Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina

Resumo

Este protocolo descreve um método eficiente de diferenciar hiPSCs em clusters de campos oculares e gerar organoides neuro-retinianos usando condições de cultura simplificadas envolvendo sistemas de cultura aderentes e de suspensão. Outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano, também podem ser isolados de campos oculares maduros em culturas de retina.

Resumo

Células-tronco pluripotentes podem gerar organoides teciduais complexos que são úteis para estudos de modelagem de doenças in vitro e para o desenvolvimento de terapias regenerativas. Este protocolo descreve um método mais simples, robusto e gradual de geração de organoides da retina em um sistema híbrido de cultura consistindo de culturas aderentes de monocamadas durante as primeiras 4 semanas de diferenciação retiniana até o surgimento de grupos primordiais de campo ocular (PFEs) distintos e auto-organizados. Além disso, as ilhas neurorretinianas em forma de rosca, circulares e translúcidas dentro de cada EFP são manualmente colhidas e cultivadas sob suspensão usando placas de cultura não aderentes em um meio de diferenciação retiniana por 1-2 semanas para gerar copos ópticos 3D multicamadas (OC-1M). Estes organoides imaturos da retina contêm precursores multipotentes da retina com proliferação de PAX6⁺ e ChX10⁺. As células precursoras são linearmente auto-organizadas dentro dos organoides e aparecem como estrias radiais distintas. Após 4 semanas da cultura de suspensão, os progenitores da retina sofrem parada pós-mitótica e diferenciação de linhagens para formar organoides retinianos maduros (OC-2M). Os precursores comprometidos da linhagem fotorreceptora desenvolvem-se dentro das camadas mais externas dos organoides da retina. Essas células fotorreceptoras CRX+ e RCVRN⁺ amadurecem morfologicamente para exibir extensões segmentares internas. Este método pode ser adotado para a geração de organoides da retina usando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Todas as etapas e procedimentos são claramente explicados e demonstrados para garantir a replicabilidade e para aplicações mais amplas em ciência básica e pesquisa translacional.

Introdução

A retina é um tecido sensível à luz presente na parte de trás do olho do vertebrado que converte sinais luminosos em impulsos nervosos por um fenômeno bioquímico conhecido como via de fototransdução. Os impulsos nervosos iniciais gerados nas células fotorreceptoras da retina são transduzidos para outros interneurônios da retina e células ganglionares da retina (RGCs) e atingem o córtex visual do cérebro, o que ajuda na percepção da imagem e na resposta visual.

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que 1,5 milhão de crianças sejam cegas, das quais 1 milhão estão na Ásia. A distrofia hereditária da retina (DIR) é uma importante doença cegante que afeta 1 em cada 4.000 indivíduos em todo o mundo ^1,2,3, enquanto a prevalência de cegueira associada à degeneração macular relacionada à idade (DMRI) varia de 0,6%-^1,1% em países em^{desenvolvimento4}. Os IRDs são causados por defeitos genéticos hereditários em mais de 300 genes diferentes envolvidos no desenvolvimento e função da retina⁵. Tais alterações genéticas resultam na interrupção das funções normais da retina e na degeneração gradual das células da retina, nomeadamente as células fotorreceptoras e o epitélio pigmentado da retina (EPR), levando assim a uma grave perda de visão e cegueira. Enormes progressos foram feitos em outras condições de cegamento envolvendo a córnea, lente, etc. No entanto, distrofias retinianas e atrofias do nervo óptico não têm nenhuma terapia comprovada até o momento. Uma vez que a retina humana adulta não possui células-tronco⁶, fontes alternativas como células-tronco embrionárias (CTEs) e células-tronco pluripotentes induzidas derivadas do paciente (iPSCs) podem fornecer um suprimento ilimitado de tipos celulares desejados e ser uma grande promessa para o desenvolvimento de organoides teciduais complexos necessários para estudos de modelagem de doenças in vitro e para o desenvolvimento de terapias regenerativas^{7, 8,9,10}.

Vários anos de pesquisa na retina levaram a uma melhor compreensão dos eventos moleculares que orquestram o desenvolvimento inicial da retina. A maioria dos protocolos para gerar células da retina e organoides 3D a partir de PSCs visa recapitular esses eventos de desenvolvimento in vitro, cultivando as células em um complexo coquetel de fatores de crescimento e pequenas moléculas para modular os processos biológicos conhecidos de forma escalonada. Os organoides da retina assim gerados são constituídos pelas principais células da retina: células ganglionares da retina (CGRs), interneurônios, fotorreceptores e epitélio pigmentado da retina (EPR)11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Apesar das tentativas bem-sucedidas de modelar IRDs usando organoides da retina, a exigência do complexo coquetel de fatores de crescimento e pequenas moléculas durante a diferenciação e a eficiência relativamente baixa da geração de organoides da retina representam um grande desafio com a maioria dos protocolos. Incluem principalmente a formação de corpos embrionários, seguida de sua diferenciação gradual em linhagens retinianas utilizando condições complexas de cultura em diferentes estágios de desenvolvimento in vitro ^20,21,22.

Aqui, um método simplificado e robusto de desenvolvimento de organoides neuro-retinianos 3D complexos a partir de controle saudável e hiPSCs específicas da doença da retina é relatado. O protocolo aqui descrito utiliza a diferenciação direta de culturas de hiPSC quase confluentes sem a necessidade de formação de corpo embrionário. Além disso, a complexidade do meio de cultura é simplificada, tornando-o uma técnica custo-efetiva e reprodutível que pode ser facilmente adotada por novos pesquisadores. Envolve um sistema híbrido de cultura que consiste em culturas aderentes de monocamadas durante as primeiras 4 semanas de diferenciação retiniana até o surgimento de grupos primordiais de campos oculares (PFEs) distintos e auto-organizados. Além disso, as ilhas neuro-retinianas circulares dentro de cada EFP são colhidas manualmente e cultivadas em culturas de suspensão por 1-2 semanas para preparar copos de retina 3D multicamadas ou organoides consistindo de precursores neuro-retinais de proliferação PAX6+ e CHX10⁺. A cultura prolongada de organoides da retina em meio contendo taurina 100 μM por mais 4 semanas resultou no surgimento de precursores fotorreceptores ^RCVRN+ e CRX⁺ e células maduras com extensões rudimentares semelhantes a segmentos internos.

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo hiPSCs foram realizados de forma asséptica, em aderência às práticas laboratoriais padrão, diretrizes éticas e de biossegurança, e com as aprovações de órgãos reguladores como o Comitê de Ética Institucional (IEC), Comitê Institucional de Pesquisa com Células-Tronco (IC-SCR) e Comitê Institucional de Biossegurança (IBSC).

1. Preparo de cultura iPSC e meio de diferenciação retiniana e reagentes

1. Cultura iPSC e meio de manutenção
   1. Cultivar e manter a linha hiPSC normal²³ (hiPSC-F2-3F1) e uma linha CRISPR editada, RB1-/- hiPSC (LVIP15-RB1-CS3, com deleção bialélica, frameshift de 10 pb dentro do éxon 18 do gene RB1 humano) em meio Essential 8 em placas de cultura revestidas com matrigel (matriz de membrana basal; ver Tabela de Materiais) em condições de cultura livres de alimentador.
      NOTA: Este protocolo pode ser totalmente livre de xeno, substituindo a matriz da membrana basal pelo revestimento de vitronectina recombinante (VTN-N). Prepare o meio Essential 8 completo adicionando 50x suplemento Essential 8 (fornecido com o kit médio Essential 8; ver Tabela de Materiais) e 100 U/mL de soluções de penicilina-estreptomicina. Alternativamente, as hiPSCs também podem ser cultivadas usando o meio mTeSR1 completo.
2. Solução de dissociação celular (1x CDS)
   1. Para uma dissociação livre de enzimas e passagem de iPSCs humanas, prepare o CDS contendo 0,5 mM de EDTA, pH 8,0 e 30 mM de NaCl em 1x solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco (ver Tabela de Materiais).
   2. Para preparar 100 mL de 1x CDS, adicionar 100 μL de EDTA 0,5M e 1 mL de soluções estoque de NaCl 3 M a 99 mL de 1x DPBS, misturar bem e esterilizar filtrando usando um filtro de 0,22 μm.
3. Meio de Indução de Diferenciação (DIM)
   1. Preparar DIM usando DMEM-F12 Meio Basal suplementado com 10% de Reposição de Soro Nocaute (KOSR), 1x Aminoácidos Não Essenciais (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/mL de Penicilina-Estreptomicina, 200 μM de ácido L-Ascórbico e 1% de suplemento de N2 (ver Tabela de Materiais).
4. Meio de Diferenciação Retiniana (RDM)
   1. Preparar RDM usando DMEM-F12 Meio Basal suplementado com 10% de Knockout Serum (KOSR), 1x Aminoácidos Não Essenciais (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/mL de Penicilina-Estreptomicina, 200 μM de ácido L-Ascórbico e 2% de suplemento B27 (com vitamina A) (ver Tabela de Materiais).
5. Superfícies de cultura celular revestidas com matriz extracelular
   1. Descongele a matriz da membrana basal qualificada para hESC durante a noite em um balde de gelo, de preferência dentro de uma geladeira a 4-8 °C. Diluir o estoque de matriz descongelado de 100x (5 mL) na proporção de 1:5 adicionando 20 mL de meio basal DMEM-F12 gelado e misturar por turbilhão suave para preparar uma solução-mãe de 20x.
      1. Preparar alíquotas de 0,5 mL sobre gelo usando pontas de pipeta pré-resfriadas e tubos de microcentrífuga estéreis. Rotule os frascos como estoques de 20x e armazene-os congelados em um freezer de -80 °C por até 6 meses.
   2. Para o revestimento das superfícies de cultura celular (placas de cultura ou placas de 6 poços), descongelar uma alíquota de matriz de 20x sobre gelo e diluí-la na proporção de 1:20 usando meio basal DMEM-F12 gelado para preparar 10 mL de solução de revestimento de matriz 1x, o que é suficiente para revestir uma placa de 100 mm ou uma placa de 6 poços (1,5 mL/poço).
      NOTA: Pré-resfriar as pipetas/micropontas aspirando DPBS geladas e estéreis antes de manusear a solução matricial. O descongelamento e todo o manuseio da matriz devem ser feitos em gelo, utilizando-se pipetas/micropontas pré-resfriadas para evitar polimerização e gelificação em temperatura ambiente.
   3. Adicione 1,5 mL de solução de revestimento de matriz 1x a cada poço de uma placa de 6 poços, gire suavemente a placa para garantir um revestimento uniforme e incube as placas a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5%. Deixar as placas intactas por um mínimo de 1 h para garantir um revestimento uniforme da matriz nas superfícies de cultura.
   4. Antes de semear as células, aspirar a solução de revestimento usando uma pipeta estéril de 5 mL e descartar os resíduos líquidos. Adicionar imediatamente o meio de cultura fresco (2 mL/poço de uma placa de 6 poços) e semear as células a uma densidade de 150.000-200.000 células/poço. Não deixe as placas secarem durante o manuseio.
      NOTA: Alternativamente, o revestimento de vitronectina recombinante (VTN-N) em uma concentração final de 0,5 μg/mL pode ser usado para um protocolo de cultura livre de xeno.

2. Estabelecimento de culturas iPSC humanas

1. Descongelamento e renascimento de hiPSCs
   1. Revestir um poço de uma placa de 6 poços com solução de matriz de membrana 1x. Incubar a 37 °C durante 1 h para permitir a polimerização e o revestimento uniforme da superfície de cultura.
   2. Após 1 h de incubação, remova a solução de revestimento e adicione 1 mL de meio Essential 8 completo pré-aquecido contendo 10 μM de inibidor de Rho-quinase, Y-27632 (1 μL/mL de estoque de 10 mM; ver Tabela de Materiais), antes de reviver as células.
   3. Remova um estoque criovial hiPSC (1 x 10⁶ células/frasco para injetáveis) do recipiente de nitrogênio líquido. Descongelar rapidamente o criovial em banho-maria a 37 °C com um redemoinho suave.
      NOTA: Não descongele completamente o frasco para injetáveis; Anote o número da passagem, esterilize o frasco para injetáveis e limpe-o com um cotonete sem fiapos contendo álcool isopropílico a 70%.
   4. Usando uma ponteira de pipeta estéril de 1 mL, aspirar o conteúdo criovial em um tubo fresco de 15 mL composto por 2 mL de meio Essential 8 completo pré-aquecido sem Y-27632. Centrifugar o tubo a 1.000 x g por 4 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
   5. Ressuspender o pellet celular em 1,0 mL de meio Essential 8 completo contendo 10 μM Y-27632.
   6. Adicione esta suspensão celular nas superfícies revestidas de matriz sem perturbar a matriz, distribuindo-a ao longo das paredes. Balançar a placa suavemente transversalmente para garantir a distribuição uniforme das células.
   7. Incubar as placas a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO₂ para permitir que as células adiram e comecem a proliferar.
   8. Após 12-24 h, substitua o meio gasto e mantenha as culturas em meio Essential 8 completo pré-aquecido sem Y-27632.
   9. Troque o meio de cultura a cada 24 h e passe pelas culturas quando elas atingirem 70%-80% de confluência.
      NOTA: Uma proporção dividida de 1:6 é rotineiramente seguida para culturas hiPSC e é passada em intervalos regulares de 3-4 dias.
2. Passaging e plaqueamento de hiPSCs para iniciar a diferenciação da linhagem retiniana
   1. Aspirar o meio gasto de 70%-80% de culturas humanas iPSC confluentes em placas de 6 poços.
   2. Adicionar 1 ml de CDS (passo 1.2) a cada poço e incubar a 37 °C durante 5-7 min até que as células se arredondam. Retire cuidadosamente o CDS, tomando cuidado para não desprender as células, e adicione 2 mL de meio fresco Essential 8 e triture suavemente usando uma pipeta.
   3. Recolher a suspensão celular de um poço de uma placa de 6 células num tubo de centrífuga de 15 ml e girar o tubo a 1.000 x g durante 4 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
   4. Ressuspender o pellet de células em 1,2 mL de meio Essential 8 e dispensar 200 μL da célula 200 μL da suspensão celular (proporção dividida 1:6) em cada poço de uma placa de 6 poços revestida com matriz contendo 1,5 mL de meio de cultura iPSC contendo 10 μM Y-27632, conforme descrito na etapa 1.5.
   5. Após 12-24 h, substitua o meio gasto e mantenha as culturas em meio Essential 8 completo pré-aquecido sem Y-27632.
   6. Troque o meio de cultura a cada 24 h até que as culturas atinjam 70%-80% de confluência.

3. Diferenciação das hiPSCs em campos oculares e linhagem retiniana

NOTA: Um esboço esquemático do processo de diferenciação é mostrado na Figura 1.

1. Iniciar o procedimento de diferenciação quando as culturas de hiPSC atingirem 70%-80% de confluência.
2. No dia 0, trocar o meio de manutenção hiPSC para DIM (passo 1.3) contendo 1 ng/mL de bFGF e 1 ng/mL de Noggin. Adicionar 2,0 mL de meio por poço de uma placa de 6 poços e manter as células a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5%.
   NOTA: A retirada gradual do bFGF induz a diferenciação das LSPs, e a adição de concentrações crescentes de Noggin (inibidor de várias BMPs) durante os estágios iniciais induz diferenciação e neuralização da linhagem ectodérmica^11,12 e bloqueia o comprometimento do mesoderma e endoderma. Alternativamente, Noggin pode ser substituído por LDN193189. Ao contrário da estratégia de inibição dupla da SMAD relatada anteriormente^20,21, este protocolo não requer a adição de Activin ou SB-431542.
3. No dia 1, trocar o meio gasto e adicionar DIM contendo 1 ng/mL de bFGF e 10 ng/mL de Noggin. Adicionar 2,0 mL por poço de uma placa de 6 poços. Incubar e manter as células a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%.
4. No dia 2-3, remova o meio gasto e adicione DIM contendo apenas 10 ng/mL Noggin. Adicionar 2,0 mL por poço de uma placa de 6 poços e trocar o meio a cada 24 h. Incubar e manter as células a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%.
   NOTA: Pré-aqueça sempre o meio de cultura a 30-37 °C antes de usar. Excesso de moscas volantes e células mortas podem ser observados em culturas de diferenciação precoce. Nessas condições, lavar as culturas uma vez com 1x DPBS e adicionar o meio de diferenciação retiniana. Os testes de esterilidade no meio gasto podem ser feitos semanalmente ou conforme a necessidade.
5. No dia 4, remova o meio gasto e adicione o RDM (etapa 1.4). Adicionar 2,0 mL por poço de uma placa de 6 poços e continuar a manter as culturas em RDM a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5%, com uma troca de meio fresco a cada dia.
   NOTA : Alternadamente, as PSCs podem ser cultivadas como culturas de suspensão do dia 1-3, em placas de 96 poços não aderentes e de fundo redondo, a uma densidade celular de 5 x 10³ células/100 μL/poço para formar corpos embrionários (EBs) sob condições de cultura idênticas em DIM. EBs bem formados no dia 4 podem ser plaqueados em placas revestidas de matriz contendo RDM e podem aderir, proliferar e diferenciar conforme descrito abaixo.
6. Por volta dos 14 e 18 dias, observar as culturas ao microscópio com aumento de 10x para a emergência de domínios neurais semelhantes a rosetas constituídos por progenitores de campo ocular precoce (Figura 2B).
7. Por volta dos 21-28 dias (3-4 semanas), observar culturas ao microscópio com aumentos de 4x e 10x para observar a emergência de PFE distintas e auto-organizadas, com uma ilha central de estruturas neurorretinianas circulares 3D circundadas por crescimentos contíguos do neuroepitélio e do epitélio da superfície ocular (Figura 2C,D).
   NOTA: Cerca de 20-30 PFE podem ser observadas por poço de uma placa de 6 poços de uma cultura de diferenciação retiniana hiPSC normal. Esse número pode variar com outras linhagens de hiPSC específicas da doença, com base em seu background genético e potencial de diferenciação da linhagem retiniana.

4. Colheita de organoides da retina

1. Puxador de chama de pipetas de vidro Pasteur para separação manual de copos de retina.
   NOTA: Use pipetas de vidro Pasteur autoclavadas e estéreis para a coleta de campo ocular.
   1. Ligue um queimador de Bunsen. Pegue uma pipeta Pasteur estéril e segure a base em uma mão e a ponta capilar na outra. Esterilizar a chama e aquecer a região próxima ao meio da ponta capilar, com movimentos rotacionais até que o vidro fique maleável. Em seguida, afaste-se da chama e puxe para fora rapidamente para criar uma ponta capilar fina com um lúmen fechado.
   2. Segure a ponta fina horizontalmente na frente da chama e passe-a rapidamente através da chama em um movimento para fora para criar um gancho liso ou uma ponta capilar em forma de L.
   3. Use a zona de curvatura externa lisa do gancho capilar como uma colher fina para levantar e separar suavemente os copos neurorretinários intactos dos clusters EFP.
      NOTA: O ângulo liso do gancho capilar de vidro não causa danos às células nem cria arranhões nas superfícies de cultura. Esta ferramenta simples também pode ser efetivamente usada para a divisão de colônias hiPSC individuais em padrões de grade e para passá-las como pequenos agrupamentos de células durante a expansão clonal.
2. Cultura e manutenção de copos de retina para gerar organoides 3D da retina.
   1. No dia 25-30, adicionar 4,0 mL de meio de diferenciação retiniana pré-aquecido em uma placa de 60 mm de baixa fixação antes de se preparar para a colheita de copos neurorretinários.
   2. Trabalhe sob um microscópio estéreo em aumento de 0,63x-4,5x para observar e escolher manualmente copos neurorretinários bem formados de EFPs individuais.
      NOTA: O aparecimento de crescimentos de células de EPR pigmentadas ajuda na fácil identificação de EFPs e dos copos neuro-retinais colocados centralmente. As taças retinianas aparecem como estruturas 3D em forma de rosca, circulares e translúcidas, com estrias radiais claras, formadas pelas células-tronco retinianas linearmente dispostas e auto-organizadas, em oposição aos aglomerados esféricos ou irregulares formados pelos neurônios do SNC ou pelas células da crista neural²³.
   3. Use os ganchos de pipeta de pastagem puxados pela chama para cutucar suavemente e retirar a ilha neurorretiniana central dentro de EFPs individuais.
   4. Colocar uma micropipeta de 1 mL para aspirar 100 μL e usar micropontas de 1 mL com aberturas largas para aspirar e transferir os copos flutuantes da retina para os pratos de cultura frescos e de baixa aderência preparados na etapa 4.2.1.
      NOTA: Usar pontas com um tamanho de furo menor e maior pressão de sucção pode causar cisalhamento e afetar a integridade dos copos da retina. As dimensões aproximadas dos copos da retina são de cerca de 1-2 mm de diâmetro.
   5. Manter os copos retinianos em RDM como culturas de suspensão não aderentes e incubá-los a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO₂ .
   6. Dia 30-45: Troque o meio diariamente, inclinando suavemente o prato e deixando os copos da retina se acomodarem por cerca de 30 s. Siga um método de alimentação parcial, removendo metade dos volumes do meio gasto e substituindo por volumes iguais de meio fresco.
      NOTA: Evite aspirações e transferências repetidas para evitar qualquer dano aos copos da retina. Após 1-2 semanas de cultura da suspensão, as taças retinianas crescem ligeiramente de tamanho (1-3 mm) e evoluem para organoides 3D retinianas auto-organizados (OC-1M) compostos por progenitores neurorretinianos precoces linearmente arranjados expressando PAX6 e CHX10 (Figura 3Bi).
   7. Dia 45-60: Cultura dos organoides da retina por mais 4 semanas em RDM contendo 100 μM de Taurina (ver Tabela de Materiais) para apoiar melhor sobrevivência e diferenciação de linhagem de progenitores neuro-retinianos e o desenvolvimento do tipo de célula retiniana madura (OC-2M).
      NOTA: Cerca de 70%-80% dos copos retinais ou ópticos colhidos de EFPs permanecem intactos, mantêm sua laminação e evoluem para organoides retinianos maduros após 4 semanas de cultura de suspensão (OC-2M).
   8. Verificar se os organoides retinianos maduros com 4 semanas de cultura em suspensão mostram a emergência de precursores de fotorreceptores RCVRN+ e CRX+ e células maduras com uma extensão rudimentar semelhante a um segmento interno nas camadas celulares mais externas, recapitulando o processo normal de desenvolvimento e maturação da retina in vitro (Figura 3Bii).
      NOTA: Após a remoção dos copos neuro-retinianos, as culturas de diferenciação podem ser mantidas continuamente em RDM. Os crescimentos epiteliais proximais ao redor da neuro-retina contêm precursores de células epiteliais pigmentadas da retina (EPR), que se expandem e amadurecem para formar monocamadas pigmentadas de EPR com morfologia típica de paralelepípedos (Figura 4). Os crescimentos distais consistem predominantemente de epitélio da superfície ocular que contribui para o cristalino eepitélio corneano.Os tipos celulares desejados podem ser colhidos de diferentes zonas de excrescências de EFP e enriquecidos ainda mais para estabelecer culturas puras.

5. Caracterização dos organoides da retina

1. Caracterização morfológica e molecular
   1. Observar as PFE aderentes e os organoides flutuantes da retina em microscópio de contraste de fase em aumentos de 4x e 10x e documentar sua morfologia e dimensões.
   2. Coletar cerca de 20 organoides da retina em diferentes estágios de maturação (passos 4.2.3-4.2.6) em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usando pontas de furo largo de 1.000 μL. Deixe os organoides se acomodarem no fundo e aspirar o meio. Lave os copos com 1x PBS.
   3. Remova o excesso de PBS e adicione 1,0 ml de reagente TRIzol (ver Tabela de Materiais). Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Homogeneizar o tecido com pilão tubular e triturar com pipeta de 1,0 mL.
   4. Prepare o RNA total seguindo o método padrão de isolamento e purificação do RNA, de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
   5. Verifique a qualidade do RNA no gel de agarose e quantifique-o usando o espectrofotômetro NanoDrop (ver Tabela de Materiais).
   6. Converter 1-2 μg de RNA total em cDNA usando a enzima transcriptase reversa de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Consulte a Tabela 1 para obter uma lista de primers específicos para genes.
   7. Resumidamente, preparar a mistura mestre RNA-primer em 10 μL de volume total, conforme mencionado na Tabela 2 , e incubar o tubo a 65 °C por 5 min em um termociclador. Transfira o tubo do termociclador para o gelo por 2 min.
   8. Enquanto isso, prepare a mistura master 2 com os reagentes mencionados na Tabela 3. Adicionar esta mistura mestra ao tubo de mistura RNA-primer preparado na etapa 5.1.7. Misture delicadamente.
   9. Incubar a amostra a 50 °C durante 50 min, depois 85 °C durante 5 min e, em seguida, segurar a 4 °C para parar a reacção.
   10. Use o cDNA sintetizado como molde em reações de PCR para verificar a expressão de progenitores neuro-retinianos e marcadores de células maduras da retina.
   11. Normalizar os modelos totais de cDNA de cada amostra, ou seja, F2-UD (hiPSC-F2-3F1; células indiferenciadas), OC-1M (copo óptico de 1 semana em cultura de suspensão) e OC-2M (copo óptico de 4 semanas em cultura de suspensão) por PCR semiquantitativo usando os genes housekeeping como hE1fα ou GAPDH.
   12. Preparar a mistura mestra para PCR semi-quantitativo, conforme mencionado na Tabela 4, e colocar os tubos de amostra de ensaio para amplificação em um termociclador. As condições de amplificação da PCR estão mencionadas na Tabela 5.
2. Histologia e imuno-histoquímica
   1. Recolher as taças ópticas num tubo de microcentrífuga de 2,0 ml e aspirar o meio em excesso (passos 4.2.3-4.2.6). Enxaguar os organoides com 1x PBS e, em seguida, lavá-los e suspendê-los em 500 μL de Paraformaldeído a 4% para fixá-los durante a noite à temperatura ambiente.
   2. No dia seguinte, lave os copos em água deionizada. Deixe os copos repousarem em álcool 95% (três trocas, 15-20 min cada), seguido de álcool 100% (três trocas, 15-20 min cada), uma mistura 1:1 de álcool absoluto e xileno por 15 min, xileno (duas trocas, 15 min cada) e parafina (três trocas, 15 min cada). Incorpore este tecido para preparar um bloco de parafina seguindo os procedimentos padrão. Deixe esfriar e solidificar.
   3. Prepare seções finas (~4-5 μm de espessura) usando um micrótomo e coloque-as em lâminas microscópicas revestidas de silano (ver Tabela de Materiais) seguindo os procedimentos histológicos padrão.
   4. Para desparafinização, aqueça as lâminas a 70 °C em um bloco de aquecimento por 15-20 min. Uma vez que a cera derrete, lave as lâminas com xileno (três mudanças, 3-4 min cada), que removerá a parafina completamente.
      NOTA: A remoção incompleta da parafina resulta em coloração pobre/irregular das seções com uma enorme quantidade de ruído de fundo.
   5. Hidratar novamente as lâminas com diferentes porcentagens de etanol (100%, 90% e 80%) por 3 min cada. Enxaguar as lâminas com água destilada e proceder à recuperação do antígeno.
   6. Antes de iniciar a recuperação do antigénio, pré-aqueça o tampão citrato (pH 6,0) num frasco Coplin (ver Tabela de Materiais) utilizando um forno de micro-ondas até atingir 95-100 °C.
   7. Mergulhe as lâminas em tampão citrato pré-aquecido e aqueça o frasco por 15 minutos em um forno de micro-ondas. Retire o frasco Coplin do forno e deixe arrefecer à temperatura ambiente.
   8. Bloquear as secções para peroxidase endógena adicionando uma mistura 1:1 de metanol e peróxido de hidrogénio durante 5 min, seguida de lavar as secções três vezes com 1x PBS.
   9. Permeabilizar os cortes usando Triton-X 100 0,5% por 15 min. Lave as lâminas três vezes com 1x PBS.
   10. Bloquear a ligação inespecífica do anticorpo primário incubando os cortes com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) em 1x PBS por 1 h.
   11. Incubar as secções com anticorpo primário durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Lave as lâminas três vezes com 1x PBS por 3-5 min cada para remover o anticorpo não ligado.
   12. Adicionar o anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente adequado e incubar por 45 min. Lave as lâminas três vezes com 1x PBS por 3-5 min cada.
       NOTA: Os anticorpos e suas respectivas diluições são mencionados na Tabela de Materiais. Os cortes organoides da retina foram imunomarcados usando PAX6 e CHX10 para detectar células precursoras neuro-retinianas precoces, e usando Recoverin e CRX para detectar células precursoras retinianas e fotorreceptoras comprometidas. Da mesma forma, anti-PAX6 e anti-MITF foram usados para detectar precursores de EPR, e anti-CRALBP e anti-RPE65 foram usados para detectar células maduras pigmentadas de EPR por imunocitoquímica de culturas de monocamada 2D.
   13. Contra-manchar as seções com DAPI ou PI e montá-las em uma lâmina de vidro usando o meio de montagem antifade (consulte a Tabela de Materiais).
   14. Imageie e documente os cortes imunomarcados de organoides da retina e culturas de EPR usando um microscópio de varredura a laser confocal ou de fluorescência para examinar diferentes camadas celulares expressando diferentes marcadores da retina.

Resultados

A diferenciação das hiPSCs em linhagens oculares é obtida pela cultura das células em diferentes coquetéis de meio de cultura contendo suplementos e fatores de crescimento em etapas sequenciais em diferentes momentos, conforme descrito na Figura 1. As culturas de hiPSC são mantidas em meio Essential 8, o meio de manutenção de células-tronco pluripotentes. Uma vez que atinjam 70%-80% de confluência (Figura 2A), o meio é substituído por Meio de Induç?...

Discussão

hiPSCs são uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento de órgãos e tecidos in vitro. Recapitular o fenótipo da doença diferenciando hiPSCs saudáveis versus doença-específicas em direção à linhagem retiniana pode ajudar a obter novos conhecimentos sobre a fisiopatologia de diferentes formas de distrofias hereditárias da retina. Vários protocolos têm sido descritos e adotados para a diferenciação in vitro de CTPs em tipos celulares da retina. A maioria deles envolve o uso de mei...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe filters	TPP	99722
15 mL centrifuge tube	TPP	91015
50 mL centrifuge tube	TPP	91050
6 well plates	TPP	92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal	Santa Cruz	SC365519	1:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal	Abcam	ab140603	1:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal	Abcam	ab3201	1:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal	Millipore	AB5585	1:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher	17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF)	Sigma Aldrich	F0291
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Coplin Jar (50 mL)	Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	354277
CryoTubes	Thermo Fisher	V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)	Thermo Fisher	10565-018
DreamTaq DNA polymerase	Thermo Fisher	EP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	14190144
Essential 8 medium kit	Thermo Fisher	A1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm	Corning	351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States	Gibco	26140079
GelDocXR+ with Image lab software	BIO-RAD		Agarose Gel documentation system
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11030	1:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546	Invitrogen	A11035	1:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1:300 dilution
HistoCore MULTICUT	Leica		For sectioning
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
L-Acsorbic acid	Sigma Aldrich	A92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
N2 supplement (100x)	Thermo Fisher	17502048
NanoDrop 2000	Thermo Fisher		To quantify RNA
Paraformaldehyde	Qualigens	23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged	Corning	7095D-9
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal	Abcam	ab183951	1:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal	Abcam	ab195045	1:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal	Abcam	ab231782	1:300 dilution
Recombinant Human Noggin Protein	R&D Systems	6057-NG
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Serological pipettes 10 mL	TPP	94010
Serological pipettes 5 mL	TPP	94005
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	S4641
Starfrost (silane coated) microscopic slides	Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	18080051
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector laboratories	H-1200
Vitronectin	Thermo Fisher	A27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)	Sigma Aldrich	Y0503
Zeiss LSM 880	Zeiss		Confocal microscope