Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает эффективный метод дифференциации ИПСК в кластеры глазных полей и получения нейроретинальных органоидов с использованием упрощенных условий культивирования с участием как адгезивных, так и суспензионных систем культивирования. Другие типы глазных клеток, такие как RPE и эпителий роговицы, также могут быть выделены из зрелых глазных полей в культурах сетчатки.

Аннотация

Плюрипотентные стволовые клетки могут генерировать сложные тканевые органоиды, которые полезны для исследований моделирования заболеваний in vitro и для разработки регенеративной терапии. Этот протокол описывает более простой, надежный и ступенчатый метод генерации органоидов сетчатки в гибридной системе культивирования, состоящей из адгезивных монослойных культур в течение первых 4 недель дифференцировки сетчатки до появления отчетливых, самоорганизующихся первичных кластеров глазного поля (EFP). Кроме того, круглые и полупрозрачные нейроретинальные островки в форме пончика внутри каждого EFP вручную собирают и культивируют под суспензией с использованием неадгезивных культуральных чашек в среде дифференцировки сетчатки в течение 1-2 недель для получения многослойных 3D-оптических чашек (OC-1M). Эти незрелые органоиды сетчатки содержат пролиферирующие PAX6+ и ChX10+ мультипотентные предшественники сетчатки. Клетки-предшественники линейно самоорганизуются внутри органоидов и выглядят как отдельные радиальные бороздки. Через 4 недели после культивирования суспензии предшественники сетчатки подвергаются постмитотической остановке и дифференцировке линий с образованием зрелых органоидов сетчатки (OC-2M). Предшественники, зафиксированные фоторецепторами, развиваются в самых внешних слоях органоидов сетчатки. Эти фоторецепторные клетки CRX+ и RCVRN+ морфологически созревают, чтобы демонстрировать внутренние сегментоподобные расширения. Этот метод может быть использован для получения органоидов сетчатки с использованием эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Все шаги и процедуры четко объясняются и демонстрируются для обеспечения воспроизводимости и более широкого применения в фундаментальной науке и трансляционных исследованиях.

Введение

Сетчатка представляет собой светочувствительную ткань, присутствующую в задней части глаза позвоночных, которая преобразует световые сигналы в нервные импульсы с помощью биохимического явления, известного как путь фототрансдукции. Начальные нервные импульсы, генерируемые в фоторецепторных клетках сетчатки, передаются другим интернейронам сетчатки и ганглиозным клеткам сетчатки (RGC) и достигают зрительной коры головного мозга, что помогает в восприятии изображения и визуальной реакции.

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), примерно 1,5 миллиона детей слепы, из которых 1 миллион находится в Азии. Наследственная дистрофия сет....

протокол

Все эксперименты с использованием ИПСК проводились в асептическом режиме, в соответствии со стандартной лабораторной практикой, руководящими принципами по этике и биобезопасности, а также с одобрения регулирующих органов, таких как Институциональный комитет по этике (IEC), Институциональный комитет по исследованиям стволовых клеток (IC-SCR) и Институциональный комитет по биобезопасности (IBSC).

1. Приготовление среды для культивирования ИПСК и дифференцировки сетчатки и реагентов

  1. Среда для культивирования и поддержания ИПСК
    1. Культивируйте и поддерживайте нормальную линиюhiPSC 23 (hiPS....

Результаты

Дифференциация ИПСК в глазные линии достигается путем культивирования клеток в различных коктейлях питательной среды, содержащих добавки и факторы роста, последовательными шагами в разные моменты времени, как описано на рисунке 1. Культуры hiPSC поддерживаются в среде Ess.......

Обсуждение

ИПСК являются мощным инструментом для изучения развития органов и тканей in vitro. Повторение фенотипа заболевания путем дифференциации здоровых и специфических для заболевания ИПСК в сторону линии сетчатки может помочь получить новое представление о патофизиологии различных форм.......

Раскрытие информации

Все авторы не имеют конфликта интересов или раскрытия финансовой информации.

Благодарности

Авторы выражают признательность за научно-техническую поддержку со стороны д-ра Читры Каннабиран, генетика; Д-р Субхадра Джалали, консультант по сетчатке; Доктор Милинд Найк, окулопластический хирург; и д-р Свати Калики, офтальмолог-онколог из Глазного института LV Prasad, Хайдарабад, к созданию нормальных и специфических для пациента линий ИПСК. Авторы признают гранты на исследования и разработки от Совета по научным и инженерным исследованиям, Департамента науки и технологий (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Департамента биотехнологии (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) и старших научных стипендий от ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) и CSIR (V.K.P.), правительство Индии.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Syringe filtersTPP99722 
15 mL centrifuge tubeTPP91015
50 mL centrifuge tubeTPP91050
6 well platesTPP92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonalSanta CruzSC3655191:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonalAbcamab1406031:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonalAbcamab32011:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal     MilliporeAB55851:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF)Sigma AldrichF0291
Centrifuge 5810REppendorf
Coplin Jar (50 mL)Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning354277
CryoTubesThermo FisherV7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)Thermo Fisher10565-018
DreamTaq DNA polymeraseThermo FisherEP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered SalineThermo Fisher14190144
Essential 8 medium kitThermo FisherA1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma AldrichE5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm Corning351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Gibco26140079
GelDocXR+ with Image lab softwareBIO-RADAgarose Gel documentation system 
GlutaMAX SupplementThermo Fisher35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110011:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546InvitrogenA110301:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546InvitrogenA110351:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110081:300 dilution
HistoCore MULTICUTLeicaFor sectioning
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher10828028
L-Acsorbic acidSigma AldrichA92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher11140-050
N2 supplement (100x)Thermo Fisher17502048
NanoDrop 2000Thermo FisherTo quantify RNA
ParaformaldehydeQualigens23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, UnpluggedCorning7095D-9
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonalAbcamab1839511:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit MonoclonalAbcamab1950451:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit MonoclonalAbcamab2317821:300 dilution
Recombinant Human Noggin ProteinR&D Systems6057-NG
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Serological pipettes 10 mLTPP94010
Serological pipettes 5 mLTPP94005
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrateSigma AldrichS4641
Starfrost (silane coated) microscopic slidesKnittel
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCRInvitrogen18080051
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector laboratoriesH-1200 
VitronectinThermo FisherA27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)Sigma AldrichY0503
Zeiss LSM 880ZeissConfocal microscope

Ссылки

  1. Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lanc....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены