащую 1 нг/мл bFGF и 1 нг/мл Noggin. Добавьте 2,0 мл среды на лунку 6-луночного планшета и поддерживайте ячейки при 37 ° C в инкубаторе 5% CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постепенная отмена bFGF индуцирует дифференцировку ПСК, а добавление возрастающих концентраций ноггина (ингибитора нескольких BMP) на начальных стадиях индуцирует дифференцировку и неврализацию эктодермальной линии11,12 и блокирует приверженность мезодермы и энтодермы. В качестве альтернативы Noggin может быть заменен на LDN193189. В отличие от двойной стратегии ингибирования SMAD, о которой сообщалось ранее20,21, этот протокол не требует добавления Activin или SB-431542.
  3. В 1-й день смените отработанную среду и добавьте DIM, содержащий 1 нг/мл bFGF и 10 нг/мл Noggin. Добавьте 2,0 мл на лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте и поддерживайте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 .
  4. На 2-3 день удалите отработанную среду и добавьте DIM, содержащий всего 10 нг/мл Noggin. Добавьте 2,0 мл на лунку 6-луночного планшета и меняйте среду каждые 24 часа. Инкубируйте и поддерживайте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием всегда предварительно прогревайте питательную среду до 30-37 °C. Избыточные мушки и мертвые клетки могут наблюдаться в ранних культурах дифференцировки. В таких условиях промойте культуры один раз 1x DPBS и добавьте среду для дифференцировки сетчатки. Тесты на стерильность отработанной среды можно проводить еженедельно или по мере необходимости.
  5. На 4-й день удалите отработанный носитель и добавьте RDM (шаг 1.4). Добавьте 2,0 мл на лунку 6-луночного планшета и продолжайте поддерживать культуры в RDM при 37 ° C в инкубаторе 5% CO2 с ежедневной сменой свежей среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы PSC можно выращивать в виде суспензионных культур с 1-3-го дня в неадгезивных и круглодонных 96-луночных планшетах с плотностью клеток 5 x 103 клеток/100 мкл / лунку с образованием эмбриоидных телец (БЭ) в идентичных условиях культивирования в DIM. Хорошо сформированные ЭБ на 4-й день могут быть нанесены на пластины с матричным покрытием, содержащие RDM, и им разрешено прилипать, размножаются и дифференцируются, как описано ниже.
  6. Примерно на 14-18 день наблюдайте за культурами под микроскопом при 10-кратном увеличении на предмет появления нейронных розеточных доменов, состоящих из предшественников раннего глазного поля (рис. 2B).
  7. Примерно на 21-28 день (3-4 недели) наблюдайте культуры под микроскопом при 4-кратном и 10-кратном увеличении, чтобы наблюдать появление самоорганизующихся, отчетливых EFP с центральным островком круглых 3D-нейроретинальных структур, окруженных смежными выростами нейроэпителия и эпителия поверхности глаза (рис. 2C, D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Около 20-30 EFP можно наблюдать на лунку 6-луночной пластины нормальной культуры дифференцировки сетчатки hiPSC. Это число может варьироваться в зависимости от других специфических для заболевания линий hiPSC в зависимости от их генетического фона и потенциала дифференцировки линий сетчатки.

4. Сбор органоидов сетчатки

  1. Вытягивание пламени стеклянных пипеток Пастера для ручного сбора чашек сетчатки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте автоклавные и стерильные стеклянные пипетки Пастера для ковыряния глазного поля.
    1. Включите горелку Бунзена. Возьмите стерильную пипетку Пастера и держите основание в одной руке, а кончик капилляра в другой. Пламя стерилизует и нагревает область около середины кончика капилляра вращательными движениями, пока стекло не станет податливым. Затем отойдите от пламени и быстро вытяните наружу, чтобы создать тонкий капиллярный наконечник с закрытым просветом.
    2. Держите тонкий наконечник горизонтально перед пламенем и быстро пропустите его через пламя движением наружу, чтобы создать гладкий крючок или L-образный капиллярный наконечник.
    3. Используйте гладкую зону внешней кривизны капиллярного крючка в качестве мелкой мерной ложки, чтобы аккуратно поднять и отсоединить неповрежденные нейроретинальные чашки от кластеров EFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гладкий угол стеклянного капиллярного крючка не вызывает повреждения клеток и не создает царапин на культуральных поверхностях. Этот простой инструмент также может быть эффективно использован для расщепления отдельных колоний hiPSC в сетчатых паттернах и для передачи их в виде небольших клеточных кластеров во время клональной экспансии.
  2. Культивирование и уход за чашками сетчатки для получения 3D-органоидов сетчатки.
    1. На 25-30-й день добавьте 4,0 мл предварительно подогретой среды для дифференцировки сетчатки в чашку с низкой насадкой диаметром 60 мм перед подготовкой к сбору нейроретинальных чашек.
    2. Работайте под стереомикроскопом с увеличением 0,63x-4,5x, чтобы наблюдать и вручную выбирать правильно сформированные нейроретинальные чашки из отдельных EFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Появление пигментированных клеточных выростов RPE помогает легко идентифицировать EFP и центрально расположенные нейроретинальные чашки. Чашки сетчатки выглядят как круглые и полупрозрачные 3D-структуры в форме пончика с четкими радиальными бороздками, образованными линейно расположенными и самоорганизующимися стволовыми клетками сетчатки, в отличие от плотно упакованных и сферических или нерегулярных кластеров, образованных нейронами ЦНС или клеткаминервного гребня 23.
    3. Используйте крючки для пипеток Pasture с вытягиванием пламени, чтобы аккуратно подтолкнуть и вычерпать центральный нейроретинальный остров в отдельных EFP.
    4. Установите микропипетку объемом 1 мл на аспирацию 100 мкл и используйте микронаконечники объемом 1 мл с широкими отверстиями для аспирации и переноса плавающих чашек сетчатки в свежие чашки с низкой адгезией, приготовленные на шаге 4.2.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование наконечников с меньшим размером отверстия и более высоким давлением всасывания может вызвать сдвиг и повлиять на целостность чашек сетчатки. Примерные размеры чашечек сетчатки составляют около 1-2 мм в диаметре.
    5. Сохраняйте чашки сетчатки в RDM в виде неадгезивных суспензионных культур и инкубируйте их при 37 ° C в инкубаторе 5% CO2 .
    6. День 30-45: Меняйте среду ежедневно, осторожно наклоняя блюдо и позволяя чашкам сетчатки отстояться в течение примерно 30 секунд. Следуйте методу частичной подкормки, удаляя половину объема отработанной среды и заменяя равными объемами свежей среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторной аспирации и переноса, чтобы предотвратить повреждение чашек сетчатки. После 1-2 недель культивирования суспензии чашечки сетчатки немного увеличиваются в размерах (1-3 мм) и превращаются в самоорганизующиеся 3D-органоиды сетчатки (OC-1M), состоящие из линейно расположенных ранних нейроретинальных предшественников, экспрессирующих PAX6 и CHX10 (рис. 3Bi).
    7. День 45-60: Культивируйте органоиды сетчатки в течение следующих 4 недель в RDM, содержащем 100 мкМ таурина (см. Таблицу материалов), чтобы поддержать лучшую выживаемость и дифференцировку линий нейроретинальных предшественников и развитие зрелого типа клеток сетчатки (OC-2M).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Около 70-80% чашек сетчатки или зрительных чашек, отобранных из EFP, остаются нетронутыми, сохраняют свое ламинирование и развиваются в зрелые органоиды сетчатки после 4 недель культивирования суспензии (OC-2M).
    8. Убедитесь, что зрелые органоиды сетчатки через 4 недели суспензионного культивирования показывают появление предшественников фоторецепторов RCVRN+ и CRX+ и зрелых клеток с рудиментарным внутренним сегментоподобным расширением в самых внешних клеточных слоях, тем самым повторяя нормальное развитие сетчатки и процесс созревания in vitro (рис. 3Bii).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления нейроретинальных чашек культуры дифференцировки могут постоянно поддерживаться в RDM. Проксимальные эпителиальные выросты, окружающие нейросетчатку, содержат предшественники клеток пигментированного эпителия сетчатки (RPE), которые в дальнейшем расширяются и созревают, образуя пигментированные монослои RPE с типичной морфологией булыжника (рис. 4). Дистальные выросты преимущественно состоят из поверхностного эпителия глаза, который способствуетэпителию хрусталика и роговицы.Желаемые типы клеток могут быть собраны из различных зон выростов EFP и дополнительно обогащены для создания чистых культур.

5. Характеристика органоидов сетчатки

  1. Морфологическая и молекулярная характеристика
    1. Наблюдайте за адгезивными EFP и плавающими органоидами сетчатки под фазово-контрастным микроскопом при 4-кратном и 10-кратном увеличении и документируйте их морфологию и размеры.
    2. Соберите около 20 органоидов сетчатки на разных стадиях созревания (этапы 4.2.3-4.2.6) в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, используя наконечники широкого диаметра 1000 мкл. Дайте органоидам осесть на дне и аспирировать среду. Вымойте чашки с помощью 1x PBS.
    3. Удалите излишки PBS и добавьте 1,0 мл реагента TRIzol (см. Таблицу материалов). Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Гомогенизируйте ткань с помощью трубчатого пестика и тритурируйте с помощью пипетки объемом 1,0 мл.
    4. Подготовьте общую РНК, следуя стандартному реагентному методу выделения и очистки РНК в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    5. Проверьте качество РНК на агарозном геле и количественно определите его с помощью спектрофотометра NanoDrop (см. Таблицу материалов).
    6. Преобразуйте 1-2 мкг общей РНК в кДНК с помощью фермента обратной транскриптазы в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). В таблице 1 приведен список геноспецифических праймеров.
    7. Вкратце, приготовьте мастер-смесь РНК-праймер в 10 мкл общего объема, как указано в таблице 2 , и инкубируйте пробирку при 65 ° C в течение 5 минут в термоциклере. Перенесите трубку из термоциклера на лед на 2 мин.
    8. Тем временем приготовьте мастер-микс 2 с реагентами, указанными в таблице 3. Добавьте эту мастер-смесь в пробирку для смеси РНК-праймер, приготовленную на шаге 5.1.7. Аккуратно перемешайте.
    9. Инкубируют образец при 50 °C в течение 50 мин, затем при 85 °C в течение 5 мин, а затем выдерживают при 4 °C, чтобы остановить реакцию.
    10. Используйте синтезированную кДНК в качестве шаблона в ПЦР-реакциях для проверки экспрессии нейроретинального предшественника и маркеров зрелых клеток сетчатки.
    11. Нормализуйте общие шаблоны кДНК каждого образца, а именно F2-UD (hiPSC-F2-3F1; недифференцированные клетки), OC-1M (1-недельная оптическая чашка в суспензионной культуре) и OC-2M (4-недельная оптическая чашка в суспензионной культуре) с помощью полуколичественной ПЦР с использованием генов домашнего хозяйства, таких как hE1fα или GAPDH.
    12. Подготовьте мастер-смесь для полуколичественной ПЦР, как указано в таблице 4, и поместите пробирки с исследуемым образцом для амплификации в термоциклер. Условия амплификации ПЦР приведены в таблице 5.
  2. Гистология и иммуногистохимия
    1. Соберите оптические чашки в микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл и аспирируйте избыточную среду (этапы 4.2.3-4.2.6). Промойте органоиды 1x PBS, а затем промойте и суспендируйте их в 500 мкл 4% параформальдегида, чтобы закрепить их на ночь при комнатной температуре.
    2. На следующий день вымойте чашки в деионизированной воде. Дайте чашкам постоять в 95% спирте (три смены по 15-20 минут каждая), затем 100% спирт (три смены по 15-20 минут каждая), смесь абсолютного спирта и ксилола 1:1 в течение 15 минут, ксилола (две смены по 15 минут каждая) и парафина (три смены по 15 минут каждая). Вставьте эту ткань, чтобы приготовить парафиновый блок в соответствии со стандартными процедурами. Дайте ему остыть и затвердеть.
    3. Подготовьте тонкие срезы (толщиной ~ 4-5 мкм) с помощью микротома и поместите их на микроскопические предметные стекла с силановым покрытием (см. Таблицу материалов) в соответствии со стандартными гистологическими процедурами.
    4. Для депарафинизации нагрейте предметные стекла при 70 °C на нагревательном блоке в течение 15-20 мин. Как только воск растает, промойте предметные стекла ксилолом (три смены по 3-4 минуты), который полностью удалит парафин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное удаление парафина приводит к плохому/пятнистому окрашиванию участков с огромным количеством фонового шума.
    5. Повторно увлажните предметные стекла, используя разное процентное содержание этанола (100%, 90% и 80%) в течение 3 минут каждое. Промойте предметные стекла дистиллированной водой и приступайте к извлечению антигена.
    6. Перед началом извлечения антигена предварительно нагрейте цитратный буфер (pH 6,0) в банке Coplin (см. Таблицу материалов) с помощью микроволновой печи до 95-100 °C.
    7. Погрузите предметные стекла в предварительно разогретый цитратный буфер и прогрейте банку в течение 15 минут в микроволновой печи. Достаньте банку Coplin из духовки и дайте ей остыть при комнатной температуре.
    8. Заблокируйте срезы для эндогенной пероксидазы, добавив смесь метанола и перекиси водорода в соотношении 1:1 в течение 5 мин, а затем трижды промыв срезы 1x PBS.
    9. Пронизывайте срезы 0,5% Triton-X 100 в течение 15 мин. Трижды промойте предметные стекла с помощью 1x PBS.
    10. Блокируйте неспецифическое связывание первичных антител путем инкубации срезов с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в 1x PBS в течение 1 часа.
    11. Инкубируют срезы с первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C. Трижды промойте предметные стекла 1x PBS в течение 3-5 минут каждый, чтобы удалить несвязанное антитело.
    12. Добавьте подходящее флуоресцентное вторичное антитело, конъюгированное с красителем, и инкубируйте в течение 45 минут. Трижды промойте предметные стекла 1x PBS по 3-5 минут каждое.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела и их соответствующие разведения указаны в таблице материалов. Срезы органоидов сетчатки были иммуномечены с использованием PAX6 и CHX10 для обнаружения ранних клеток-предшественников нейроретинальности, а также с использованием Recoverin и CRX для обнаружения коммитированных клеток-предшественников сетчатки и фоторецепторов. Аналогичным образом, анти-PAX6 и анти-MITF использовались для обнаружения предшественников RPE, а анти-CRALBP и анти-RPE65 использовались для обнаружения пигментированных зрелых клеток RPE методом иммуноцитохимии 2D-монослойных культур.
    13. Покройте секции DAPI или PI и установите их на предметное стекло с помощью монтажного носителя с защитой от выцветания (см. Таблицу материалов).
    14. Визуализируйте и документируйте иммуномеченные срезы органоидов сетчатки и культур RPE с помощью флуоресцентного или конфокального лазерного сканирующего микроскопа для изучения различных клеточных слоев, экспрессирующих различные маркеры сетчатки.

Результаты

Дифференциация ИПСК в глазные линии достигается путем культивирования клеток в различных коктейлях питательной среды, содержащих добавки и факторы роста, последовательными шагами в разные моменты времени, как описано на рисунке 1. Культуры hiPSC поддерживаются в среде Ess...

Обсуждение

ИПСК являются мощным инструментом для изучения развития органов и тканей in vitro. Повторение фенотипа заболевания путем дифференциации здоровых и специфических для заболевания ИПСК в сторону линии сетчатки может помочь получить новое представление о патофизиологии различных форм...

Раскрытие информации

Все авторы не имеют конфликта интересов или раскрытия финансовой информации.

Благодарности

Авторы выражают признательность за научно-техническую поддержку со стороны д-ра Читры Каннабиран, генетика; Д-р Субхадра Джалали, консультант по сетчатке; Доктор Милинд Найк, окулопластический хирург; и д-р Свати Калики, офтальмолог-онколог из Глазного института LV Prasad, Хайдарабад, к созданию нормальных и специфических для пациента линий ИПСК. Авторы признают гранты на исследования и разработки от Совета по научным и инженерным исследованиям, Департамента науки и технологий (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Департамента биотехнологии (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) и старших научных стипендий от ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) и CSIR (V.K.P.), правительство Индии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Syringe filtersTPP99722 
15 mL centrifuge tubeTPP91015
50 mL centrifuge tubeTPP91050
6 well platesTPP92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonalSanta CruzSC3655191:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonalAbcamab1406031:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonalAbcamab32011:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal     MilliporeAB55851:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF)Sigma AldrichF0291
Centrifuge 5810REppendorf
Coplin Jar (50 mL)Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning354277
CryoTubesThermo FisherV7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)Thermo Fisher10565-018
DreamTaq DNA polymeraseThermo FisherEP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered SalineThermo Fisher14190144
Essential 8 medium kitThermo FisherA1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma AldrichE5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm Corning351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Gibco26140079
GelDocXR+ with Image lab softwareBIO-RADAgarose Gel documentation system 
GlutaMAX SupplementThermo Fisher35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110011:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546InvitrogenA110301:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546InvitrogenA110351:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110081:300 dilution
HistoCore MULTICUTLeicaFor sectioning
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher10828028
L-Acsorbic acidSigma AldrichA92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher11140-050
N2 supplement (100x)Thermo Fisher17502048
NanoDrop 2000Thermo FisherTo quantify RNA
ParaformaldehydeQualigens23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, UnpluggedCorning7095D-9
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonalAbcamab1839511:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit MonoclonalAbcamab1950451:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit MonoclonalAbcamab2317821:300 dilution
Recombinant Human Noggin ProteinR&D Systems6057-NG
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Serological pipettes 10 mLTPP94010
Serological pipettes 5 mLTPP94005
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrateSigma AldrichS4641
Starfrost (silane coated) microscopic slidesKnittel
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCRInvitrogen18080051
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector laboratoriesH-1200 
VitronectinThermo FisherA27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)Sigma AldrichY0503
Zeiss LSM 880ZeissConfocal microscope

Ссылки

  1. Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
  4. Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
  5. . RetNet - Retinal Information Network Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022)
  6. Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
  7. Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
  8. Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
  9. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
  10. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  11. Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
  12. Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  15. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  16. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  17. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  18. Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
  19. Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
  20. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  21. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  22. Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
  23. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены