从健康和视网膜疾病特异性人诱导的多能干细胞中生成视网膜类器官

摘要

该协议描述了一种将hiPSCs分化为眼场簇并使用涉及贴壁和悬浮培养系统的简化培养条件生成神经视网膜类器官的有效方法。其他眼细胞类型，如RPE和角膜上皮，也可以在视网膜培养物中从成熟的眼视野中分离出来。

摘要

多能干细胞可以产生复杂的组织类器官，可用于体外疾病建模研究和开发再生疗法。该协议描述了一种更简单，稳健和逐步的方法，该方法在视网膜分化的前4周内在由贴壁单层培养物组成的杂交培养系统中生成视网膜类器官，直到出现独特的，自组织的眼场原始簇（EFP）。此外，每个EFP内的甜甜圈形，圆形和半透明神经视网膜岛在视网膜分化培养基中使用非粘附培养皿在悬浮液下手动挑选和培养1-2周以产生多层3D光学杯（OC-1M）。这些未成熟的视网膜类器官含有PAX6⁺和ChX10⁺增殖的多能视网膜前体。前体细胞在类器官内线性自组装，表现为明显的径向条纹。悬浮培养后4周，视网膜祖细胞经历有丝分裂后停滞和谱系分化，形成成熟的视网膜类器官（OC-2M）。光感受器谱系承诺的前体在视网膜类器官的最外层发育。这些CRX+和RCVRN⁺感光细胞形态成熟，显示出内段样延伸。该方法可用于使用人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）生成视网膜类器官。所有步骤和程序都得到清晰的解释和演示，以确保可复制性并在基础科学和转化研究中得到更广泛的应用。

引言

视网膜是存在于脊椎动物眼睛后部的感光组织，它通过一种称为光转导途径的生化现象将光信号转化为神经冲动。视网膜感光细胞中产生的初始神经冲动被转导到其他视网膜中间神经元和视网膜神经节细胞（RGC）并到达大脑的视觉皮层，这有助于图像感知和视觉反应。

根据世界卫生组织（世卫组织）的数据，估计有150万儿童失明，其中100万在亚洲。遗传性视网膜营养不良症（IRD）是一种主要的致盲性疾病，全球每4，000人中就有1人受到影响1，²，^3，而在发展中国家^，与年龄相关性黄斑变性（AMD）相关的失明患病率在0.6%-^1.1%之间^4。IRD是由300多种不同基因的遗传缺陷引起的，这些基因涉及视网膜发育和功能⁵。这种遗传变化导致视网膜正常功能的破坏和视网膜细胞（即感光细胞和视网膜色素上皮（RPE））的逐渐退化，从而导致严重的视力丧失和失明。在涉及角膜、晶状体等的其他致盲疾病方面取得了巨大进展。然而，视网膜营养不良和视神经萎缩迄今没有任何经过验证的治疗方法。由于成人视网膜没有干细胞⁶，胚胎干细胞（ESC）和患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）等替代来源可以提供无限供应所需的细胞类型，并为开发体外疾病建模研究和开发再生疗法所需的复杂组织类器官7提供了巨大的希望^，8，^9，10.

几年的视网膜研究使人们对协调早期视网膜发育的分子事件有了更好的理解。大多数从 PSC 生成视网膜细胞和 3D 类器官的方案旨在通过在生长因子和小分子的复杂混合物中培养细胞来逐步调节已知的生物过程，从而在体外概括这些发育事件。由此产生的视网膜类器官由主要的视网膜细胞组成:视网膜神经节细胞（RGC），中间神经元，光感受器和视网膜色素上皮（RPE）11，12，13，^14，15，¹⁶，¹⁷，^18，19.尽管成功尝试使用视网膜类器官对IRD进行建模，但在分化过程中对生长因子和小分子的复杂混合物的需求以及视网膜类器官生成效率相对较低，这对大多数方案构成了重大挑战。它们主要包括胚体的形成，然后在体外发育的不同阶段使用复杂的培养条件逐步分化为视网膜谱系²⁰，^21，22。

在这里，报道了一种从健康对照和视网膜疾病特异性hiPSCs开发复杂3D神经视网膜类器官的简化且稳健的方法。此处描述的方案利用近乎融合的hiPSC培养物的直接分化，而无需形成拟胚体。此外，培养基的复杂性也得到了简化，使其成为一种经济高效且可重复的技术，新研究人员可以轻松采用。它涉及一个混合培养系统，该系统由贴壁单层培养物组成，在视网膜分化的前 4 周内，直到出现独特的自组织眼野原始簇 （EFP）。此外，手动采摘每个EFP内的圆形神经视网膜岛并在悬浮培养物中生长1-2周，以制备由PAX6 ⁺和CHX10 ⁺增殖神经视网膜前体组成的多层3D视网膜杯或类器官。视网膜类器官在100μM含牛磺酸的培养基中进一步培养4周，导致RCVRN+和CRX⁺感光器前体的出现以及具有基本内段样延伸的成熟细胞。

研究方案

所有涉及hiPSCs的实验均无菌进行，遵守标准实验室规范，伦理和生物安全指南，并得到机构伦理委员会（IEC），干细胞研究机构委员会（IC-SCR）和机构生物安全委员会（IBSC）等监管机构的批准。

1. iPSC培养和视网膜分化培养基及试剂的制备

1. iPSC 培养和维持培养基
   1. 在无饲养层培养条件下，在基质胶包被（基底膜基质包被;参见材料表）培养板上培养并维持正常的hiPSC系²³（hiPSC-F2-3F1）和CRISPR编辑的RB1-/- hiPSC系（LVIP15-RB1-CS3，在人RB1基因的外显子18内具有双等位基因，移码缺失10 bp）。
      注意:通过用重组玻连蛋白（VTN-N）涂层替换基底膜基质，可以完全无异种。通过添加 50x Essential 8 补充剂（随 Essential 8 培养基试剂盒提供;参见 材料表）和 100 U/mL 青霉素-链霉素溶液，制备完整的 Essential 8 培养基。或者，也可以使用完整的mTeSR1培养基培养hiPSC。
2. 细胞解离液（1x CDS）
   1. 为了无酶解离和传代人 iPSC，在 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中制备含有 0.5 mM EDTA、pH 8.0 和 30 mM NaCl 的 CDS（参见 材料表）。
   2. 要制备 100 mL 的 1x CDS，请将 100 μL 的 0.5M EDTA 和 1 mL 的 3 M NaCl 储备溶液加入 99 mL 的 1x DPBS 中，充分混合，并使用 0.22 μm 过滤器进行过滤灭菌。
3. 分化诱导培养基 （DIM）
   1. 使用 DMEM-F12 基础培养基制备 DIM，其中补充有 10% 敲除血清替代 （KOSR）、1x 非必需氨基酸 （NEAA）、2 mM 谷氨酸、100 U/mL 青霉素-链霉素、200 μM L-抗坏血酸和 1% N2 补充剂（参见 材料表）。
4. 视网膜分化培养基 （RDM）
   1. 使用 DMEM-F12 基础培养基制备 RDM，其中补充有 10% 敲除血清 （KOSR）、1x 非必需氨基酸 （NEAA）、2 mM 谷氨酸最大值、100 U/mL 青霉素-链霉素、200 μM L-抗坏血酸和 2% B27 补充剂（含维生素 A）（见 材料表）。
5. 细胞外基质包被的细胞培养表面
   1. 将符合hESC标准的基底膜基质在冰桶中解冻过夜，优选在4-8°C的冰箱内解冻。 加入 20 mL 冰冷的 DMEM-F12 基础培养基，以 1:5 的比例稀释解冻的 100x 基质储备液 （5 mL），轻轻旋转混合以制备 20x 储备溶液。
      1. 使用预冷移液器吸头和无菌微量离心管在冰上制备 0.5 mL 等分试样。将小瓶标记为20x库存，并将其冷冻在-80°C冰箱中冷冻长达6个月。
   2. 为了包被细胞培养表面（培养皿或 6 孔板），在冰上解冻 20x 基质的等分试样，并使用冰冷的 DMEM-F12 基础培养基以 1:20 的比例稀释，以制备 10 mL 的 1x 基质包被溶液，足以包被 100 mm 培养皿或 6 孔板 （1.5 mL/孔）。
      注意:在处理基质溶液之前，通过吸出冰冷和无菌的DPBS来预冷移液器/微量吸头。解冻和基质的所有处理必须在冰上进行，使用预冷移液器/微量吸头，以避免在室温下聚合和凝胶化。
   3. 向 6 孔板的每个孔中加入 1.5 mL 的 1x 基质包衣溶液，轻轻旋转板以确保包被均匀，并将板在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育。将板不受干扰至少1小时，以确保基质均匀涂覆在培养表面上。
   4. 在接种细胞之前，使用 5 mL 无菌移液管吸出包衣溶液并丢弃废液。立即加入新鲜培养基（6孔板的2 mL/孔），并以150，000-200，000个细胞/孔的密度接种细胞。在处理过程中不要让板干燥。
      注意:或者，终浓度为0.5μg/ mL的重组玻连蛋白（VTN-N）包被可用于无异种培养方案。

2. 建立人类iPSC培养物

1. hiPSC的解冻和恢复
   1. 用 1x 膜基质溶液涂覆 6 孔板的一个孔。在37°C孵育1小时，使培养物表面聚合和均匀涂覆。
   2. 孵育 1 小时后，除去包衣溶液并加入 1 mL 预热的完全必需 8 培养基，其中含有 10 μM Rho-激酶抑制剂 Y-27632（1 μL/mL 的 10 mM 储备液;参见 材料表），然后复活细胞。
   3. 从液氮容器中取出 hiPSC 冷冻原液（1 x 10⁶ 个细胞/小瓶）。在37°C水浴中快速解冻冷冻管，轻轻旋转。
      注意:不要完全解冻小瓶;记下通道编号，对小瓶进行表面消毒，然后使用含有70%异丙醇的无绒棉签将其擦干。
   4. 使用无菌 1 mL 移液器吸头，将冷冻管内容物吸出到由 2 mL 不含 Y-27632 的预热完整 Essential 8 培养基组成的新鲜 15 mL 管中。在室温下以1，000× g 离心管4分钟。弃去上清液。
   5. 将细胞沉淀重悬于含有 10 μM Y-27632 的 1.0 mL 完全 Essential 8 培养基中。
   6. 将该细胞悬液添加到基质涂层的表面上，而不会通过沿壁分配来干扰基质。轻轻地横向摇动板，以确保细胞的均匀分布。
   7. 将板在37°C下在5%CO₂ 培养箱中孵育，以使细胞粘附并开始增殖。
   8. 12-24小时后，更换用过的培养基并将培养物保持在预热的完整Essential 8培养基中，不含Y-27632。
   9. 每24小时更换培养基，并在培养物达到70%-80%汇合时传代培养物。
      注意:hiPSC 培养物常规遵循 1:6 的分流比，并定期传代 3-4 天。
2. hiPSC的传代和接种以启动视网膜谱系分化
   1. 从 70%-80% 汇合的人 iPSC 培养物中吸出 6 孔板中的用过的培养基。
   2. 向每个孔中加入1mL CDS（步骤1.2），并在37°C下孵育5-7分钟，直到细胞四舍五入。小心取出 CDS，注意不要分离细胞，加入 2 mL 新鲜的 Essential 8 培养基，并使用移液管轻轻研磨。
   3. 将细胞悬液从 6 细胞板的一个孔中收集到 15 mL 离心管中，并在室温下以 1，000 x g 离心管 4 分钟。弃去上清液。
   4. 将细胞沉淀重悬于 1.2 mL Essential 8 培养基中，并将 200 μL 细胞 200μL 细胞悬液（1:6 分流比）分配到含有 1.5 mL 含有 10 μM Y-27632 的 iPSC 培养基的基质包被 6 孔板的每个孔中，如步骤 1.5 中所述。
   5. 12-24小时后，更换用过的培养基并将培养物保持在预热的完整Essential 8培养基中，不含Y-27632。
   6. 每24小时更换培养基，直到培养物达到70%-80%汇合。

3. hiPSCs分化为眼野和视网膜谱系

注意:差异化过程的示意图如图 1所示。

1. 一旦 hiPSC 培养物达到 70%-80% 汇合，启动分化程序。
2. 在第 0 天，将含有 1 ng/mL bFGF 和 1 ng/mL Noggin 的 hiPSC 维持培养基更换为 DIM（步骤 1.3）。每孔加入2.0mL培养基的6孔板，并将细胞保持在37°C的5%CO₂ 培养箱中。
   注意:bFGF的逐渐戒断诱导PSC的分化，并且在初始阶段添加增加浓度的Noggin（几种BMP的抑制剂）诱导外胚层谱系分化和神经化^11，12并阻断中胚层和内胚层承诺。或者，Noggin可以用LDN193189代替。与前面报道的双重SMAD抑制策略²⁰，²¹不同^，该方案不需要添加Activin或SB-431542。
3. 在第 1 天，更换用过的培养基并加入含有 1 ng/mL bFGF 和 10 ng/mL Noggin 的 DIM。每孔加入 2.0 mL 的 6 孔板。在5%CO₂ 培养箱中孵育并保持细胞在37°C。
4. 在第 2-3 天，取出用过的培养基并加入仅含有 10 ng/mL Noggin 的 DIM。每孔加入 2.0 mL 的 6 孔板，每 24 小时更换一次培养基。在5%CO₂ 培养箱中孵育并保持细胞在37°C。
   注意:使用前始终将培养基预热至30-37°C。在早期分化培养中可能观察到过量的飞蚊症和死细胞。在这种情况下，用1x DPBS洗涤培养物一次，并加入视网膜分化培养基。对用过的培养基进行无菌测试可以每周或根据需要进行。
5. 在第 4 天，取出用过的培养基并添加 RDM（步骤 1.4）。每孔加入 2.0 mL 的 6 孔板，并继续将培养物保持在 RDM 中的 37 °C 在 5% CO₂ 培养箱中，每天更换新鲜培养基。
   注意:或者，PSC可以从第1-3天作为悬浮培养物在非贴壁和圆底96孔板中以5 x 10 3细胞/ 100μL /孔^{的细胞密度} 生长，以在DIM的相同培养条件下形成胚状体（EB）。 第4天形成良好的EB可以铺到含有RDM的基质包被板上，并允许粘附， 增殖，并分化如下所述。
6. 在第14-18天左右，在显微镜下以10倍放大倍率观察培养物，以出现由早期眼野祖细胞组成的神经莲座样结构域（图2B）。
7. 在第 21-28 天左右（3-4 周），在显微镜下以 4 倍和 10 倍放大倍率观察培养物，以观察自组织、独特的 EFP 的出现，其中心岛由圆形 3D 神经视网膜结构组成，周围环绕着连续的神经上皮和眼表上皮（图 2C，D）。
   注意:正常hiPSC视网膜分化培养物的6孔板每孔可观察到约20-30个EFP。这个数字可能与其他疾病特异性hiPSC系不同，基于其遗传背景和视网膜谱系分化潜力。

4. 视网膜类器官的采集

1. 玻璃火焰拉动 巴斯德移液器用于手动拾取视网膜杯。
   注意:使用高压灭菌和无菌玻璃巴斯德移液器进行眼部视野拾取。
   1. 打开本生燃烧器。取无菌巴斯德移液管，一只手握住底座，另一只手握住毛细管尖端。火焰消毒并加热毛细管尖端中间附近的区域，旋转运动，直到玻璃变得柔韧。然后远离火焰并迅速向外拉，以形成具有闭合管腔的细毛细管尖端。
   2. 将细尖端水平握在火焰前面，然后以向外运动快速通过火焰，以形成光滑的钩子或 L 形毛细管尖端。
   3. 使用毛细管钩的光滑外曲率区域作为细勺，轻轻地从EFP簇上抬起并分离完整的神经视网膜杯。
      注意:玻璃毛细管钩的光滑角度既不会损坏细胞，也不会在培养表面上产生划痕。这个简单的工具还可以有效地用于网格模式中的单个hiPSC集落分裂，以及在克隆扩增期间将它们传代为小细胞簇。
2. 培养和维护视网膜杯以生成3D视网膜类器官。
   1. 在第 25-30 天，在准备收获神经视网膜杯之前，在低附着 60 mm 培养皿中加入 4.0 mL 预热的视网膜分化培养基。
   2. 在0.63x-4.5x放大倍率的体视显微镜下工作，观察并从单个EFP中手动挑选形状良好的神经视网膜杯。
      注意:色素沉着RPE细胞生长的外观有助于轻松识别EFP和中央放置的神经视网膜杯。视网膜杯呈现为甜甜圈形、圆形和半透明的 3D 结构，具有清晰的径向条纹，由线性排列和自组装的视网膜干细胞形成，而不是由中枢神经系统神经元或神经嵴细胞形成的紧密排列的球形或不规则簇²³。
   3. 使用火焰拉动的 Pasture 移液器钩轻轻地轻推并舀出单个 EFP 内的中央神经视网膜岛。
   4. 将 1 mL 微量移液器吸出 100 μL，并使用具有宽孔开口的 1 mL 微量吸头吸出并将浮动视网膜杯转移到步骤 4.2.1 中制备的新鲜、低贴壁培养皿中。
      注意:使用孔径较小、吸气压力较高的吸头可能会导致剪切并影响视网膜罩杯的完整性。视网膜罩杯的近似尺寸约为直径1-2毫米。
   5. 将视网膜杯保持在RDM中作为非贴壁悬浮培养物，并在37°C的5%CO₂ 培养箱中孵育它们。
   6. 第30-45天:每天更换培养基，轻轻倾斜培养皿，让视网膜罩杯沉淀约30秒。遵循部分进料方法，去除一半体积的废培养基并用等体积的新鲜培养基替换。
      注意:避免反复抽吸和转移，以防止对视网膜杯造成任何损坏。悬浮培养1-2周后，视网膜杯的大小略有增长（1-3mm），并发育成自组织的3D视网膜类器官（OC-1M），由线性排列的早期神经视网膜祖细胞组成表达PAX6和CHX10（图3Bi）。
   7. 第45-60天:在含有100μM牛磺酸的RDM中再培养视网膜类器官4周（见 材料表），以支持神经视网膜祖细胞的更好存活和谱系分化以及成熟视网膜细胞类型（OC-2M）的发育。
      注意:从EFP中挑选的视网膜或视杯中约有70%-80%保持完整，保留其层压，并在悬浮培养4周（OC-2M）后发育成成熟的视网膜类器官。
   8. 检查悬浮培养4周的成熟视网膜类器官是否显示RCVRN+和CRX+感光体前体的出现，并且在最外层细胞层中具有基本的内段状延伸，从而概括体 外 正常的视网膜发育和成熟过程（图3Bii）。
      注意:移除神经视网膜杯后，分化培养物可以在RDM中持续维持。神经视网膜周围的近端上皮生长物含有视网膜色素上皮（RPE）细胞前体，其进一步扩增和成熟以形成具有典型鹅卵石形态的色素性RPE单层（图4）。远端生长主要由有助于晶状体和角膜上皮的眼表上皮组成。 可以从EFP生长的不同区域收获所需的细胞类型，并进一步富集以建立纯培养物。

5. 视网膜类器官的表征

1. 形态学和分子表征
   1. 在相差显微镜下以4倍和10倍放大倍率观察贴壁EFP和浮动视网膜类器官，并记录其形态和尺寸。
   2. 使用宽口径 1，000 μL 吸头将处于不同成熟阶段（步骤 4.2.3-4.2.6）的约 20 个视网膜类器官收集到 1.5 mL 微量离心管中。让类器官沉淀在底部并吸出培养基。用 1x PBS 清洗杯子。
   3. 去除多余的PBS，加入1.0 mL TRIzol试剂（见材料表）。在室温下孵育5分钟。使用管杵匀浆组织，并使用 1.0 mL 移液器研磨。
   4. 按照制造商的说明，按照RNA分离和纯化的标准试剂方法制备总RNA（参见 材料表）。
   5. 检查琼脂糖凝胶上的RNA质量，并使用NanoDrop分光光度计对其进行定量（参见 材料表）。
   6. 按照制造商的说明，使用逆转录酶将1-2μg总RNA转换为cDNA（参见 材料表）。有关基因特异性引物的列表，请参见 表1 。
   7. 简而言之，如 表2 所述，在10μL总体积中制备RNA-引物预混液，并将管在65°C下在热循环仪中孵育5分钟。将管从热循环仪转移到冰上2分钟。
   8. 同时，用 表3中提到的试剂制备预混液2。将该预混液加入步骤5.1.7制备的RNA引物混合物管中。轻轻混合。
   9. 将样品在50°C孵育50分钟，然后在85°C孵育5分钟，然后在4°C下保持以停止反应。
   10. 使用合成的cDNA作为PCR反应中的模板，以检查神经视网膜祖细胞和成熟视网膜细胞标志物的表达。
   11. 通过使用管家基因（如 hE1fα 或 GAPDH）进行半定量 PCR，标准化每个样品的总 cDNA 模板，即 F2-UD（hiPSC-F2-3F1;未分化细胞）、OC-1M（悬浮培养中的 1 周龄视杯）和 OC-2M（悬浮培养中的 4 周龄视杯）。
   12. 如 表4所述，制备用于半定量PCR的预混液，并将测试样品管置于热循环仪中进行扩增。PCR扩增条件如 表5所示。
2. 组织学和免疫组织化学
   1. 将光学杯收集在2.0 mL微量离心管中并吸出多余的培养基（步骤4.2.3-4.2.6）。用 1x PBS 冲洗类器官，然后洗涤并悬浮在 500 μL 4% 多聚甲醛中，在室温下固定过夜。
   2. 第二天，用去离子水清洗杯子。让杯子在 95% 酒精中静置（三次变化，每次 15-20 分钟），然后是 100% 酒精（三次变化，每次 15-20 分钟），无水酒精和二甲苯的 1:1 混合物 15 分钟，二甲苯（两次变化，每次 15 分钟）和石蜡（三次变化，每次 15 分钟）。按照标准程序嵌入此组织以制备石蜡块。让它冷却并凝固。
   3. 使用切片机制备薄切片（~4-5μm厚度），并按照标准组织学程序将它们放置在硅烷包被的显微镜载玻片上（参见 材料表）。
   4. 对于脱蜡，在加热块上将载玻片在70°C下加热15-20分钟。蜡融化后，用二甲苯清洗载玻片（三次更换，每次 3-4 分钟），这将完全去除石蜡。
      注意:石蜡去除不完全会导致具有大量背景噪音的切片染色不良/斑片状。
   5. 使用不同百分比的乙醇（100%，90%和80%）重新水合载玻片3分钟。用蒸馏水冲洗载玻片并进行抗原修复。
   6. 在开始抗原修复之前，使用微波炉在Coplin罐（见 材料表）中预热柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），直到达到95-100°C。
   7. 将载玻片浸入预热的柠檬酸盐缓冲液中，并在微波炉中加热罐子15分钟。从烤箱中取出科普林罐，让它在室温下冷却。
   8. 通过加入甲醇和过氧化氢的1:1混合物5分钟来阻断内源性过氧化物酶的切片，然后用1x PBS洗涤切片三次。
   9. 使用0.5%Triton-X 100透化切片15分钟。用 1x PBS 清洗载玻片三次。
   10. 通过将切片与10%胎牛血清（FBS）在1x PBS中孵育1小时来阻断一抗的非特异性结合。
   11. 将切片与一抗在室温下孵育1小时或在4°C下孵育过夜。 用1x PBS清洗载玻片三次，每次3-5分钟以去除未结合的抗体。
   12. 加入合适的荧光染料偶联二抗并孵育45分钟。用 1x PBS 清洗载玻片三次，每次 3-5 分钟。
       注意:抗体及其各自的稀释度在 材料表中提及。使用PAX6和CHX10对视网膜类器官切片进行免疫标记，以检测早期神经视网膜前体细胞，并使用Recoverin和CRX检测承诺的视网膜和感光器前体细胞。同样，抗PAX6和抗MITF用于检测RPE前体，抗CRALBP和抗RPE65用于通过2D单层培养物的免疫细胞化学检测色素成熟RPE细胞。
   13. 用DAPI或PI对切片进行复染，并使用抗淬灭安装介质将其安装在载玻片上（参见 材料表）。
   14. 使用荧光或共聚焦激光扫描显微镜对视网膜类器官和RPE培养物的免疫标记切片进行成像和记录，以检查表达不同视网膜标志物的不同细胞层。

结果

hiPSCs分化为眼谱系是通过在不同时间点依次在含有补充剂和生长因子的不同培养基混合物中培养细胞来实现的，如图1所示。hiPSC培养物维持在Essential 8培养基（多能干细胞维持培养基）中。一旦它们达到70%-80%的汇合度（图2A），在第0天（参考步骤3.2）用含有1 ng / mL bFGF，1 ng / mL Noggin和1% N 2添加剂的分化诱导培养基（DIM）替换培养基。与神经诱导的N2补?...

讨论

hiPSCs是体外研究器官和组织发育的有力工具。通过将健康与疾病特异性hiPSC与视网膜谱系区分开来概括疾病表型，有助于获得对不同形式遗传性视网膜营养不良的病理生理学的新见解。已经描述并采用了几种方案，用于将PSCs体外分化为视网膜细胞类型。其中大多数涉及使用含有重组生长因子、补充剂、小分子和试剂的复杂混合物的培养基，例如:N1、N2 和 B27 补充剂;BMP 和 TGFβ 信号阻?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe filters	TPP	99722
15 mL centrifuge tube	TPP	91015
50 mL centrifuge tube	TPP	91050
6 well plates	TPP	92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal	Santa Cruz	SC365519	1:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal	Abcam	ab140603	1:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal	Abcam	ab3201	1:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal	Millipore	AB5585	1:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher	17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF)	Sigma Aldrich	F0291
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Coplin Jar (50 mL)	Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	354277
CryoTubes	Thermo Fisher	V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)	Thermo Fisher	10565-018
DreamTaq DNA polymerase	Thermo Fisher	EP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	14190144
Essential 8 medium kit	Thermo Fisher	A1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm	Corning	351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States	Gibco	26140079
GelDocXR+ with Image lab software	BIO-RAD		Agarose Gel documentation system
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11030	1:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546	Invitrogen	A11035	1:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1:300 dilution
HistoCore MULTICUT	Leica		For sectioning
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
L-Acsorbic acid	Sigma Aldrich	A92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
N2 supplement (100x)	Thermo Fisher	17502048
NanoDrop 2000	Thermo Fisher		To quantify RNA
Paraformaldehyde	Qualigens	23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged	Corning	7095D-9
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal	Abcam	ab183951	1:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal	Abcam	ab195045	1:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal	Abcam	ab231782	1:300 dilution
Recombinant Human Noggin Protein	R&D Systems	6057-NG
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Serological pipettes 10 mL	TPP	94010
Serological pipettes 5 mL	TPP	94005
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	S4641
Starfrost (silane coated) microscopic slides	Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	18080051
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector laboratories	H-1200
Vitronectin	Thermo Fisher	A27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)	Sigma Aldrich	Y0503
Zeiss LSM 880	Zeiss		Confocal microscope