Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

Abstract

תאי גזע פלוריפוטנטיים יכולים לייצר אורגנואידים מורכבים של רקמות השימושיים למחקרי מודלים של מחלות חוץ גופיות ולפיתוח טיפולים רגנרטיביים. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, חזקה ומדורגת יותר ליצירת אורגנואידים ברשתית במערכת תרבית היברידית המורכבת מתרביות חד-שכבתיות דבקות במהלך 4 השבועות הראשונים של התמיינות הרשתית עד להופעתם של אשכולות קדמוניים מובהקים של שדה העין (EFPs) המאורגנים באופן עצמאי. יתר על כן, האיים הנוירו-רשתיים בצורת סופגנייה, עגולים ושקופים בתוך כל EFP נקטפים ידנית ומתורבתים תחת תרחיף באמצעות צלחות תרבית לא דבקות במדיום התמיינות רשתית למשך 1-2 שבועות כדי ליצור כוסות אופטיות תלת-ממדיות רב-שכבתיות (OC-1M). אורגנואידים לא בשלים אלה ברשתית מכילים PAX6+ ו-ChX10+ מתרבים ומבשרי רשתית רב-עוצמה. התאים המקדימים מורכבים באופן ליניארי בתוך האורגנואידים ומופיעים כפסיעות רדיאליות נפרדות. לאחר 4 שבועות לאחר תרבית התרחיף, אבות הרשתית עוברים דום פוסט-מיטוטי והתמיינות שושלת ליצירת אורגנואידים רשתית בוגרים (OC-2M). שושלת קולטני האור מתפתחת בתוך השכבות החיצוניות ביותר של אורגנואידים ברשתית. תאים קולטי אור CRX+ ו-RCVRN+ אלה בשלים מורפולוגית כדי להציג הרחבות פנימיות דמויות סגמנט. ניתן לאמץ שיטה זו ליצירת אורגנואידים ברשתית באמצעות תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). כל השלבים והנהלים מוסברים ומודגמים בבירור כדי להבטיח שכפול וליישומים רחבים יותר במדע בסיסי ובמחקר תרגומי.

Introduction

הרשתית היא רקמה רגישה לאור הנמצאת בחלק האחורי של עין החוליות הממירה אותות אור לדחפים עצביים על ידי תופעה ביוכימית הידועה בשם מסלול פוטו-טרנסדוקציה. הדחפים העצביים הראשוניים הנוצרים בתאי הפוטורצפטור של הרשתית מתומרמים לתאי עצב אחרים ברשתית ולתאי גנגליון ברשתית (RGCs) ומגיעים לקליפת המוח הראייתית, המסייעת בתפיסת תמונה ובתגובה חזותית.

על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), כ -1.5 מיליון ילדים עיוורים, מתוכם מיליון באסיה. ניוון רשתית תורשתי (IRD) היא מחלה מסנוורת חמורה הפוגעת ב-1 מכל 4,000 אנשים ברחבי העולם בגילאי 1,2,3, בעוד ששכיחות העיוורון הקשור לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) נעה בין 0.6%-1.1% במדינות מתפתחות4. IRDs נגרמים על ידי פגמים גנטיים תורשתיים ביותר מ -300 גנים שונים המעורבים בהתפתחות הרשתית ותפקוד5. שינויים גנטיים כאלה גורמים לשיבוש תפקודי הרשתית התקינים ולניוון הדרגתי של תאי הרשתית, כלומר תאי קולטני האור והאפיתל הפיגמנטי ברשתית (RPE), ובכך מובילים לאובדן ראייה חמור ולעיוורון. התקדמות עצומה הושגה במצבים מסנוורים אחרים המערבים את הקרנית, העדשה וכו'. עם זאת, ניוון רשתית וניוון עצב הראייה אין כל טיפול מוכח עד כה. מכיוון שלרשתית אנושית בוגרת אין תאי גזע6, מקורות חלופיים כגון תאי גזע עובריים (ESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם במטופל (iPSCs) יכולים לספק אספקה בלתי מוגבלת של סוגי תאים רצויים וטומנים בחובם הבטחה גדולה לפיתוח אורגנואידים מורכבים של רקמות הדרושות למחקרי מידול מחלות חוץ גופיות ולפיתוח טיפולים רגנרטיביים7, 8,9,10.

מספר שנים של מחקר רשתית הובילו להבנה טובה יותר של אירועים מולקולריים המתזמרים התפתחות רשתית מוקדמת. רוב הפרוטוקולים ליצירת תאי רשתית ואורגנואידים תלת-ממדיים מ-PSCs שואפים לשחזר אירועים התפתחותיים אלה במבחנה, על ידי תרבית התאים בקוקטייל מורכב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי לווסת את התהליכים הביולוגיים הידועים באופן מדורג. אורגנואידי הרשתית הנוצרים כך מורכבים מתאי רשתית עיקריים: תאי גנגליון רשתית (RGCs), אינטרנוירונים, פוטורצפטורים ואפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. למרות ניסיונות מוצלחים למדל IRDs באמצעות אורגנואידים ברשתית, הדרישה לקוקטייל המורכב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות במהלך התמיינות והיעילות הנמוכה יחסית של יצירת אורגנואידים ברשתית מציבה אתגר גדול ברוב הפרוטוקולים. הם כוללים בעיקר היווצרות של גופים עובריים, ולאחר מכן התמיינות מדורגת שלהם לשושלות רשתית באמצעות תנאי תרבית מורכבים בשלבים שונים של התפתחות חוץ גופית 20,21,22.

כאן מדווחת שיטה פשוטה וחזקה לפיתוח אורגנואידים נוירו-רשתית תלת-ממדיים מורכבים מבקרה בריאה ו-hiPSCs ספציפיים למחלות רשתית. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בהבחנה ישירה של תרביות hiPSC כמעט משתלבות ללא צורך בהיווצרות גוף עוברי. כמו כן, המורכבות של מדיום התרבות היא פשוטה יותר, מה שהופך אותו טכניקה חסכונית לשחזור שניתן לאמץ בקלות על ידי חוקרים חדשים. היא כוללת מערכת תרבית היברידית המורכבת מתרביות חד-שכבתיות דבקות במהלך 4 השבועות הראשונים של התמיינות הרשתית עד להופעתם של אשכולות קדמוניים מובהקים של שדה עיניים (EFPs) המאורגנים בעצמם. יתר על כן, האיים הנוירו-רשתית המעגליים בתוך כל EFP נקטפים ידנית ומגודלים בתרביות תרחיף במשך 1-2 שבועות כדי להכין גביעי רשתית תלת-ממדיים רב-שכבתיים או אורגנואידים המורכבים ממבשרי נוירו-רשתית מתרבים PAX6+ ו-CHX10+ . תרבית ממושכת של אורגנואידים ברשתית בתווך המכיל טאורין של 100 מיקרומטר למשך 4 שבועות נוספים הביאה להופעתם של מבשרי קולטני אור RCVRN + ו-CRX+ ותאים בוגרים עם שלוחות בסיסיות דמויות מקטע פנימי.

Protocol

כל הניסויים ב-hiPSCs בוצעו באופן אספטי, תוך עמידה בנוהלי המעבדה הסטנדרטיים, הנחיות אתיות ובטיחות ביולוגית, ובאישורי גופים רגולטוריים כגון ועדת האתיקה המוסדית (IEC), הוועדה המוסדית לחקר תאי גזע (IC-SCR) והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBSC).

1. הכנת תרבית iPSC ומדיום התמיינות רשתית וריאגנטים

  1. תרבות iPSC ואמצעי תחזוקה
    1. תרבית ושמור על קו hiPSCרגיל 23 (hiPSC-F2-3F1) ועל קו CRISPR ערוך, RB1-/ - hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, עם מחיקה ביאלית, frameshift של 10 bp בתוך אקסון 18 של הגן RB1 האנושי) בתווך חיוני 8 על ציפוי מטריג'ל (מטריצת קרום מרתף מצופה; ראה טבלת חומרים) צלחות תרבית בתנאי תרבית ללא הזנה.
      הערה: פרוטוקול זה יכול להיעשות נטול קסנו לחלוטין על ידי החלפת מטריצת קרום המרתף בציפוי ויטרונקטין רקומביננטי (VTN-N). הכינו את Essential 8 medium המלא על ידי הוספת תוסף 50x Essential 8 (מסופק עם ערכת Essential 8 medium; ראו טבלת חומרים) ו-100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין תמיסות. לחלופין, ניתן גם לתרבית את hiPSCs באמצעות מדיום mTeSR1 המלא.
  2. פתרון לדיסוציאציה של תאים (CDS אחד)
    1. לדיסוציאציה נטולת אנזימים ולהעברה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים, הכינו את ה-CDS המכיל 0.5 mM EDTA, pH 8.0 ו-30 mM NaCl במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של 1x Dulbecco (ראו טבלת חומרים).
    2. כדי להכין 100 מ"ל של 1x CDS, הוסף 100 μL של 0.5M EDTA ו- 1 מ"ל של 3 M NaCl פתרונות מלאי ל- 99 מ"ל של DPBS 1x, ערבב היטב וסנן סטריליזציה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
  3. אמצעי אינדוקציה בידול (DIM)
    1. הכינו DIM באמצעות מדיום בסיסי DMEM-F12 בתוספת 10% תחליף סרום נוקאאוט (KOSR), 1x חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U / מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 200 מיקרומטר L-חומצה אסקורבית, ותוסף N2 1% (ראה רשימת חומרים).
  4. מדיום התמיינות רשתית (RDM)
    1. הכינו RDM באמצעות מדיום בסיסי DMEM-F12 בתוספת 10% סרום נוקאאוט (KOSR), 1x חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U / מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 200 מיקרומטר חומצה L-אסקורבית, ותוסף B27 2% (עם ויטמין A) (ראה רשימת חומרים).
  5. משטחי תרבית תאים חוץ-תאיים מצופים מטריצה
    1. הפשירו את מטריצת קרום המרתף בעלת אישור hESC למשך הלילה בדלי קרח, רצוי בתוך מקרר בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס. לדלל את מלאי המטריצה 100x המופשר (5 מ"ל) ביחס של 1:5 על ידי הוספת 20 מ"ל של מדיום בסיסי DMEM-F12 קר כקרח ולערבב על ידי ערבול עדין להכנת תמיסת מלאי 20x.
      1. מכינים 0.5 מ"ל aliquots על קרח באמצעות קצוות פיפטה מצוננים מראש צינורות microcentrifuge סטריליים. תייגו את הבקבוקונים כמלאי פי 20 ואחסנו אותם קפואים במקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך עד 6 חודשים.
    2. לציפוי משטחי תרבית התאים (צלחות תרבית או צלחות 6 בארות), הפשירו אליקוט של מטריצה 20x על קרח ודללו ביחס של 1:20 באמצעות מדיום בסיסי DMEM-F12 קר כקרח להכנת 10 מ"ל של תמיסת ציפוי מטריצה 1x, המספיקה לציפוי צלחת 100 מ"מ או צלחת 6 בארות (1.5 מ"ל / באר).
      הערה: מצננים את הפיפטות/מיקרוטיפים על ידי שאיפת DPBS קר כקרח וסטרילי לפני הטיפול בתמיסת המטריצה. ההפשרה וכל הטיפול במטריצה חייב להיעשות על קרח, תוך שימוש בפיפטות/מיקרוטיפים מקוררים מראש כדי למנוע פילמור וג'לינג בטמפרטורת החדר.
    3. הוסף 1.5 מ"ל של תמיסת ציפוי מטריצה 1x לכל באר של צלחת 6 בארות, סובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ציפוי אחיד, ודגר על הלוחות ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 . השאירו את הלוחות ללא הפרעה למשך שעה לפחות כדי להבטיח ציפוי אחיד של המטריצה על משטחי התרבית.
    4. לפני זריעת התאים יש לשאוף את תמיסת הציפוי באמצעות פיפטה סטרילית בנפח 5 מ"ל ולהשליך את הפסולת הנוזלית. מוסיפים מיד תרבית טרייה (2 מ"ל/באר של צלחת בעלת 6 בארות) וזורעים את התאים בצפיפות של 150,000-200,000 תאים/באר. אין לתת לצלחות להתייבש במהלך הטיפול.
      הערה: לחילופין, ציפוי ויטרונקטין רקומביננטי (VTN-N) בריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל יכול לשמש לפרוטוקול תרבית נטול קסנו.

2. ביסוס תרבויות iPSC אנושיות

  1. הפשרה והחייאת hiPSCs
    1. מצפים באר אחת של צלחת 6 בארות עם תמיסת מטריצת ממברנה 1x. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה כדי לאפשר פילמור וציפוי אחיד של משטח התרבית.
    2. לאחר שעה אחת של דגירה, הסר את תמיסת הציפוי והוסף 1 מ"ל של מדיום Essential 8 שלם שחומם מראש המכיל 10 מיקרומטר של מעכב רו-קינאז, Y-27632 (1 μL/mL של 10 mM מלאי; ראה טבלת חומרים), לפני החייאת התאים.
    3. הסר מלאי קריוביאלי hiPSC (1 x 106 תאים/בקבוקון) ממיכל החנקן הנוזלי. הפשיר במהירות את הקריוביאל באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם ערבול עדין.
      הערה: אין להפשיר את הבקבוקון לחלוטין; רשמו את מספר המעבר, עקרו את הבקבוקון ונגבו אותו לייבוש באמצעות מטוש ללא סיבים המכיל 70% אלכוהול איזופרופיל.
    4. בעזרת קצה פיפטה סטרילי של 1 מ"ל, שואפים את התוכן הקריוביאלי לתוך צינור טרי של 15 מ"ל המורכב מ-2 מ"ל של מדיום Essential 8 שלם שחומם מראש ללא Y-27632. צנטריפוגה את הצינור ב 1,000 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט.
    5. השהה מחדש את גלולת התא ב 1.0 מ"ל של מדיום חיוני 8 מלא המכיל 10 מיקרומטר Y-27632.
    6. הוסף את מתלה התא הזה על המשטחים המצופים במטריצה מבלי להפריע למטריצה על ידי פיזורו לאורך הקירות. נענעו את הצלחת בעדינות לרוחב כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.
    7. לדגור על הצלחות ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 כדי לאפשר לתאים להיצמד ולהתחיל להתרבות.
    8. לאחר 12-24 שעות, יש להחליף את המדיום המשומש ולשמור על התרביות בתווך Essential 8 שחומם מראש ללא Y-27632.
    9. שנה את מדיום התרבות כל 24 שעות ועבור את התרבויות ברגע שהן מגיעות למפגש של 70%-80%.
      הערה: יחס פיצול של 1:6 מתבצע באופן שגרתי עבור תרביות hiPSC ומועבר במרווחי זמן קבועים של 3-4 ימים.
  2. מעבר וציפוי של hiPSCs כדי להתחיל התמיינות שושלת רשתית
    1. שאפו את המדיום המושקע מ-70%-80% תרביות iPSC אנושיות בלוחות בעלי 6 בארות.
    2. הוסף 1 מ"ל CDS (שלב 1.2) לכל באר ודגר ב 37 ° C במשך 5-7 דקות עד התאים לעגל כלפי מעלה. בזהירות להסיר את CDS, בזהירות לא לנתק את התאים, ולהוסיף 2 מ"ל של טרי חיוני 8 בינוני בעדינות triturate באמצעות פיפטה.
    3. אספו את תרחיף התא מבאר אחת של צלחת 6 תאים לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וסובבו את הצינור במהירות של 1,000 x גרם למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט.
    4. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-1.2 מ"ל של מדיום חיוני 8 ולהוציא 200 μL של התא 200μL של תרחיף התא (יחס פיצול של 1:6) לכל באר של צלחת 6 בארות מצופת מטריצה המכילה 1.5 מ"ל של מדיום תרבית iPSC המכיל 10 מיקרומטר Y-27632, כמתואר בשלב 1.5.
    5. לאחר 12-24 שעות, יש להחליף את המדיום המשומש ולשמור על התרביות בתווך Essential 8 שחומם מראש ללא Y-27632.
    6. שנה את מדיום התרבות כל 24 שעות עד שהתרבויות מגיעות למפגש של 70%-80%.

3. התמיינות של hiPSCs לשדות עיניים ושושלת רשתית

הערה: מתאר סכמטי של תהליך הבידול מוצג באיור 1.

  1. התחל את הליך הבידול ברגע שתרביות hiPSC מגיעות למפגש של 70%-80%.
  2. ביום 0, שנה את אמצעי התחזוקה hiPSC ל- DIM (שלב 1.3) המכיל 1 ng/mL bFGF ו- 1 ng/mL Noggin. הוסף 2.0 מ"ל של בינוני לכל באר של צלחת 6 בארות ולשמור על התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
    הערה: נסיגה הדרגתית של bFGF גורמת להתמיינות של PSCs, ותוספת של ריכוזים הולכים וגדלים של Noggin (מעכב של מספר BMPs) במהלך השלבים הראשונים גורמת להתמיינות שושלת אקטודרמלית ונוירוליזציה11,12 וחוסמת את מחויבות המזודרם והאנדודרם. לחלופין, Noggin יכול להיות מוחלף על ידי LDN193189. שלא כמו אסטרטגיית עיכוב SMAD כפול שדווחה קודם לכן20,21, פרוטוקול זה אינו דורש תוספת של Activin או SB-431542.
  3. ביום הראשון, שנה את המדיום המשומש והוסף DIM המכיל 1 ng/mL bFGF ו- 10 ng/mL Noggin. מוסיפים 2.0 מ"ל לכל באר של צלחת 6 בארות. לדגור ולתחזק את התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
  4. ביום 2-3, הסר את המדיום המשומש והוסף DIM המכיל רק 10 ng/mL Noggin. מוסיפים 2.0 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות ומשנים את המדיום כל 24 שעות. לדגור ולתחזק את התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
    הערה: יש לחמם תמיד מראש את התרבית עד 30-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. עודף צפים ותאים מתים ניתן לראות בתרביות התמיינות מוקדמת. בתנאים כאלה, שטפו את התרביות פעם אחת עם DPBS 1x והוסיפו את מדיום התמיינות הרשתית. בדיקות סטריליות על המדיום בילה ניתן לעשות מדי שבוע או לפי הצורך.
  5. ביום 4, הסר את המדיום שהוצא והוסף את RDM (שלב 1.4). הוסף 2.0 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות והמשך לשמור על התרביות ב- RDM ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 , עם שינוי בינוני טרי מדי יום.
    הערה: לחילופין, ניתן לגדל את PSCs כתרביות תרחיף מהיום 1-3, בלוחות 96 בארות לא דבוקים ובעלי תחתית עגולה, בצפיפות תאים של 5 x 103 תאים/100 μL/well ליצירת גופים עובריים (EBs) בתנאי תרבית זהים ב-DIM. EBs מעוצבים היטב ביום 4 יכולים להיות מצופים על לוחות מצופים מטריצה המכילים RDM ומותר לדבוק, להתרבות, ולהבדיל כמתואר להלן.
  6. בסביבות היום ה-14-18, התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 עבור הופעתם של אזורים דמויי רוזטה עצבית המורכבים מאבות מוקדמים של שדה העין (איור 2B).
  7. בסביבות היום ה-21-28 (3-4 שבועות), התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 4 ו-10 כדי לצפות בהופעתם של EFPs נפרדים המאורגנים בעצמם, עם אי מרכזי של מבנים נוירו-רשתית תלת-ממדיים עגולים המוקפים בגידולים רציפים של אפיתל עצבי ואפיתל פני השטח של העין (איור 2C,D).
    הערה: ניתן לראות כ-20-30 EFPs לכל באר של צלחת 6 בארות של תרבית התמיינות רשתית HiPSC תקינה. מספר זה יכול להשתנות עם קווי hiPSC ספציפיים אחרים למחלה, בהתבסס על הרקע הגנטי שלהם ופוטנציאל התמיינות שושלת הרשתית.

4. קצירת אורגנואידים ברשתית

  1. משיכת להבה של פיפטות פסטר זכוכית לקטיף ידני של כוסות רשתית.
    הערה: השתמש בפיפטות פסטר מזכוכית אוטומטית וסטרילית לאיסוף שדה העין.
    1. הפעל מבער Bunsen. לוקחים פיפטה סטרילית של פסטר ומחזיקים את הבסיס ביד אחת ואת קצה הנימים ביד השנייה. הלהבה מעקרת ומחממת את האזור הסמוך לאמצע קצה הנימים, בתנועות סיבוביות עד שהזכוכית הופכת גמישה. לאחר מכן התרחקו מהלהבה ומשכו החוצה במהירות כדי ליצור קצה נימי דק עם לומן סגור.
    2. החזיקו את הקצה הדק אופקית מול הלהבה והעבירו אותו במהירות דרך הלהבה בתנועה החוצה כדי ליצור וו חלק או קצה נימי בצורת L.
    3. השתמש באזור העקמומיות החיצוני החלק של וו הנימים ככף מדידה עדינה כדי להרים ולנתק בעדינות את כוסות הרשתית העצבית השלמות מאשכולות ה- EFP.
      הערה: הזווית החלקה של וו נימי הזכוכית אינה גורמת נזק לתאים ואינה יוצרת שריטות על משטחי התרבית. כלי פשוט זה יכול לשמש ביעילות גם לפיצול מושבות hiPSC בודדות בתבניות רשת ולהעברתן כצבירי תאים קטנים במהלך הרחבת השבטים.
  2. תרבית ותחזוקה של גביעוני רשתית ליצירת אורגנואידים תלת ממדיים ברשתית.
    1. ביום 25-30, יש להוסיף 4.0 מ"ל של מדיום התמיינות רשתית שחומם מראש בכלי של 60 מ"מ עם חיבור נמוך לפני ההכנה לקציר כוסות נוירו-רשתית.
    2. עבוד תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של 0.63x-4.5x כדי לצפות ולבחור ידנית כוסות נוירו-רשתית בנויות היטב מ- EFPs בודדים.
      הערה: הופעתם של תאי RPE פיגמנטיים מסייעת בזיהוי קל של EFPs ושל גביעי נוירו-רשתית הממוקמים במרכז. גביעי הרשתית מופיעים כמבנים תלת-ממדיים בצורת סופגנייה, עגולים ושקופים, עם פסיעות רדיאליות ברורות, שנוצרו על ידי תאי גזע רשתית מסודרים ליניאריים ומורכבים מעצמם, בניגוד לצבירים הצפופים והכדוריים או הבלתי סדירים שנוצרו על ידי תאי העצב של מערכת העצבים המרכזית או תאי הפסגה העצבית23.
    3. השתמשו בווי פיפטה מרעה המושכים להבה כדי לדחוף בעדינות ולגרוף החוצה את האי הנוירו-רשתית המרכזי בתוך EFPs בודדים.
    4. הניחו מיקרופיפטה של 1 מ"ל כדי לשאוף 100 מיקרו-ליטר והשתמשו במיקרו-טיפים של 1 מ"ל עם פתחים רחבים כדי לשאוף ולהעביר את כוסות הרשתית הצפות למנות התרבית הטריות והנמוכות שהוכנו בשלב 4.2.1.
      הערה: שימוש בקצוות עם גודל משעמם קטן יותר ולחץ יניקה גבוה יותר עלול לגרום לגזירה ולהשפיע על שלמות כוסות הרשתית. הממדים המשוערים של גביעי הרשתית הם בקוטר של כ-1-2 מ"מ.
    5. שמרו על גביעי הרשתית ב-RDM כתרביות תרחיף שאינן נצמדות ודגרו עליהן בטמפרטורה של 37°C באינקובטורCO2 של 5%.
    6. יום 30-45: החליפו את המדיום מדי יום על ידי הטייה עדינה של הכלי ואפשרו לכוסות הרשתית להסתפק בכ-30 שניות. בצע שיטת הזנה חלקית, הסרת חצי נפח של מדיום בילה ולהחליף עם כמויות שוות של מדיום טרי.
      הערה: יש להימנע משאיפה חוזרת ומהעברות חוזרות כדי למנוע נזק לכוסות הרשתית. לאחר 1-2 שבועות של תרבית תרחיף, גביעי הרשתית גדלים מעט בגודלם (1-3 מ"מ) ומתפתחים לאורגנואידים תלת-ממדיים מאורגנים מעצמם (OC-1M) המורכבים מאבות נוירו-רשתית מוקדמים המסודרים באופן ליניארי המבטאים PAX6 ו-CHX10 (איור 3Bi).
    7. יום 45-60: תרבית אורגנואידים ברשתית למשך 4 שבועות נוספים ב- RDM המכיל 100 מיקרומטר טאורין (ראה טבלת חומרים) כדי לתמוך בהישרדות טובה יותר ובהתמיינות שושלת של אבות נוירו-רשתית ופיתוח סוג תאי רשתית בוגרים (OC-2M).
      הערה: כ-70%-80% מגביעי הרשתית או האופטיים שנקטפו מ-EFPs נשארים שלמים, שומרים על הלמינציה שלהם ומתפתחים לאורגנואידים רשתית בוגרים לאחר 4 שבועות של תרבית השעיה (OC-2M).
    8. בדקו שהאורגנואידים הבשלים ברשתית לאחר 4 שבועות של תרבית השעיה מראים את הופעתם של מבשרי קולטני אור RCVRN+ ו-CRX+ ותאים בוגרים עם הרחבה בסיסית דמוית מקטע פנימי בשכבות התאים החיצוניות ביותר, ובכך לשחזר את תהליך התפתחות הרשתית וההבשלה הרגיל במבחנה (איור 3Bii).
      הערה: לאחר הסרת כוסות נוירו-רשתית, תרביות ההתמיינות יכולות להישמר ברציפות ב- RDM. גידולי האפיתל הפרוקסימלי המקיפים את הרשתית העצבית מכילים מבשרי תאי אפיתל פיגמנטיים ברשתית (RPE), אשר מתרחבים ומבשילים עוד יותר ליצירת מונושכבות RPE פיגמנטיות עם מורפולוגיה טיפוסית של אבן מרוצפת (איור 4). הגידולים הדיסטליים מורכבים בעיקר מאפיתל פני העין התורםלעדשה ולאפיתל הקרנית.ניתן לקצור סוגי תאים רצויים מאזורים שונים של גידולי EFP ולהעשיר אותם עוד יותר כדי לבסס תרביות טהורות.

5. אפיון אורגנואידים ברשתית

  1. אפיון מורפולוגי ומולקולרי
    1. התבונן ב- EFPs הדבקים ובאורגנואידים רשתית צפים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של 4x ו- 10x ותעד את המורפולוגיה והממדים שלהם.
    2. אספו כ-20 אורגנואידים ברשתית בשלבים שונים של הבשלה (שלבים 4.2.3-4.2.6) לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל באמצעות קצוות רחבים של 1,000 מיקרוליטר. תנו לאורגנואידים להתיישב בתחתית ושאפו החוצה את המדיום. שטפו את הכוסות עם 1x PBS.
    3. הסר את עודפי PBS והוסף 1.0 מ"ל של מגיב TRIzol (ראה טבלת חומרים). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות צינור מזיק ו triturate באמצעות פיפטה 1.0 מ"ל.
    4. הכן את סך כל הרנ"א על ידי ביצוע שיטת הריאגנט הסטנדרטית של בידוד וטיהור RNA, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
    5. בדוק את איכות הרנ"א על ג'ל האגרוז וכמת אותה באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (ראה טבלת חומרים).
    6. המר 1-2 מיקרוגרם של RNA כולל ל- cDNA באמצעות אנזים שעתוק הפוך בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). ראו טבלה 1 לקבלת רשימה של פריימרים ספציפיים לגנים.
    7. בקצרה, הכינו את תערובת המאסטר RNA-פריימר בנפח כולל של 10 μL כנזכר בטבלה 2 ודגרו על הצינור בטמפרטורה של 65°C למשך 5 דקות במחזור תרמי. מעבירים את הצינור מהמחזור התרמי לקרח למשך 2 דקות.
    8. בינתיים, הכינו את תערובת האב 2 עם הריאגנטים המוזכרים בטבלה 3. הוסף תערובת מאסטר זו לצינור תערובת RNA-פריימר שהוכן בשלב 5.1.7. מערבבים בעדינות.
    9. לדגור את הדגימה ב 50 ° C במשך 50 דקות, ולאחר מכן 85 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן להחזיק ב 4 ° C כדי לעצור את התגובה.
    10. השתמש ב- cDNA המסונתז כתבנית בתגובות PCR כדי לבדוק את הביטוי של אב נוירו-רשתית וסמנים של תאי רשתית בוגרים.
    11. נרמלו את תבניות ה-cDNA הכוללות של כל דגימה, כלומר F2-UD (hiPSC-F2-3F1; תאים לא ממוינים), OC-1M (אופטית בת שבוע בתרבית תרחיף) ו-OC-2M (אופטית בת 4 שבועות בתרבית תרחיף) על ידי PCR כמותי למחצה באמצעות גנים ביתיים כגון hE1fα או GAPDH.
    12. הכינו את תמהיל האב ל-PCR כמותי למחצה, כמפורט בטבלה 4, והניחו את מבחנות הבדיקה להגברה במחזור תרמי. תנאי הגברת ה-PCR מוזכרים בטבלה 5.
  2. היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה
    1. יש לאסוף את הכוסות האופטיות בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2.0 מ"ל ולשאוף את התווך העודף (שלבים 4.2.3-4.2.6). שטפו את האורגנואידים עם 1x PBS ולאחר מכן שטפו והשהו אותם ב-500 μL של 4% Paraformaldehyde כדי לתקן אותם למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    2. למחרת, לשטוף את הכוסות במים deionized. תנו לכוסות לעמוד ב-95% אלכוהול (שלושה שינויים, 15-20 דקות כל אחד), ולאחר מכן 100% אלכוהול (שלושה שינויים, 15-20 דקות כל אחד), תערובת של 1:1 של אלכוהול מוחלט וקסילן למשך 15 דקות, קסילן (שני שינויים, 15 דקות כל אחד) ופרפין (שלושה שינויים, 15 דקות כל אחד). הטמע רקמה זו כדי להכין בלוק פרפין בעקבות הליכים סטנדרטיים. תנו לו להתקרר ולהתגבש.
    3. הכינו מקטעים דקים (~4-5 מיקרומטר עובי) באמצעות מיקרוטום והניחו אותם על שקופיות מיקרוסקופיות מצופות סילאן (ראו טבלת חומרים) בהתאם להליכים היסטולוגיים סטנדרטיים.
    4. עבור deparaffinization, לחמם את המגלשות ב 70 ° C על בלוק חימום במשך 15-20 דקות. ברגע שהשעווה נמסה, שטפו את המגלשות עם קסילן (שלושה שינויים, 3-4 דקות כל אחד), אשר יסיר את הפרפין לחלוטין.
      הערה: הסרה לא מלאה של פרפין גורמת להכתמה גרועה/מטושטשת של קטעים עם כמות עצומה של רעשי רקע.
    5. יש לייבש מחדש את המגלשות באחוזים שונים של אתנול (100%, 90% ו-80%) למשך 3 דקות כל אחת. שוטפים את המגלשות במים מזוקקים וממשיכים בשליפת אנטיגן.
    6. לפני תחילת שליפת האנטיגן, מחממים מראש את חיץ הציטראט (pH 6.0) בצנצנת קופלין (ראה טבלת חומרים) באמצעות תנור מיקרוגל עד שהוא מגיע ל 95-100 מעלות צלזיוס.
    7. טובלים את המגלשות במאגר ציטראט שחומם מראש ומחממים את הצנצנת במשך 15 דקות במיקרוגל. מוציאים את צנצנת קופלין מהתנור ומניחים לה להתקרר בטמפרטורת החדר.
    8. חסום את החלקים עבור peroxidase אנדוגני על ידי הוספת תערובת 1: 1 של מתנול ומי חמצן במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם 1x PBS.
    9. חדרו את המקטעים באמצעות 0.5% Triton-X 100 למשך 15 דקות. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 1x PBS.
    10. חסום את הקישור הלא ספציפי של נוגדן ראשוני על ידי דגירה על החלקים עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ב- 1x PBS למשך שעה אחת.
    11. לדגור את החלקים עם נוגדן ראשוני במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (75 °F). שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 3-5 דקות כל אחת כדי להסיר את הנוגדן הלא קשור.
    12. מוסיפים נוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי מתאים ודוגרים במשך 45 דקות. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 3-5 דקות כל אחת.
      הערה: הנוגדנים והדילולים שלהם בהתאמה מוזכרים בטבלת החומרים. מקטעי האורגנואידים ברשתית סומנו כמדוכונים באמצעות PAX6 ו-CHX10 כדי לזהות תאים מקדימים נוירו-רשתית מוקדמים, ובאמצעות Recoverin ו-CRX כדי לזהות תאים מקדימים של רשתית וקולטני אור. באופן דומה, אנטי-PAX6 ואנטי-MITF שימשו לזיהוי מבשרי RPE, ואנטי-CRALBP ואנטי-RPE65 שימשו לזיהוי תאי RPE בוגרים פיגמנטיים על ידי אימונוציטוכימיה של תרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות.
    13. הכתימו את המקטעים ב-DAPI או PI והרכיבו אותם על שקופית זכוכית באמצעות אמצעי ההרכבה נגד דהייה (ראו טבלת חומרים).
    14. צלם ותעד את המקטעים המתויגים החיסונית של אורגנואידים ברשתית ותרביות RPE באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר פלואורסצנטי או קונפוקלי כדי לבחון שכבות תאים שונות המבטאות סמני רשתית שונים.

תוצאות

התמיינות של hiPSCs לשושלות עיניים מושגת על-ידי תרבית תאים בקוקטיילים שונים של מדיום תרבית המכיל תוספי מזון וגורמי גדילה בשלבים עוקבים בנקודות זמן שונות, כפי שמתואר באיור 1. תרביות hiPSC נשמרות בתווך Essential 8, מדיום תחזוקת תאי גזע פלוריפוטנטי. ברגע שהם מגיעים למפגש של 70%-80% (

Discussion

hiPSCs הם כלי רב עוצמה לחקר התפתחות איברים ורקמות במבחנה. שחזור פנוטיפ המחלה על ידי הבחנה בין hiPSCs בריאים לעומת ספציפיים למחלה לכיוון שושלת הרשתית יכול לעזור בהשגת תובנות חדשות יותר על הפתופיזיולוגיה של צורות שונות של ניוון רשתית תורשתי. מספר פרוטוקולים תוארו ואומצו להתמיינות חוץ גופ?...

Disclosures

לכל המחברים אין ניגוד עניינים או גילויים כספיים.

Acknowledgements

המחברים מודים על התמיכה המדעית והטכנית של ד"ר צ'יטרה קנאבירן, גנטיקאית; ד"ר סובהדרה ג'לאלי, יועצת רשתית; ד"ר מילינד נאיק, כירורג אוקולופלסטי; וד"ר סוואתי קליקי, אונקולוג עיניים במכון העיניים LV Prasad, היידראבאד לקראת יצירת קווי iPSC נורמליים וספציפיים למטופל. המחברים מודים על מענקי המו"פ של מועצת המחקר למדע והנדסה, המחלקה למדע וטכנולוגיה (IM), (SB/SO/HS/177/2013), המחלקה לביוטכנולוגיה (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019), ומלגות מחקר בכירות מ- ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) ו- CSIR (V.K.P.), ממשלת הודו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Syringe filtersTPP99722 
15 mL centrifuge tubeTPP91015
50 mL centrifuge tubeTPP91050
6 well platesTPP92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonalSanta CruzSC3655191:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonalAbcamab1406031:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonalAbcamab32011:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal     MilliporeAB55851:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF)Sigma AldrichF0291
Centrifuge 5810REppendorf
Coplin Jar (50 mL)Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning354277
CryoTubesThermo FisherV7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)Thermo Fisher10565-018
DreamTaq DNA polymeraseThermo FisherEP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered SalineThermo Fisher14190144
Essential 8 medium kitThermo FisherA1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)Sigma AldrichE5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm Corning351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Gibco26140079
GelDocXR+ with Image lab softwareBIO-RADAgarose Gel documentation system 
GlutaMAX SupplementThermo Fisher35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110011:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546InvitrogenA110301:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546InvitrogenA110351:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110081:300 dilution
HistoCore MULTICUTLeicaFor sectioning
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher10828028
L-Acsorbic acidSigma AldrichA92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher11140-050
N2 supplement (100x)Thermo Fisher17502048
NanoDrop 2000Thermo FisherTo quantify RNA
ParaformaldehydeQualigens23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, UnpluggedCorning7095D-9
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonalAbcamab1839511:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit MonoclonalAbcamab1950451:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit MonoclonalAbcamab2317821:300 dilution
Recombinant Human Noggin ProteinR&D Systems6057-NG
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Serological pipettes 10 mLTPP94010
Serological pipettes 5 mLTPP94005
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrateSigma AldrichS4641
Starfrost (silane coated) microscopic slidesKnittel
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCRInvitrogen18080051
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector laboratoriesH-1200 
VitronectinThermo FisherA27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)Sigma AldrichY0503
Zeiss LSM 880ZeissConfocal microscope

References

  1. Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
  2. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  3. Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
  4. Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
  5. . RetNet - Retinal Information Network Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022)
  6. Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
  7. Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
  8. Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
  9. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
  10. Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
  11. Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
  12. Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  15. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  16. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  17. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  18. Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
  19. Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
  20. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  21. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  22. Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
  23. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190iPSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved