Generazione di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo sane e specifiche per malattie retiniche

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per differenziare le hiPSC in cluster di campi oculari e generare organoidi neuro-retinici utilizzando condizioni di coltura semplificate che coinvolgono sia sistemi di coltura aderenti che in sospensione. Altri tipi di cellule oculari, come l'RPE e l'epitelio corneale, possono anche essere isolati dai campi oculari maturi nelle colture retiniche.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti possono generare organoidi tissutali complessi che sono utili per studi di modellizzazione di malattie in vitro e per lo sviluppo di terapie rigenerative. Questo protocollo descrive un metodo più semplice, robusto e graduale per generare organoidi retinici in un sistema di coltura ibrido costituito da colture monostrato aderenti durante le prime 4 settimane di differenziazione retinica fino alla comparsa di cluster primordiali del campo oculare distinti e auto-organizzati (EFP). Inoltre, le isole neuroretiniche a forma di ciambella, circolari e traslucide all'interno di ciascun EFP vengono raccolte manualmente e coltivate sotto sospensione utilizzando piatti di coltura non aderenti in un mezzo di differenziazione retinica per 1-2 settimane per generare coppette ottiche 3D multistrato (OC-1M). Questi organoidi retinici immaturi contengono PAX6+ e ChX10⁺ proliferanti, precursori retinici multipotenti. Le cellule precursori sono linearmente auto-assemblate all'interno degli organoidi e appaiono come striature radiali distinte. A 4 settimane dalla coltura in sospensione, i progenitori retinici subiscono l'arresto post-mitotico e la differenziazione del lignaggio per formare organoidi retinici maturi (OC-2M). I precursori impegnati nella linea fotorecettoriale si sviluppano all'interno degli strati più esterni degli organoidi retinici. Queste cellule fotorecettrici CRX+ e RCVRN⁺ maturano morfologicamente per mostrare estensioni simili a segmenti interni. Questo metodo può essere adottato per generare organoidi retinici utilizzando cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Tutti i passaggi e le procedure sono chiaramente spiegati e dimostrati per garantire la replicabilità e per applicazioni più ampie nella scienza di base e nella ricerca traslazionale.

Introduzione

La retina è un tessuto sensibile alla luce presente nella parte posteriore dell'occhio vertebrato che converte i segnali luminosi in impulsi nervosi da un fenomeno biochimico noto come via di foto-trasduzione. Gli impulsi nervosi iniziali generati nelle cellule fotorecettrici della retina vengono trasdotti ad altri interneuroni retinici e cellule gangliari retiniche (RGC) e raggiungono la corteccia visiva del cervello, che aiuta nella percezione dell'immagine e nella risposta visiva.

Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), circa 1,5 milioni di bambini sono ciechi, di cui 1 milione in Asia. La distrofia retinica ereditaria (IRD) è una delle principali malattie accecanti che colpisce 1 individuo su 4.000 in tutto il mondo ^1,2,3, mentre la prevalenza della cecità associata alla degenerazione maculare legata all'età (AMD) varia dallo 0,6% all'1,1% nei paesi in via di sviluppo ⁴. Le IRD sono causate da difetti genetici ereditari in oltre 300 diversi geni coinvolti nello sviluppo e nella funzione retinica⁵. Tali cambiamenti genetici provocano l'interruzione delle normali funzioni retiniche e la graduale degenerazione delle cellule retiniche, vale a dire le cellule fotorecettrici e l'epitelio pigmentato retinico (RPE), portando così a gravi perdite della vista e cecità. Sono stati fatti enormi progressi in altre condizioni di accecamento che coinvolgono la cornea, il cristallino, ecc. Tuttavia, le distrofie retiniche e le atrofie del nervo ottico non hanno alcuna terapia comprovata fino ad oggi. Poiché una retina umana adulta non dispone di cellule staminali⁶, fonti alternative come le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte derivate dal paziente (iPSC) possono fornire una fornitura illimitata dei tipi di cellule desiderati e sono molto promettenti per lo sviluppo di organoidi tissutali complessi necessari per studi di modellizzazione di malattie in vitro e per lo sviluppo di terapie rigenerative^{7, 8,9,10}.

Diversi anni di ricerca sulla retina hanno portato a una migliore comprensione degli eventi molecolari che orchestrano lo sviluppo precoce della retina. La maggior parte dei protocolli per generare cellule retiniche e organoidi 3D da PSC mirano a ricapitolare questi eventi di sviluppo in vitro, coltivando le cellule in un complesso cocktail di fattori di crescita e piccole molecole per modulare i processi biologici noti in modo graduale. Gli organoidi retinici così generati sono costituiti dalle principali cellule retiniche: cellule gangliari retiniche (RGC), interneuroni, fotorecettori ed epitelio pigmentato retinico (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Nonostante i tentativi riusciti di modellare gli IRD utilizzando organoidi retinici, la necessità del complesso cocktail di fattori di crescita e piccole molecole durante la differenziazione e l'efficienza relativamente bassa della generazione di organoidi retinici rappresenta una sfida importante per la maggior parte dei protocolli. Includono principalmente la formazione di corpi embrioidi, seguita dalla loro differenziazione graduale in linee retiniche utilizzando condizioni di coltura complesse in diversi stadi di sviluppo in vitro ^20,21,22.

Qui, viene riportato un metodo semplificato e robusto per sviluppare organoidi neuro-retinici 3D complessi da hiPSC di controllo sano e specifiche per malattie retiniche. Il protocollo qui descritto utilizza la differenziazione diretta di colture hiPSC quasi confluenti senza bisogno di formazione di corpi embrioidi. Inoltre, la complessità del terreno di coltura è semplificata, rendendolo una tecnica economica e riproducibile che può essere facilmente adottata dai nuovi ricercatori. Si tratta di un sistema di coltura ibrido costituito da colture monostrato aderenti durante le prime 4 settimane di differenziazione retinica fino alla comparsa di cluster primordiali del campo oculare distinti e auto-organizzati (EFP). Inoltre, le isole neuroretiniche circolari all'interno di ciascun EFP vengono raccolte manualmente e coltivate in colture in sospensione per 1-2 settimane per preparare coppe retiniche 3D multistrato o organoidi costituiti da precursori neuro-retinici proliferanti PAX6+ e CHX10⁺. La coltura estesa di organoidi retinici in terreno contenente taurina da 100 μM per ulteriori 4 settimane ha portato alla comparsa di precursori dei fotorecettori RCVRN+ e CRX⁺ e cellule mature con estensioni rudimentali simili a segmenti interni.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che coinvolgono hiPSC sono stati condotti in modo asettico, in aderenza alle pratiche di laboratorio standard, alle linee guida etiche e di biosicurezza e con l'approvazione di organismi di regolamentazione come il Comitato etico istituzionale (IEC), il Comitato istituzionale per la ricerca sulle cellule staminali (IC-SCR) e il Comitato istituzionale per la biosicurezza (IBSC).

1. Preparazione di coltura iPSC e terreno di differenziazione retinica e reagenti

1. Coltura iPSC e terreno di manutenzione
   1. Coltura e mantenimento della normale linea hiPSC²³ (hiPSC-F2-3F1) e di una linea CRISPR modificata, RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, con delezione biallelica, frameshift di 10 bp all'interno dell'esone 18 del gene umano RB1) in mezzo Essential 8 su piastre di coltura rivestite con matrigel (membrana basale rivestita; vedi Tabella dei materiali) in condizioni di coltura prive di alimentatore.
      NOTA: Questo protocollo può essere reso totalmente privo di xeno sostituendo la matrice della membrana basale con il rivestimento di vitronectina ricombinante (VTN-N). Preparare il mezzo completo Essential 8 aggiungendo 50x Essential 8 supplemento (fornito con il kit medio Essential 8; vedere Tabella dei materiali) e 100 U / mL Penicillina-Streptomycin soluzioni. In alternativa, le hiPSC possono anche essere coltivate utilizzando il mezzo mTeSR1 completo.
2. Soluzione di dissociazione cellulare (1x CDS)
   1. Per una dissociazione e un passaggio senza enzimi delle iPSC umane, preparare il CDS contenente 0,5 mM EDTA, pH 8,0 e 30 mM NaCl in 1x soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) (vedere Tabella dei materiali).
   2. Per preparare 100 mL di 1x CDS, aggiungere 100 μL di 0,5M EDTA e 1 mL di 3 M NaCl soluzioni madre a 99 mL di 1x DPBS, mescolare bene e filtrare sterilizzando utilizzando un filtro da 0,22 μm.
3. Differenziazione Induction Medium (DIM)
   1. Preparare DIM utilizzando DMEM-F12 terreno basale integrato con 10% Knockout Serum Replacement (KOSR), 1x Non-Essential Amino Acid (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/mL Penicillina-Streptomycin, 200 μM di acido L-ascorbico e 1% di integratore N2 (vedere Tabella dei materiali).
4. Mezzo di differenziazione retinica (RDM)
   1. Preparare RDM utilizzando DMEM-F12 terreno basale integrato con 10% Knockout Serum (KOSR), 1x Non-Essential Amino Acid (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/mL Penicillina-Streptomycin, 200 μM di acido L-ascorbico e 2% di integratore B27 (con vitamina A) (vedi Tabella dei materiali).
5. Superfici di coltura cellulare rivestite di matrice extracellulare
   1. Scongelare la matrice di membrana basale qualificata hESC per una notte in un secchiello del ghiaccio, preferibilmente all'interno di un frigorifero a 4-8 °C. Diluire lo stock di matrice 100x scongelato (5 ml) in rapporto 1:5 aggiungendo 20 mL di mezzo basale DMEM-F12 ghiacciato e mescolare ruotando delicatamente per preparare una soluzione madre 20x.
      1. Preparare 0,5 mL di aliquote su ghiaccio utilizzando puntali per pipette pre-refrigerati e provette sterili per microcentrifuga. Etichettare i flaconcini come 20x stock e conservarli congelati in un congelatore a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
   2. Per rivestire le superfici della coltura cellulare (piastre di coltura o piastre a 6 pozzetti), scongelare un'aliquota di matrice 20x sul ghiaccio e diluirla in un rapporto di 1:20 utilizzando il terreno basale DMEM-F12 ghiacciato per preparare 10 ml di soluzione di rivestimento a matrice 1x, sufficiente per rivestire un piatto da 100 mm o una piastra a 6 pozzetti (1,5 ml / pozzetto).
      NOTA: Preraffreddare le pipette/micropunte aspirando DPBS ghiacciato e sterile prima di maneggiare la soluzione della matrice. Lo scongelamento e tutta la manipolazione della matrice devono essere effettuati su ghiaccio, utilizzando pipette/micropunte pre-refrigerate per evitare la polimerizzazione e la gelificazione a temperatura ambiente.
   3. Aggiungere 1,5 ml di 1x soluzione di rivestimento a matrice a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, ruotare delicatamente la piastra per garantire un rivestimento uniforme e incubare le piastre a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ . Lasciare le piastre indisturbate per un minimo di 1 h per garantire un rivestimento uniforme della matrice sulle superfici di coltura.
   4. Prima di seminare le celle, aspirare la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta sterile da 5 ml ed eliminare i rifiuti liquidi. Aggiungere immediatamente terreno di coltura fresco (2 ml / pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) e seminare le cellule ad una densità di 150.000-200.000 cellule / pozzetto. Non lasciare asciugare le piastre durante la manipolazione.
      NOTA: In alternativa, il rivestimento di vitronectina ricombinante (VTN-N) a una concentrazione finale di 0,5 μg/ml può essere utilizzato per un protocollo di coltura privo di xeno.

2. Stabilire colture iPSC umane

1. Scongelamento e rinascita delle hiPSC
   1. Rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1x soluzione di matrice a membrana. Incubare a 37 °C per 1 ora per consentire la polimerizzazione e il rivestimento uniforme della superficie di coltura.
   2. Dopo 1 ora di incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento e aggiungere 1 mL di terreno completo Essential 8 preriscaldato contenente 10 μM di inibitore della Rho-chinasi, Y-27632 (1 μL/mL di 10 mM di stock; vedere Tabella dei materiali), prima di ravvivare nuovamente le cellule.
   3. Rimuovere uno stock crioviale hiPSC (1 x 10⁶ celle/flaconcino) dal contenitore di azoto liquido. Scongelare rapidamente il crioviale a bagnomaria a 37 °C con un leggero vortice.
      NOTA: Non scongelare completamente il flaconcino; Annotare il numero di passaggio, sterilizzare la fiala in superficie e asciugarla con un tampone privo di lanugine contenente alcol isopropilico al 70%.
   4. Utilizzando una punta sterile per pipetta da 1 ml, aspirare il contenuto crioviale in una provetta fresca da 15 mL costituita da 2 ml di terreno completo Essential 8 preriscaldato senza Y-27632. Centrifugare il tubo a 1.000 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
   5. Risospendere il pellet cellulare in 1,0 mL di mezzo completo Essential 8 contenente 10 μM Y-27632.
   6. Aggiungere questa sospensione cellulare sulle superfici rivestite di matrice senza disturbare la matrice erogandola lungo le pareti. Scuotere delicatamente la piastra trasversalmente per garantire la distribuzione uniforme delle celle.
   7. Incubare le piastre a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per consentire alle cellule di aderire e iniziare a proliferare.
   8. Dopo 12-24 ore, sostituire il mezzo esaurito e mantenere le colture in mezzo completo preriscaldato Essential 8 senza Y-27632.
   9. Cambia il terreno di coltura ogni 24 ore e passa le culture una volta raggiunta la confluenza del 70% -80%.
      NOTA: Un rapporto di divisione di 1:6 viene seguito di routine per le colture hiPSC e viene fatto passare a intervalli regolari di 3-4 giorni.
2. Passaging e placcatura delle hiPSC per avviare la differenziazione della linea retinica
   1. Aspirare il mezzo esaurito dal 70% all'80% di colture iPSC umane confluenti in piastre a 6 pozzetti.
   2. Aggiungere 1 mL di CDS (fase 1.2) a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 5-7 minuti fino a quando le cellule non si arrotondano. Rimuovere con cautela il CDS, facendo attenzione a non staccare le cellule, e aggiungere 2 ml di terreno fresco Essential 8 e triturare delicatamente con una pipetta.
   3. Raccogliere la sospensione cellulare da un pozzetto di una piastra a 6 celle in un tubo da centrifuga da 15 ml e ruotare il tubo a 1.000 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
   4. Risospendere il pellet cellulare in 1,2 mL di terreno Essential 8 ed erogare 200 μL della cella 200μL della sospensione cellulare (rapporto di divisione 1:6) in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti rivestita di matrice contenente 1,5 ml di terreno di coltura iPSC contenente 10 μM Y-27632, come descritto al punto 1.5.
   5. Dopo 12-24 ore, sostituire il mezzo esaurito e mantenere le colture in mezzo completo preriscaldato Essential 8 senza Y-27632.
   6. Cambia il terreno di coltura ogni 24 ore fino a quando le colture raggiungono il 70% -80% di confluenza.

3. Differenziazione delle hiPSCs in campi oculari e linea retinica

NOTA: nella Figura 1 è illustrato uno schema schematico del processo di differenziazione.

1. Avviare la procedura di differenziazione una volta che le colture hiPSC raggiungono il 70%-80% di confluenza.
2. Il giorno 0, cambiare il mezzo di mantenimento hiPSC in DIM (fase 1.3) contenente 1 ng/mL bFGF e 1 ng/mL Noggin. Aggiungere 2,0 ml di terreno per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e mantenere le celle a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ .
   NOTA: La sospensione graduale di bFGF induce la differenziazione delle PSCs e l'aggiunta di concentrazioni crescenti di Noggin (inibitore di diversi BMP) durante le fasi iniziali induce differenziazione della linea ectodermica e nevralizzazione^11,12 e blocca l'impegno del mesoderma e dell'endoderma. In alternativa, Noggin può essere sostituito da LDN193189. A differenza della strategia di doppia inibizione SMAD riportata in precedenza^20,21, questo protocollo non richiede l'aggiunta di Activin o SB-431542.
3. Il giorno 1, cambiare il mezzo esaurito e aggiungere DIM contenente 1 ng/mL bFGF e 10 ng/mL Noggin. Aggiungere 2,0 ml per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare e mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ .
4. Nei giorni 2-3, rimuovere il mezzo esaurito e aggiungere DIM contenente solo 10 ng/mL di Noggin. Aggiungere 2,0 ml per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e cambiare il mezzo ogni 24 ore. Incubare e mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ .
   NOTA: Preriscaldare sempre il terreno di coltura a 30-37 °C prima dell'uso. L'eccesso di miodesopsie e cellule morte può essere osservato nelle colture di differenziazione precoce. In tali condizioni, lavare le colture una volta con 1x DPBS e aggiungere il mezzo di differenziazione retinica. I test di sterilità sul mezzo esaurito possono essere eseguiti settimanalmente o secondo necessità.
5. Il giorno 4, rimuovere il mezzo esaurito e aggiungere l'RDM (passaggio 1.4). Aggiungere 2,0 ml per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e continuare a mantenere le colture in RDM a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ , con un nuovo cambio di terreno ogni giorno.
   NOTA: In alternativa, le PSC possono essere coltivate come colture in sospensione dal giorno 1-3, in piastre a 96 pozzetti non aderenti e a fondo arrotondato, ad una densità cellulare di 5 x 10³ cellule/100 μL/pozzetto per formare corpi embrioidi (EB) in condizioni di coltura identiche in DIM. GLI EB ben formati il giorno 4 possono essere placcati su piastre rivestite di matrice contenenti RDM e possono aderire, proliferare e differenziarsi come descritto di seguito.
6. Intorno al giorno 14-18, osservare le colture al microscopio con un ingrandimento 10x per l'emergere di domini simili a rosette neurali costituiti da progenitori del campo oculare precoce (Figura 2B).
7. Intorno al giorno 21-28 (3-4 settimane), osservare le colture al microscopio con ingrandimento 4x e 10x per osservare l'emergere di EFP auto-organizzate e distinte, con un'isola centrale di strutture neuro-retiniche 3D circolari circondate da escrescenze contigue di epitelio neurologico ed epitelio di superficie oculare (Figura 2C, D).
   NOTA: Si possono osservare circa 20-30 EFP per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti di una normale coltura di differenziazione retinica hiPSC. Questo numero può variare con altre linee hiPSC specifiche della malattia, in base al loro background genetico e al potenziale di differenziazione della linea retinica.

4. Raccolta di organoidi retinici

1. Trascinamento a fiamma delle pipette Pasteur in vetro per il prelievo manuale delle coppe retiniche.
   NOTA: Utilizzare pipette Pasteur in vetro sterilizzato e sterilizzato per il prelievo del campo oculare.
   1. Accendere un bruciatore Bunsen. Prendi una pipetta Pasteur sterile e tieni la base in una mano e la punta capillare nell'altra. Fiamma sterilizzare e riscaldare la regione vicino al centro della punta capillare, con movimenti rotazionali fino a quando il vetro diventa flessibile. Quindi allontanarsi dalla fiamma e tirare rapidamente verso l'esterno per creare una punta capillare fine con un lume chiuso.
   2. Tenere la punta sottile orizzontalmente davanti alla fiamma e passarla rapidamente attraverso la fiamma con un movimento verso l'esterno per creare un gancio liscio o una punta capillare a forma di L.
   3. Utilizzare la zona di curvatura esterna liscia del gancio capillare come un misurino sottile per sollevare delicatamente e staccare le coppe neuroretiniche intatte dai cluster EFP.
      NOTA: L'angolo liscio del gancio capillare in vetro non provoca danni alle cellule né crea graffi sulle superfici di coltura. Questo semplice strumento può anche essere efficacemente utilizzato per la suddivisione delle singole colonie hiPSC in schemi di griglia e per passarli come piccoli cluster di cellule durante l'espansione clonale.
2. Coltura e mantenimento di coppe retiniche per generare organoidi retinici 3D.
   1. Al giorno 25-30, aggiungere 4,0 ml di terreno di differenziazione retinica preriscaldato in un piatto da 60 mm a basso attacco prima di preparare la raccolta delle coppette neuro-retiniche.
   2. Lavora al microscopio stereo con un ingrandimento di 0,63x-4,5x per osservare e selezionare manualmente coppe neuroretiniche ben formate da singoli EFP.
      NOTA: L'aspetto delle escrescenze delle cellule RPE pigmentate aiuta nella facile identificazione delle EFP e delle coppette neuroretiniche posizionate centralmente. Le coppe retiniche appaiono come strutture 3D a forma di ciambella, circolari e traslucide, con striature radiali chiare, formate dalle cellule staminali retiniche disposte linearmente e autoassemblate, al contrario dei cluster strettamente impacchettati e sferici o irregolari formati dai neuroni del SNC o dalle cellule della cresta neurale²³.
   3. Utilizzare i ganci per pipette Pasture tirati a fiamma per spingere delicatamente e raccogliere l'isola neuro-retinica centrale all'interno dei singoli EFP.
   4. Impostare una micropipetta da 1 mL per aspirare 100 μL e utilizzare 1 mL di micropunte con ampie aperture per aspirare e trasferire le coppette retiniche galleggianti nelle piastre di coltura fresche e poco aderenti preparate al punto 4.2.1.
      NOTA: L'uso di punte con una dimensione del foro più piccola e una pressione di aspirazione più elevata può causare il taglio e influire sull'integrità delle coppette retiniche. Le dimensioni approssimative delle coppe retiniche hanno un diametro di circa 1-2 mm.
   5. Mantenere le coppe retiniche in RDM come colture di sospensione non aderenti e incubarle a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ .
   6. Giorno 30-45: Cambiare il mezzo ogni giorno inclinando delicatamente il piatto e lasciando che le coppette retiniche si depositino per circa 30 secondi. Seguire un metodo di alimentazione parziale, rimuovendo metà volumi di mezzo esaurito e sostituendo con volumi uguali di mezzo fresco.
      NOTA: Evitare ripetute aspirazioni e trasferimenti per evitare danni alle coppe retiniche. Dopo 1-2 settimane di coltura in sospensione, le coppe retiniche crescono leggermente di dimensioni (1-3 mm) e si sviluppano in organoidi retinici 3D auto-organizzati (OC-1M) costituiti da progenitori neuro-retinici precoci disposti linearmente che esprimono PAX6 e CHX10 (Figura 3Bi).
   7. Giorno 45-60: Coltura degli organoidi retinici per ulteriori 4 settimane in RDM contenente 100 μM di Taurina (vedi Tabella dei Materiali) per supportare una migliore sopravvivenza e differenziazione del lignaggio dei progenitori neuro-retinici e lo sviluppo di cellule retiniche mature (OC-2M).
      NOTA: Circa il 70%-80% delle coppette retiniche o ottiche prelevate dalle EFP rimangono intatte, mantengono la loro laminazione e si sviluppano in organoidi retinici maturi dopo 4 settimane di coltura in sospensione (OC-2M).
   8. Verificare che gli organoidi retinici maturi a 4 settimane di coltura in sospensione mostrino l'emergere di precursori dei fotorecettori RCVRN+ e CRX+ e cellule mature con un'estensione rudimentale simile a un segmento interno negli strati cellulari più esterni, ricapitolando così il normale processo di sviluppo e maturazione retinica in vitro (Figura 3Bii).
      NOTA: Dopo aver rimosso le coppette neuro-retiniche, le colture di differenziazione possono essere mantenute continuamente in RDM. Le escrescenze epiteliali prossimali che circondano la neuro-retina contengono precursori delle cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE), che si espandono ulteriormente e maturano per formare monostrati RPE pigmentati con tipica morfologia di ciottoli (Figura 4). Le escrescenze distali sono costituite prevalentemente da epitelio di superficie oculare che contribuisce al cristallino eall'epitelio corneale. I tipi di cellule desiderati possono essere raccolti da diverse zone di escrescenze EFP e arricchiti ulteriormente per stabilire colture pure.

5. Caratterizzazione degli organoidi retinici

1. Caratterizzazione morfologica e molecolare
   1. Osservare le EFP aderenti e gli organoidi retinici galleggianti al microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 4x e 10x e documentarne la morfologia e le dimensioni.
   2. Raccogliere circa 20 organoidi retinici in diversi stadi di maturazione (fasi 4.2.3-4.2.6) in provette da microcentrifuga da 1,5 ml utilizzando punte larghe da 1.000 μL. Lasciare che gli organoidi si depositino sul fondo e aspirare il mezzo. Lavare le tazze con 1x PBS.
   3. Rimuovere il PBS in eccesso e aggiungere 1,0 mL di reagente TRIzol (vedere Tabella dei materiali). Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Omogeneizzare il tessuto usando un pestello a tubo e triturare usando una pipetta da 1,0 ml.
   4. Preparare l'RNA totale seguendo il metodo standard del reagente di isolamento e purificazione dell'RNA, secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
   5. Controllare la qualità dell'RNA sul gel di agarosio e quantificarla utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop (vedi Tabella dei materiali).
   6. Convertire 1-2 μg di RNA totale in cDNA utilizzando l'enzima trascrittasi inversa secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Vedere la Tabella 1 per un elenco di primer gene-specifici.
   7. Preparare brevemente la miscela master RNA-primer in 10 μL di volume totale come indicato nella Tabella 2 e incubare la provetta a 65 °C per 5 minuti in un termociclatore. Trasferire il tubo dal termociclatore al ghiaccio per 2 minuti.
   8. Nel frattempo, preparare la master mix 2 con i reagenti menzionati nella tabella 3. Aggiungere questa miscela master al tubo di miscela RNA-primer preparato al punto 5.1.7. Mescolare delicatamente.
   9. Incubare il campione a 50 °C per 50 minuti, quindi a 85 °C per 5 minuti, quindi tenere premuto a 4 °C per interrompere la reazione.
   10. Utilizzare il cDNA sintetizzato come modello nelle reazioni PCR per verificare l'espressione del progenitore neuro-retinico e dei marcatori delle cellule retiniche mature.
   11. Normalizzare i modelli totali di cDNA di ciascun campione, vale a dire F2-UD (hiPSC-F2-3F1; cellule indifferenziate), OC-1M (coppa ottica di 1 settimana in coltura in sospensione) e OC-2M (coppa ottica di 4 settimane in coltura di sospensione) mediante PCR semi-quantitativa utilizzando i geni housekeeping come hE1fα o GAPDH.
   12. Preparare la miscela master per la PCR semiquantitativa, come menzionato nella Tabella 4, e posizionare le provette per l'amplificazione in un termociclatore. Le condizioni di amplificazione della PCR sono menzionate nella Tabella 5.
2. Istologia e immunoistochimica
   1. Raccogliere i bicchieri ottici in una provetta da microcentrifuga da 2,0 mL e aspirare il mezzo in eccesso (punti 4.2.3-4.2.6). Risciacquare gli organoidi con 1x PBS e poi lavarli e sospenderli in 500 μL di Paraformaldeide al 4% per fissarli durante la notte a temperatura ambiente.
   2. Il giorno dopo, lavare le tazze in acqua deionizzata. Lasciare riposare le tazze in alcool al 95% (tre cambi, 15-20 minuti ciascuno), seguiti da alcol al 100% (tre cambi, 15-20 minuti ciascuno), un mix 1: 1 di alcol assoluto e xilene per 15 minuti, xilene (due cambi, 15 minuti ciascuno) e paraffina (tre cambi, 15 minuti ciascuno). Incorporare questo tessuto per preparare un blocco di paraffina seguendo le procedure standard. Lasciare raffreddare e solidificare.
   3. Preparare sezioni sottili (~4-5 μm di spessore) utilizzando un microtomo e posizionarle su vetrini microscopici rivestiti di silano (vedi Tabella dei materiali) seguendo le procedure istologiche standard.
   4. Per la deparaffinizzazione, riscaldare i vetrini a 70 °C su un blocco riscaldante per 15-20 minuti. Una volta che la cera si scioglie, lavare i vetrini con xilene (tre cambi, 3-4 min ciascuno), che rimuoverà completamente la paraffina.
      NOTA: La rimozione incompleta della paraffina provoca una colorazione scadente / irregolare delle sezioni con un'enorme quantità di rumore di fondo.
   5. Reidratare i vetrini utilizzando diverse percentuali di etanolo (100%, 90% e 80%) per 3 minuti ciascuno. Risciacquare i vetrini con acqua distillata e procedere con il recupero dell'antigene.
   6. Prima di iniziare il recupero dell'antigene, preriscaldare il tampone citrato (pH 6,0) in un barattolo Coplin (vedi Tabella dei materiali) utilizzando un forno a microonde fino a raggiungere 95-100 °C.
   7. Immergere i vetrini in un tampone citrato preriscaldato e riscaldare il barattolo per 15 minuti in un forno a microonde. Togliere il barattolo Coplin dal forno e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
   8. Bloccare le sezioni per la perossidasi endogena aggiungendo una miscela 1:1 di metanolo e perossido di idrogeno per 5 minuti, quindi lavare le sezioni tre volte con 1x PBS.
   9. Permeabilizzare le sezioni utilizzando Triton-X 100 allo 0,5% per 15 minuti. Lavare le diapositive tre volte con 1x PBS.
   10. Bloccare il legame aspecifico dell'anticorpo primario incubando le sezioni con siero bovino fetale (FBS) al 10% in 1x PBS per 1 ora.
   11. Incubare le sezioni con anticorpo primario per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. Lavare i vetrini tre volte con 1x PBS per 3-5 minuti ciascuno per rimuovere l'anticorpo non legato.
   12. Aggiungere un anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente adatto e incubare per 45 minuti. Lavare i vetrini tre volte con 1x PBS per 3-5 minuti ciascuno.
       NOTA: Gli anticorpi e le rispettive diluizioni sono menzionati nella Tabella dei Materiali. Le sezioni organoidi retiniche sono state immunomarcate utilizzando PAX6 e CHX10 per rilevare le prime cellule precursori della neuro-retina e utilizzando Recoverin e CRX per rilevare cellule precursori della retina e dei fotorecettori impegnate. Allo stesso modo, anti-PAX6 e anti-MITF sono stati utilizzati per rilevare i precursori RPE e anti-CRALBP e anti-RPE65 sono stati utilizzati per rilevare cellule RPE mature pigmentate mediante immunocitochimica di colture monostrato 2D.
   13. Controcolorare le sezioni con DAPI o PI e montarle su un vetrino utilizzando il supporto di montaggio antidissolvenza (vedere Tabella dei materiali).
   14. Immagine e documentazione delle sezioni immunomarcate di organoidi retinici e colture RPE utilizzando un microscopio a fluorescenza o a scansione laser confocale per esaminare diversi strati cellulari che esprimono diversi marcatori retinici.

Risultati

La differenziazione delle hiPSCs in linee oculari si ottiene coltivando le cellule in diversi cocktail di terreno di coltura contenenti integratori e fattori di crescita in fasi sequenziali in diversi punti temporali, come descritto nella Figura 1. Le colture hiPSC sono mantenute nel mezzo Essential 8, il mezzo di mantenimento delle cellule staminali pluripotenti. Una volta raggiunta la confluenza del 70%-80% (Figura 2A), il mezzo viene sostituito con il mezzo d...

Discussione

Le hiPSC sono un potente strumento per studiare lo sviluppo di organi e tessuti in vitro. Ricapitolare il fenotipo della malattia differenziando le hiPSC sane rispetto a quelle specifiche della malattia verso la linea retinica può aiutare a ottenere nuove conoscenze sulla fisiopatologia di diverse forme di distrofie retiniche ereditarie. Diversi protocolli sono stati descritti e adottati per la differenziazione in vitro delle PSC in tipi di cellule retiniche. La maggior parte di essi prevede l'uso di t...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe filters	TPP	99722
15 mL centrifuge tube	TPP	91015
50 mL centrifuge tube	TPP	91050
6 well plates	TPP	92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal	Santa Cruz	SC365519	1:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal	Abcam	ab140603	1:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal	Abcam	ab3201	1:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal	Millipore	AB5585	1:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher	17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF)	Sigma Aldrich	F0291
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Coplin Jar (50 mL)	Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	354277
CryoTubes	Thermo Fisher	V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)	Thermo Fisher	10565-018
DreamTaq DNA polymerase	Thermo Fisher	EP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	14190144
Essential 8 medium kit	Thermo Fisher	A1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm	Corning	351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States	Gibco	26140079
GelDocXR+ with Image lab software	BIO-RAD		Agarose Gel documentation system
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11030	1:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546	Invitrogen	A11035	1:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1:300 dilution
HistoCore MULTICUT	Leica		For sectioning
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
L-Acsorbic acid	Sigma Aldrich	A92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
N2 supplement (100x)	Thermo Fisher	17502048
NanoDrop 2000	Thermo Fisher		To quantify RNA
Paraformaldehyde	Qualigens	23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged	Corning	7095D-9
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal	Abcam	ab183951	1:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal	Abcam	ab195045	1:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal	Abcam	ab231782	1:300 dilution
Recombinant Human Noggin Protein	R&D Systems	6057-NG
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Serological pipettes 10 mL	TPP	94010
Serological pipettes 5 mL	TPP	94005
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	S4641
Starfrost (silane coated) microscopic slides	Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	18080051
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector laboratories	H-1200
Vitronectin	Thermo Fisher	A27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)	Sigma Aldrich	Y0503
Zeiss LSM 880	Zeiss		Confocal microscope