Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Özet

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Özet

Pluripotent kök hücreler, in vitro hastalık modelleme çalışmaları ve rejeneratif tedaviler geliştirmek için yararlı olan karmaşık doku organoidleri üretebilir. Bu protokol, retinal farklılaşmanın ilk 4 haftasında, farklı, kendi kendini organize eden göz alanı primordial kümelerinin (EFP'ler) ortaya çıkmasına kadar, yapışkan tek katmanlı kültürlerden oluşan hibrid bir kültür sisteminde retinal organoidlerin üretilmesinin daha basit, sağlam ve aşamalı bir yöntemini tanımlamaktadır. Ayrıca, her EFP'deki çörek şeklindeki, dairesel ve yarı saydam nöro-retinal adalar, çok katmanlı 3D optik kaplar (OC-1M) üretmek için 1-2 hafta boyunca retinal farklılaşma ortamında yapışkan olmayan kültür kapları kullanılarak süspansiyon altında manuel olarak toplanır ve kültürlenir. Bu olgunlaşmamış retinal organoidler PAX6+ ve ChX10⁺ proliferasyonlu, multipotent retinal öncülleri içerir. Öncü hücreler organoidler içinde doğrusal olarak kendi kendine monte edilir ve farklı radyal çizikler olarak görünür. Süspansiyon kültüründen 4 hafta sonra, retinal progenitörler post-mitotik arrest ve olgun retinal organoidleri (OC-2M) oluşturmak için soy farklılaşmasına uğrarlar. Fotoreseptör soyu işlenen öncüller, retinal organoidlerin en dış katmanlarında gelişir. Bu CRX + ve RCVRN ⁺ fotoreseptör hücreleri, iç segment benzeri uzantıları görüntülemek için morfolojik olarak olgunlaşır. Bu yöntem, insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kullanılarak retinal organoidler üretmek için benimsenebilir. Tüm adımlar ve prosedürler, tekrarlanabilirliği sağlamak ve temel bilim ve çeviri araştırmalarında daha geniş uygulamalar için açıkça açıklanmış ve gösterilmiştir.

Giriş

Retina, omurgalı gözün arkasında bulunan ve ışık sinyallerini foto-transdüksiyon yolu olarak bilinen biyokimyasal bir fenomenle sinir uyarılarına dönüştüren ışığa duyarlı bir dokudur. Retinanın fotoreseptör hücrelerinde üretilen ilk sinir uyarıları, diğer retinal internöronlara ve retinal ganglion hücrelerine (RGC'ler) dönüştürülür ve beynin görsel korteksine ulaşır, bu da görüntü algısına ve görsel tepkiye yardımcı olur.

Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, 1 milyonu Asya'da olmak üzere tahmini 1,5 milyon çocuk kördür. Kalıtsal Retina Distrofisi (IRD), dünya çapında 4.000 kişiden 1'ini etkileyen majör bir körleme hastalığıdır ^1,2,3, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile ilişkili körlük prevalansı gelişmekte olan ülkelerde %0,6-%^1,1 arasında değişmektedir ⁴. IRD'ler, retina gelişimi ve fonksiyonunda rol oynayan 300'den fazla farklı gendeki kalıtsal genetik kusurlardan kaynaklanır⁵. Bu tür genetik değişiklikler, normal retina fonksiyonlarının bozulmasına ve retina hücrelerinin, yani fotoreseptör hücrelerin ve retina pigmentli epitelin (RPE) kademeli olarak dejenerasyonuna neden olur ve böylece ciddi görme kaybına ve körlüğe yol açar. Kornea, lens vb. ile ilgili diğer kör edici durumlarda muazzam ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, retina distrofileri ve optik sinir atrofilerinin bugüne kadar kanıtlanmış bir tedavisi yoktur. Yetişkin bir insan retinasında kök hücreler^{bulunmadığından 6}, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) ve hasta kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) gibi alternatif kaynaklar, istenen hücre tiplerinin sınırsız bir tedarikini sağlayabilir ve in vitro hastalık modelleme çalışmaları için gerekli olan karmaşık doku organoidlerinin geliştirilmesi ve rejeneratif tedavilerin geliştirilmesi için büyük bir umut vaat edebilir^{7, 8,9,10}.

Birkaç yıllık retinal araştırma, erken retina gelişimini düzenleyen moleküler olayların daha iyi anlaşılmasını sağlamıştır. PSC'lerden retinal hücreler ve 3D organoidler üretmek için kullanılan protokollerin çoğu, bilinen biyolojik süreçleri aşamalı bir şekilde modüle etmek için hücreleri karmaşık bir büyüme faktörleri ve küçük moleküller kokteylinde kültürleyerek bu gelişimsel olayları in vitro olarak özetlemeyi amaçlamaktadır. Bu şekilde üretilen retinal organoidler başlıca retinal hücrelerden oluşur: retinal ganglion hücreleri (RGC'ler), internöronlar, fotoreseptörler ve retina pigmentli epitel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Retinal organoidleri kullanarak IRD'leri modellemeye yönelik başarılı girişimlere rağmen, farklılaşma sırasında büyüme faktörlerinin ve küçük moleküllerin karmaşık kokteyline olan gereksinim ve retinal organoid üretiminin nispeten düşük verimliliği, çoğu protokolde büyük bir zorluk oluşturmaktadır. Bunlar büyük ölçüde embriyoid cisimlerin oluşumunu ve ardından in vitro gelişimin farklı aşamalarında karmaşık kültür koşullarını kullanarak retinal soylara kademeli olarak farklılaşmalarını içerir^20,21,22.

Burada, sağlıklı kontrol ve retina hastalığına özgü hiPSC'lerden kompleks 3D nöro-retinal organoidler geliştirmek için basitleştirilmiş ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir. Burada tarif edilen protokol, embriyoid vücut oluşumuna ihtiyaç duymadan yakın birleşimli hiPSC kültürlerinin doğrudan farklılaşmasını kullanır. Ayrıca, kültür ortamının karmaşıklığı basitleştirilmiştir, bu da onu yeni araştırmacılar tarafından kolayca benimsenebilecek uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir teknik haline getirmektedir. Retinal farklılaşmanın ilk 4 haftasında, farklı, kendi kendini organize eden göz alanı ilkel kümelerinin (EFP'ler) ortaya çıkmasına kadar yapışkan tek katmanlı kültürlerden oluşan hibrit bir kültür sistemini içerir. Ayrıca, her EFP içindeki dairesel nöro-retinal adalar, PAX6 ⁺ ve CHX10 ⁺ prolifere eden nöro-retinal öncüllerden oluşan çok katmanlı 3D retinal kaplar veya organoidler hazırlamak için 1-2 hafta boyunca süspansiyon kültürlerinde manuel olarak toplanır ve yetiştirilir. Retinal organoidlerin 100 μM Taurin içeren ortamda 4 hafta daha uzatılmış kültürü, RCVRN + ve CRX ⁺ fotoreseptör öncüllerinin ve ilkel iç segment benzeri uzantılara sahip olgun hücrelerin ortaya çıkmasına neden olmuştur.

Protokol

HiPSC'leri içeren tüm deneyler, standart laboratuvar uygulamalarına, etik ve biyogüvenlik kılavuzlarına bağlı kalınarak ve Kurumsal Etik Komitesi (IEC), Kurumsal Kök Hücre Araştırmaları Komitesi (IC-SCR) ve Kurumsal Biyo-Güvenlik Komitesi (IBSC) gibi düzenleyici kurumların onaylarıyla aseptik olarak gerçekleştirilmiştir.

1. iPSC kültürü ve retina farklılaşma ortamı ve reaktiflerinin hazırlanması

1. iPSC kültürü ve bakım ortamı
   1. Normal hiPSC hattı 23'ü (hiPSC-F2-3F1) ve CRISPR düzenlenmiş, RB1-/- hiPSC hattını (LVIP15-RB1-CS3, biallelik, insan RB1 geninin ekzon 18'i içinde 10 bp'lik kare kaydırmalı silme ile) matris kaplı (bazal membran matrisi kaplı; bkz.
      NOT: Bu protokol, bazal membran matrisinin rekombinant vitronektin (VTN-N) kaplama ile değiştirilmesiyle tamamen ksenosuz hale getirilebilir. 50x Essential 8 takviyesi (Essential 8 orta boy kiti ile birlikte verilir; Malzeme Tablosuna bakınız) ve 100 U/mL Penisilin-Streptomisin çözeltisi ekleyerek eksiksiz Essential 8 ortamını hazırlayın. Alternatif olarak, hiPSC'ler tam mTeSR1 ortamı kullanılarak da kültürlenebilir.
2. Hücre Ayrışma Çözeltisi (1x CDS)
   1. İnsan iPSC'lerinin enzimsiz ayrışması ve geçişi için, 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) 0.5 mM EDTA, pH 8.0 ve 30 mM NaCl içeren CDS'yi hazırlayın (bkz.
   2. 100 mL 1x CDS hazırlamak için, 99 mL 1x DPBS'ye 100 μL 0,5M EDTA ve 1 mL 3 M NaCl stok çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve 0,22 μm filtre kullanarak sterilize edin.
3. Diferansiyasyon İndüksiyon Ortamı (DIM)
   1. %10 Nakavt Serum Replasmanı (KOSR), 1x Esansiyel Olmayan Amino Asit (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/mL Penisilin-Streptomisin, 200 μM L-Askorbik asit ve %1 N2 takviyesi ile desteklenmiş DMEM-F12 Bazal ortamını kullanarak DIM'i hazırlayın (bkz.
4. Retina Diferansiyasyon Ortamı (RDM)
   1. RDM'yi,% 10 Nakavt Serumu (KOSR), 1x Esansiyel Olmayan Amino Asit (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U / mL Penisilin-Streptomisin, 200 μM L-Askorbik asit ve% 2 B27 takviyesi (A vitamini ile) ile desteklenmiş DMEM-F12 Bazal ortamı kullanarak hazırlayın (bkz.
5. Hücre dışı matris kaplı hücre kültürü yüzeyleri
   1. hESC nitelikli bodrum membran matrisini gece boyunca bir buz kovasında, tercihen 4-8 ° C'de bir buzdolabının içinde çözün. 20 mL buz gibi soğuk DMEM-F12 bazal ortam ekleyerek çözülmüş 100x matris stoğunu (5 mL) 1:5 oranında seyreltin ve 20x stok çözeltisi hazırlamak için hafifçe dönerek karıştırın.
      1. Önceden soğutulmuş pipet uçları ve steril mikrosantrifüj tüpleri kullanarak buz üzerinde 0,5 mL alikot hazırlayın. Şişeleri 20x stok olarak etiketleyin ve -80 ° C'lik bir dondurucuda 6 aya kadar dondurulmuş olarak saklayın.
   2. Hücre kültürü yüzeylerini (kültür kapları veya 6 delikli plakalar) kaplamak için, buz üzerinde 20x matrisli bir aliquot çözün ve 100 mm'lik bir tabağı veya 6 delikli bir plakayı (1.5 mL / kuyucuk) kaplamak için yeterli olan 10 mL 1x matris kaplama çözeltisi hazırlamak için buz gibi soğuk DMEM-F12 bazal ortamı kullanarak 1:20 oranında seyreltin.
      NOT: Matris çözeltisini kullanmadan önce pipetleri/mikro uçları buz gibi soğuk ve steril DPBS aspire ederek önceden soğutun. Çözme ve matrisin tüm işlemleri, oda sıcaklıklarında polimerizasyonu ve jelleşmeyi önlemek için önceden soğutulmuş pipetler/mikro uçlar kullanılarak buz üzerinde yapılmalıdır.
   3. 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 1,5 mL 1x matris kaplama çözeltisi ekleyin, eşit kaplamayı sağlamak için plakayı yavaşça döndürün ve plakaları% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Matrisin kültür yüzeylerinde düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlamak için plakaları en az 1 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
   4. Hücreleri tohumlamadan önce, 5 mL'lik steril bir pipet kullanarak kaplama çözeltisini aspire edin ve sıvı atıkları atın. Hemen taze kültür ortamı ekleyin (6 delikli bir plakanın 2 mL / kuyusu) ve hücreleri 150.000-200.000 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın. Kullanım sırasında plakaların kurumasına izin vermeyin.
      NOT: Alternatif olarak, ksenosuz bir kültür protokolü için 0,5 μg/mL'lik son konsantrasyonda rekombinant vitronektin (VTN-N) kaplama kullanılabilir.

2. İnsan iPSC kültürlerinin oluşturulması

1. HiPSC'lerin çözülmesi ve yeniden canlandırılması
   1. 6 delikli bir plakanın bir kuyusunu 1x membran matris çözeltisi ile kaplayın. Kültür yüzeyinin polimerizasyonuna ve homojen kaplamasına izin vermek için 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. 1 saatlik inkübasyondan sonra, kaplama çözeltisini çıkarın ve hücreleri canlandırmadan önce 10 μM Rho-kinaz inhibitörü, Y-27632 (10 mM stokun 1 μL / mL'si; Malzeme Tablosuna bakınız) içeren 1 mL önceden ısıtılmış tam Essential 8 ortamı ekleyin.
   3. Bir hiPSC kriyoviyal stoğunu (1 x 10⁶ hücre/şişe) sıvı azot kabından çıkarın. Kriyoviyal 37 ° C'lik bir su banyosunda yumuşak bir dönüş ile hızla çözülür.
      NOT: Şişeyi tamamen çözmeyin; Geçiş numarasını not edin, şişeyi yüzey sterilize edin ve% 70 izopropil alkol içeren tüy bırakmayan bir çubukla kurulayın.
   4. Steril 1 mL'lik pipet ucu kullanarak, kriyovyal içerikleri, Y-27632 içermeyen 2 mL önceden ısıtılmış tam Essential 8 ortamından oluşan taze bir 15 mL tüpe aspire edin. Tüpü oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin. Supernatan'ı atın.
   5. Hücre peletini 10 μM Y-27632 içeren 1.0 mL tam Essential 8 ortamında yeniden askıya alın.
   6. Bu hücre süspansiyonunu, matrisi rahatsız etmeden matris kaplı yüzeylere, duvarlar boyunca dağıtarak ekleyin. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı yavaşça çapraz yönde sallayın.
   7. Hücrelerin yapışmasını ve çoğalmaya başlamasını sağlamak için% 5 CO₂ inkübatörde plakaları 37 ° C'de inkübe edin.
   8. 12-24 saat sonra, harcanan ortamı değiştirin ve kültürleri Y-27632 olmadan önceden ısıtılmış tam Essential 8 ortamında tutun.
   9. Her 24 saatte bir kültür ortamını değiştirin ve kültürleri% 70 -% 80 birleşmeye ulaştıklarında geçirin.
      NOT: HiPSC kültürleri için 1:6'lık bir bölünme oranı rutin olarak takip edilir ve 3-4 günlük düzenli aralıklarla geçirilir.
2. Retinal soy farklılaşmasını başlatmak için hiPSC'lerin geçişi ve kaplanması
   1. Harcanan ortamı, 6 kuyucuklu plakalarda% 70-80 oranında akıcı insan iPSC kültürlerinden aspire edin.
   2. Her bir kuyucuğa 1 mL CDS (adım 1.2) ekleyin ve hücreler toplanana kadar 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. CDS'yi dikkatlice çıkarın, hücreleri ayırmamaya dikkat edin ve 2 mL taze Essential 8 ortamı ekleyin ve bir pipet kullanarak hafifçe tritüre edin.
   3. Hücre süspansiyonunu 6 hücreli bir plakanın bir kuyucuğundan 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve tüpü oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 1.000 x g'de döndürün. Supernatan'ı atın.
   4. Hücre peletini 1,2 mL Essential 8 ortamında yeniden askıya alın ve adım 1.5'te açıklandığı gibi, 1.5 mL iPSC kültür ortamı içeren 1.5 mL iPSC kültür ortamı içeren matris kaplı 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna hücre süspansiyonunun 200μL'sinin 200μL'sini (1:6 bölünme oranı) dağıtın.
   5. 12-24 saat sonra, harcanan ortamı değiştirin ve kültürleri Y-27632 olmadan önceden ısıtılmış tam Essential 8 ortamında tutun.
   6. Kültürler %70-%80 birleşim noktasına ulaşana kadar her 24 saatte bir kültür ortamını değiştirin.

3. HiPSC'lerin göz alanlarına ve retina soyuna farklılaşması

NOT: Farklılaştırma işleminin şematik bir taslağı Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. HiPSC kültürleri %70-%80 birleşim noktasına ulaştığında farklılaşma prosedürünü başlatın.
2. 0. günde, hiPSC bakım ortamını 1 ng/mL bFGF ve 1 ng/mL Noggin içeren DIM (adım 1.3) olarak değiştirin. 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2.0 mL orta ekleyin ve hücreleri% 5'lik bir CO₂ inkübatörde 37 ° C'de tutun.
   NOT: bFGF'nin kademeli olarak geri çekilmesi PSC'lerin farklılaşmasına neden olur ve başlangıç aşamalarında artan Noggin konsantrasyonlarının (birkaç BMP'nin inhibitörü) eklenmesi, ektodermal soy farklılaşmasına ve nevralizasyona^{neden olur 11,12} ve mezoderm ve endoderm taahhüdünü bloke eder. Alternatif olarak, Noggin LDN193189 ile değiştirilebilir. Daha önce^20,21 bildirilen ikili SMAD inhibisyon stratejisinin aksine^, bu protokol Aktivin veya SB-431542 eklenmesini gerektirmez.
3. 1. günde, harcanan ortamı değiştirin ve 1 ng / mL bFGF ve 10 ng / mL Noggin içeren DIM ekleyin. 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2,0 mL ekleyin. Hücreleri% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin ve koruyun.
4. 2-3. günde, harcanan ortamı çıkarın ve yalnızca 10 ng / mL Noggin içeren DIM ekleyin. 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2,0 mL ekleyin ve ortamı her 24 saatte bir değiştirin. Hücreleri% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin ve koruyun.
   NOT: Kullanmadan önce kültür ortamını daima 30-37 °C'ye ısıtın. Erken farklılaşma kültürlerinde aşırı yüzerler ve ölü hücreler gözlenebilir. Bu koşullar altında, kültürleri bir kez 1x DPBS ile yıkayın ve retinal farklılaşma ortamını ekleyin. Harcanan ortam üzerindeki sterilite testleri haftalık veya gerektiğinde yapılabilir.
5. 4. günde, harcanan ortamı kaldırın ve RDM'yi ekleyin (adım 1.4). 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2,0 mL ekleyin ve RDM'deki kültürleri %5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de tutmaya devam edin ve her gün taze bir ortam değişimi yapın.
   NOT : Alternatif olarak, PSC'ler, DIM'de aynı kültür koşulları altında embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmak için 5 x 10 3 hücre/100 μL/kuyu hücre yoğunluğunda, yapışkan olmayan ve yuvarlak tabanlı 96 delikli plakalarda,^1-3 . günlerden itibaren süspansiyon kültürleri olarak yetiştirilebilir. 4. günde iyi biçimlendirilmiş EB'ler, RDM içeren matris kaplı plakalara kaplanabilir ve yapışmasına izin verilir, çoğalır ve aşağıda açıklandığı gibi farklılaşır.
6. 14-18. günlerde, erken göz alanı progenitörlerinden oluşan nöral rozet benzeri alanların ortaya çıkması için kültürleri mikroskop altında 10x büyütmede gözlemleyin (Şekil 2B).
7. 21-28. günlerde (3-4 hafta), nöro epitel ve oküler yüzey epitelinin bitişik çıkıntıları ile çevrili merkezi bir dairesel 3D nöro-retinal yapı adası ile kendi kendini organize eden, farklı EFP'lerin ortaya çıkışını gözlemlemek için kültürleri mikroskop altında 4x ve 10x büyütmede gözlemleyin (Şekil 2C, D).
   NOT: Normal bir hiPSC retinal farklılaşma kültürünün 6 delikli plakasının kuyucuğu başına yaklaşık 20-30 EFP gözlenebilir. Bu sayı, genetik arka planlarına ve retinal soy farklılaşma potansiyellerine bağlı olarak diğer hastalığa özgü hiPSC hatlarına göre değişebilir.

4. Retinal organoidlerin toplanması

1. Camın alev çekmesi Retinal bardakların manuel olarak toplanması için Pasteur pipetler.
   NOT: Göz alanı toplama için otoklavlanmış ve steril cam Pasteur pipetler kullanın.
   1. Bir Bunsen brülörünü açın. Steril bir Pasteur pipet alın ve tabanı bir elinizde ve kılcal ucu diğer elinizde tutun. Alev, kılcal ucun ortasına yakın bölgeyi, cam esnek hale gelene kadar dönme hareketleriyle sterilize eder ve ısıtır. Ardından alevden uzaklaşın ve kapalı bir lümeni olan ince bir kılcal uç oluşturmak için hızla dışarı doğru çekin.
   2. İnce ucu alevin önünde yatay olarak tutun ve pürüzsüz bir kanca veya L şeklinde bir kılcal uç oluşturmak için alevin içinden dışa doğru bir hareketle hızla geçirin.
   3. Bozulmamış nöro-retinal kapları EFP kümelerinden nazikçe kaldırmak ve ayırmak için kılcal kancanın pürüzsüz dış eğrilik bölgesini ince bir kepçe olarak kullanın.
      NOT: Cam kılcal kancanın düzgün açısı ne hücrelere zarar verir ne de kültür yüzeylerinde çizikler oluşturur. Bu basit araç, ızgara desenlerinde bireysel hiPSC koloni bölünmesi ve klonal genişleme sırasında küçük hücre kümeleri olarak geçirilmesi için de etkili bir şekilde kullanılabilir.
2. 3D retinal organoidler üretmek için retinal bardakların kültürü ve bakımı.
   1. 25-30. günde, nöro-retinal kapların hasadına hazırlanmadan önce, düşük ataşmanlı 60 mm'lik bir tabağa 4.0 mL önceden ısıtılmış retinal farklılaşma ortamı ekleyin.
   2. Bireysel EFP'lerden iyi biçimlendirilmiş nöro-retinal kapları gözlemlemek ve manuel olarak seçmek için 0.63x-4.5x büyütmede stereo mikroskop altında çalışın.
      NOT: Pigmentli RPE hücre büyümelerinin ortaya çıkması, EFP'lerin ve merkezi olarak yerleştirilmiş nöro-retinal kapların kolayca tanımlanmasına yardımcı olur. Retinal kaplar, CNS nöronları veya nöral krest hücreleri tarafından oluşturulan sıkıca paketlenmiş ve küresel veya düzensiz kümelerin aksine, doğrusal olarak düzenlenmiş ve kendi kendine monte edilmiş retinal kök hücreler tarafından oluşturulan net radyal çizgilenmelere sahip, çörek şeklinde, dairesel ve yarı saydam 3D yapılar olarak görünür²³.
   3. Alev ile çekilen Mera pipet kancalarını kullanarak merkezi nöro-retinal adayı tek tek EFP'ler içinde nazikçe dürtün ve çıkarın.
   4. 100 μL'yi aspire etmek için 1 mL'lik bir mikropipet ayarlayın ve yüzen retinal kapları aspire etmek ve adım 4.2.1'de hazırlanan taze, düşük yapışkanlı kültür yemeklerine aktarmak için geniş delikli açıklıklara sahip 1 mL mikro uçlar kullanın.
      NOT: Daha küçük delik boyutuna ve daha yüksek emme basıncına sahip uçların kullanılması kesmeye neden olabilir ve retinal kapların bütünlüğünü etkileyebilir. Retinal bardakların yaklaşık boyutları yaklaşık 1-2 mm çapındadır.
   5. Retinal kapları RDM'de yapışkan olmayan süspansiyon kültürleri olarak tutun ve% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
   6. 30-45. Gün: Çanağı yavaşça eğerek ve retinal bardakların yaklaşık 30 sn yerleşmesine izin vererek ortamı günlük olarak değiştirin. Kısmi bir besleme yöntemi izleyin, harcanan ortamın yarım hacimlerini çıkarın ve eşit miktarda taze ortam ile değiştirin.
      NOT: Retinal bardaklara herhangi bir zarar gelmesini önlemek için tekrarlanan aspirasyon ve transferlerden kaçının. 1-2 haftalık süspansiyon kültüründen sonra, retinal kaplar hafifçe büyür (1-3 mm) ve PAX6 ve CHX10'u eksprese eden doğrusal olarak düzenlenmiş, erken nöro-retinal progenitörlerden oluşan kendi kendini organize eden 3D retinal organoidlere (OC-1M) dönüşür (Şekil 3Bi).
   7. 45-60. Gün: Nöro-retinal progenitörlerin daha iyi sağkalımını ve soy farklılaşmasını ve olgun retinal hücre tipinin (OC-2M) gelişimini desteklemek için 100 μM Taurin içeren RDM'de retinal organoidleri 4 hafta daha kültürleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: EFP'lerden seçilen retinal veya optik kapların yaklaşık% 70-80'i bozulmadan kalır, laminasyonlarını korur ve 4 haftalık süspansiyon kültüründen (OC-2M) sonra olgun retinal organoidlere dönüşür.
   8. 4 haftalık süspansiyon kültüründeki olgun retinal organoidlerin, RCVRN + ve CRX + fotoreseptör öncüllerinin ve en dış hücre katmanlarında ilkel bir iç segment benzeri uzantıya sahip olgun hücrelerin ortaya çıktığını gösterdiğini, böylece normal retinal gelişim ve olgunlaşma sürecini in vitro olarak özetlediğini kontrol edin (Şekil 3Bii).
      NOT: Nöroretinal bardaklar çıkarıldıktan sonra, farklılaşma kültürleri RDM'de sürekli olarak korunabilir. Nöroretinayı çevreleyen proksimal epitel çıkıntıları, tipik parke taşı morfolojisine sahip pigmentli RPE monokatmanları oluşturmak üzere daha da genişleyen ve olgunlaşan retinal pigmentli epitel (RPE) hücre öncülleri içerir (Şekil 4). Distal çıkıntılar ağırlıklı olarak lens ve korneaepiteline katkıda bulunan oküler yüzey epitelinden oluşur.İstenilen hücre tipleri, EFP büyümelerinin farklı bölgelerinden toplanabilir ve saf kültürler oluşturmak için daha da zenginleştirilebilir.

5. Retinal organoidlerin karakterizasyonu

1. Morfolojik ve moleküler karakterizasyon
   1. Yapışkan EFP'leri ve yüzen retinal organoidleri faz-kontrast mikroskobu altında 4x ve 10x büyütmede gözlemleyin ve morfolojilerini ve boyutlarını belgeleyin.
   2. Olgunlaşmanın farklı aşamalarında (adım 4.2.3-4.2.6) yaklaşık 20 retinal organoidi, geniş delikli 1.000 μL uçları kullanarak 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine toplayın. Organoidlerin dibe çökmesine ve ortamı aspire etmesine izin verin. Bardakları 1x PBS ile yıkayın.
   3. Fazla PBS'yi çıkarın ve 1,0 mL TRIzol reaktifi ekleyin (bkz. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Bir tüp havaneli kullanarak dokuyu homojenize edin ve 1,0 mL'lik bir pipet kullanarak tritüre edin.
   4. Üreticinin talimatlarına göre, standart reaktif RNA izolasyonu ve saflaştırma yöntemini izleyerek toplam RNA'yı hazırlayın (bkz.
   5. Agaroz jeli üzerindeki RNA kalitesini kontrol edin ve NanoDrop Spektrofotometresini kullanarak ölçün (bakınız Malzeme Tablosu).
   6. Üreticinin talimatlarına göre ters transkriptaz enzimini kullanarak 1-2 μg toplam RNA'yı cDNA'ya dönüştürün (bkz. Gen-spesifik primerlerin bir listesi için Tablo 1'e bakınız.
   7. Kısaca, RNA-primer ana karışımını Tablo 2'de belirtildiği gibi toplam hacmin 10 μL'sinde hazırlayın ve tüpü bir termal döngüleyicide 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin. Tüpü termal döngüleyiciden 2 dakika boyunca buza aktarın.
   8. Bu arada, ana karışım 2'yi Tablo 3'te belirtilen reaktiflerle hazırlayın. Bu ana karışımı adım 5.1.7'de hazırlanan RNA-primer karışım tüpüne ekleyin. Yavaşça karıştırın.
   9. Numuneyi 50 dakika boyunca 50 ° C'de, daha sonra 5 dakika boyunca 85 ° C'de inkübe edin ve ardından reaksiyonu durdurmak için 4 ° C'de tutun.
   10. Sentezlenen cDNA'yı, nöro-retinal progenitör ve olgun retinal hücre belirteçlerinin ekspresyonunu kontrol etmek için PCR reaksiyonlarında bir şablon olarak kullanın.
   11. Her bir numunenin toplam cDNA şablonlarını, yani F2-UD (hiPSC-F2-3F1; farklılaşmamış hücreler), OC-1M (süspansiyon kültüründe 1 haftalık optik kap) ve OC-2M (süspansiyon kültüründe 4 haftalık optik kap) gibi hE1fα veya GAPDH gibi temizlik genlerini kullanarak yarı kantitatif PCR ile normalleştirin.
   12. Ana karışımı Tablo 4'te belirtildiği gibi yarı kantitatif PCR için hazırlayın ve amplifikasyon için test numunesi tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin. PCR amplifikasyon koşulları Tablo 5'te belirtilmiştir.
2. Histoloji ve immünohistokimya
   1. Optik kapları 2,0 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve fazla ortamı aspire edin (adım 4.2.3-4.2.6). Organoidleri 1x PBS ile durulayın ve daha sonra oda sıcaklığında gece boyunca sabitlemek için 500 μL% 4 Paraformaldehit içinde yıkayın ve askıya alın.
   2. Ertesi gün, bardakları deiyonize suda yıkayın. Bardakların% 95 alkol (üç değişiklik, her biri 15-20 dakika), ardından% 100 alkol (üç değişiklik, her biri 15-20 dakika), 15 dakika boyunca 1: 1 mutlak alkol ve ksilen karışımı, ksilen (iki değişiklik, her biri 15 dakika) ve parafin (üç değişiklik, her biri 15 dakika) içinde durmasına izin verin. Standart prosedürleri izleyerek bir parafin bloğu hazırlamak için bu dokuyu gömün. Soğumasına ve katılaşmasına izin verin.
   3. Bir mikrotom kullanarak ince kesitler (~ 4-5 μm kalınlığında) hazırlayın ve standart histoloji prosedürlerini izleyerek silan kaplı mikroskobik slaytlara (bakınız Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
   4. Deparafinizasyon için, slaytları 70 ° C'de bir ısıtma bloğu üzerinde 15-20 dakika ısıtın. Balmumu eridikten sonra, slaytları parafini tamamen çıkaracak olan ksilen (üç değişiklik, her biri 3-4 dakika) ile yıkayın.
      NOT: Parafinin eksik çıkarılması, büyük miktarda arka plan gürültüsü olan bölümlerin zayıf/yamalı boyanmasına neden olur.
   5. Her biri 3 dakika boyunca farklı etanol yüzdeleri (% 100,% 90 ve% 80) kullanarak slaytları yeniden nemlendirin. Slaytları damıtılmış suyla durulayın ve antijen alımına devam edin.
   6. Antijen alımına başlamadan önce, sitrat tamponunu (pH 6.0) bir Coplin kavanozunda (bakınız Malzeme Tablosu) bir mikrodalga fırın kullanarak 95-100 ° C'ye ulaşana kadar önceden ısıtın.
   7. Slaytları önceden ısıtılmış sitrat tamponuna daldırın ve kavanozu mikrodalga fırında 15 dakika ısıtın. Coplin kavanozunu fırından çıkarın ve oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
   8. 5 dakika boyunca 1: 1 metanol ve hidrojen peroksit karışımı ekleyerek endojen peroksidaz için bölümleri bloke edin, ardından bölümleri 1x PBS ile üç kez yıkayın.
   9. Kesitleri 15 dakika boyunca% 0.5 Triton-X 100 kullanarak geçirgenleştirin. Slaytları 1x PBS ile üç kez yıkayın.
   10. Bölümleri 1 saat boyunca 1x PBS'de% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile inkübe ederek primer antikorun spesifik olmayan bağlanmasını bloke edin.
   11. Bölümleri oda sıcaklığında 1 saat veya 4 ° C'de bir gece boyunca birincil antikorla inkübe edin. Bağlanmamış antikoru çıkarmak için slaytları her biri 3-5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
   12. Uygun floresan boya konjuge ikincil antikor ekleyin ve 45 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları her biri 3-5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
       NOT: Antikorlar ve bunların ilgili seyreltmeleri Malzeme Tablosunda belirtilmiştir. Retinal organoid kesitler, erken nöro-retinal öncü hücreleri tespit etmek için PAX6 ve CHX10 kullanılarak ve işlenen retinal ve fotoreseptör öncü hücrelerini tespit etmek için Recoverin ve CRX kullanılarak immüno-etiketlendi. Benzer şekilde, RPE öncüllerini tespit etmek için anti-PAX6 ve anti-MITF kullanıldı ve 2D tek katmanlı kültürlerin immünositokimyası ile pigmentli olgun RPE hücrelerini tespit etmek için anti-CRALBP ve anti-RPE65 kullanıldı.
   13. Bölümleri DAPI veya PI ile karşı boyama ve antifade montaj ortamını kullanarak bir cam slayt üzerine monte edin (bkz.
   14. Farklı retinal belirteçleri ifade eden farklı hücre katmanlarını incelemek için floresan veya konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak retinal organoidlerin ve RPE kültürlerinin immüno-etiketli bölümlerini görüntüleyin ve belgeleyin.

Sonuçlar

HiPSC'lerin göz soylarına farklılaşması, Şekil 1'de açıklandığı gibi, takviyeleri ve büyüme faktörlerini içeren farklı kültür ortamı kokteyllerindeki hücrelerin farklı zaman noktalarında sıralı adımlarla kültürlenmesiyle elde edilir. HiPSC kültürleri, pluripotent kök hücre bakım ortamı olan Essential 8 ortamında tutulur. % 70-80 akıcılığa ulaştıklarında (Şekil 2A), ortam 1 ng / mL bFGF, 1 ng / mL Noggin ve% 1 N2 takviyes...

Tartışmalar

hiPSC'ler in vitro organ ve doku gelişimini incelemek için güçlü bir araçtır. Sağlıklı ve hastalığa özgü hiPSC'leri retina soyuna doğru ayırt ederek hastalık fenotipinin özetlenmesi, kalıtsal retina distrofilerinin farklı formlarının patofizyolojisi hakkında daha yeni bilgiler edinilmesine yardımcı olabilir. PSC'lerin retinal hücre tiplerine in vitro farklılaşması için çeşitli protokoller tanımlanmış ve benimsenmiştir. Bunların çoğu, rekombinant büyüme faktörler...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe filters	TPP	99722
15 mL centrifuge tube	TPP	91015
50 mL centrifuge tube	TPP	91050
6 well plates	TPP	92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal	Santa Cruz	SC365519	1:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal	Abcam	ab140603	1:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal	Abcam	ab3201	1:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal	Millipore	AB5585	1:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher	17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF)	Sigma Aldrich	F0291
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Coplin Jar (50 mL)	Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	354277
CryoTubes	Thermo Fisher	V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium)	Thermo Fisher	10565-018
DreamTaq DNA polymerase	Thermo Fisher	EP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	14190144
Essential 8 medium kit	Thermo Fisher	A1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm	Corning	351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States	Gibco	26140079
GelDocXR+ with Image lab software	BIO-RAD		Agarose Gel documentation system
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11030	1:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546	Invitrogen	A11035	1:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1:300 dilution
HistoCore MULTICUT	Leica		For sectioning
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
L-Acsorbic acid	Sigma Aldrich	A92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
N2 supplement (100x)	Thermo Fisher	17502048
NanoDrop 2000	Thermo Fisher		To quantify RNA
Paraformaldehyde	Qualigens	23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged	Corning	7095D-9
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal	Abcam	ab183951	1:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal	Abcam	ab195045	1:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal	Abcam	ab231782	1:300 dilution
Recombinant Human Noggin Protein	R&D Systems	6057-NG
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Serological pipettes 10 mL	TPP	94010
Serological pipettes 5 mL	TPP	94005
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	S4641
Starfrost (silane coated) microscopic slides	Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	18080051
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector laboratories	H-1200
Vitronectin	Thermo Fisher	A27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor)	Sigma Aldrich	Y0503
Zeiss LSM 880	Zeiss		Confocal microscope