تصوير الخلايا الحية للكرات الأرضية خارج الجسم الحي السليمة باستخدام حامل مطبوع 3D جديد

Summary

يصف هذا العمل بروتوكولا تجريبيا جديدا يستخدم حاملا مطبوعا ثلاثي الأبعاد لتمكين تصوير الخلايا الحية عالي الدقة للكرات الأرضية المنزوعة. من خلال هذا البروتوكول ، يمكن ملاحظة نشاط إشارات الكالسيوم الخلوية في ظهارة القرنية المصابة من الكرات الأرضية خارج الجسم الحي في الوقت الفعلي.

Abstract

التئام الجروح الظهارية القرنية هو عملية هجرة تبدأ عن طريق تنشيط مستقبلات purinergic المعبر عنها على الخلايا الظهارية. ينتج عن هذا التنشيط أحداث تعبئة الكالسيوم التي تنتشر من خلية إلى أخرى ، وهي ضرورية لبدء الحركة الخلوية في سرير الجرح ، مما يعزز التئام الجروح بكفاءة. طور مختبر Trinkaus-Randall منهجية لتصوير استجابة التئام جروح القرنية في كرات الفئران خارج الجسم الحي في الوقت الفعلي. يتضمن هذا النهج استئصال كرة أرضية سليمة من فأر تم قتله رحيما وفقا للبروتوكولات المعمول بها واحتضان الكرة الأرضية على الفور بصبغة مؤشر الكالسيوم. يمكن تطبيق صبغة مضادة تلطخ الميزات الأخرى للخلية في هذه المرحلة للمساعدة في التصوير وإظهار المعالم الخلوية. عمل البروتوكول بشكل جيد مع العديد من أصباغ الخلايا الحية المختلفة المستخدمة في مكافحة التلطيخ ، بما في ذلك الأكتين SiR لتلطيخ الأكتين وصبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة لتلطيخ غشاء الخلية. لفحص الاستجابة للجرح ، يتم إصابة ظهارة القرنية باستخدام إبرة 25 G ، ويتم وضع الكرات الأرضية في حامل مطبوع 3D. تتم معايرة أبعاد حامل الطباعة 3D لضمان تجميد الكرة الأرضية طوال مدة التجربة ويمكن تعديلها لاستيعاب العيون ذات الأحجام المختلفة. يتم إجراء التصوير بالخلايا الحية لاستجابة الجرح بشكل مستمر على أعماق مختلفة في جميع أنحاء الأنسجة بمرور الوقت باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يسمح لنا هذا البروتوكول بإنشاء صور عالية الدقة وجودة النشر باستخدام هدف هوائي 20x على مجهر متحد البؤر. يمكن أيضا استخدام أهداف أخرى لهذا البروتوكول. وهو يمثل تحسنا كبيرا في جودة تصوير الخلايا الحية في كرات الفئران خارج الجسم الحي ويسمح بتحديد الأعصاب والظهارة.

Introduction

القرنيه
القرنية عبارة عن بنية شفافة غير وعائية تغطي السطح الأمامي للعين والتي تنكسر الضوء لتمكين الرؤية وتحمي الجزء الداخلي من العين من التلف. نظرا لأن القرنية تتعرض للبيئة ، فهي عرضة للتلف من الأسباب الميكانيكية (الخدش) ومن العدوى. عادة ما تلتئم إصابة القرنية في مريض سليم في غضون 1-3 أيام. ومع ذلك ، في المرضى الذين يعانون من حالات كامنة بما في ذلك نقص الخلايا الجذعية الحوفية ومرض السكري من النوع الثاني ، يمكن أن تطول عملية التئام جروح القرنية^{بشكل كبير 1}. نظرا لأن القرنية معصبة للغاية ، فإن قرح القرنية غير الشافية وتآكل القرنية المتكرر مؤلمة للغاية وتقلل بشكل كبير من نوعية حياة المرضى الذين يعانون منها¹.

إشارات الخلية
عندما تصاب قرنية سليمة ، تسبق أحداث إشارات الكالسيوم في الخلايا المجاورة للجرح وتدفع الهجرة الخلوية إلى سرير الجرح ، حيث تغلق الإصابة دون التعرض لخطر التندب ^2,3. تم وصف أحداث الإشارات هذه بشكل جيد في نماذج زراعة الخلايا الظهارية للقرنية باستخدام تصوير الخلايا الحية². تظهر التجارب الأولية إشارات الكالسيوم بشكل ملحوظ بعد الإصابة في الخلايا غير المصابة بالسكري مقارنة بخلايا السكري. ومع ذلك ، فقد ثبت أن توصيف أحداث إشارات الخلية في الكرات الأرضية خارج الجسم الحي يمثل تحديا تقنيا.

تصوير الخلايا الحية
نجحت الدراسات السابقة في تسجيل أحداث إشارات الكالسيوم من نماذج زراعة الخلايا في المختبر لالتئام جروح القرنية⁴،^5،6. إن تطوير منهجية لإنتاج صور عالية الجودة لأحداث الإشارات هذه في الأنسجة خارج الجسم الحي أمر مهم للغاية لأنه سيسمح بدراسة هذه الأحداث في نظام أكثر تعقيدا وواقعية. تضمنت الأساليب السابقة تشريح القرنية متبوعا بالشلل في جل PEG^الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية 7،^8،9. يعد التثبيت خطوة أساسية ولكنها صعبة عند العمل مع الأنسجة الحية ، حيث يجب أن تظل قابلة للحياة ورطبة طوال فترة التجربة. علاوة على ذلك ، يجب ألا يؤدي الشلل إلى إتلاف الأنسجة. في حين أن حل PEG يجمد الأنسجة ، إلا أن دقة وجودة الصور المنتجة لم تكن متسقة. لذلك ، تم تطوير حوامل مطبوعة 3D لشل حركة الكرات الأرضية السليمة لإنتاج صور عالية الجودة مع مخاطر أقل لتلف الأنسجة.

النهج المتبع
تم تطوير حامل مطبوع 3D فريد من نوعه لشل حركة الكرات الأرضية خارج الجسم الحي لتصوير الخلايا الحية. يمنع هذا الحامل الضرر من مصدرين رئيسيين: فهو يسمح بتصوير الكرة الأرضية المنزوعة النواة دون الحاجة إلى تشريح القرنية ، ويزيل التعرض للأشعة فوق البنفسجية. بدون مصادر الضرر هذه ، مثلت الصور التي تم الحصول عليها بدقة أكبر الاستجابة لإصابات الخدش التي تم إجراؤها تجريبيا. علاوة على ذلك ، تمت معايرة حامل الطباعة 3D إلى الأبعاد الدقيقة لعين الفأر. قدم هذا ملاءمة أفضل بكثير من الشلل في محلول PEG ، مما أدى إلى صورة عالية الجودة في أهداف أقل طاقة بسبب انخفاض حركة الأنسجة. يضمن قضيب الغطاء المتصل بالجزء العلوي من الحامل بقاء الكرة الأرضية غير متحركة طوال مدة التجربة وعدم وجود إزاحة للكرة الأرضية عند تطبيق وسائط النمو للحفاظ على الترطيب والحيوية. تتيح لنا القدرة على طباعة الحامل بأبعاد دقيقة أيضا إنشاء ملاءمة مثالية لعيون الفئران ذات الأحجام المختلفة بسبب العمر أو حالة المرض. يمكن تطبيق هذه التكنولوجيا على نطاق أوسع لتطوير حوامل لعيون الأنواع المختلفة بناء على أبعادها.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في رعاية العيون وأبحاث الرؤية وبروتوكول IACUC بجامعة بوسطن (201800302).

1. تصميم أصحاب المطبوعة 3D وشريط الغطاء

1. تصميم حوامل الطباعة ثلاثية الأبعاد وشريط الغطاء الذي يمثل متوسط قطر كرات الماوس وطباعة التصميم ثلاثي الأبعاد (الشكل 1 أ ، ب).
2. حافظ على قطر الجدار الداخلي للحامل أكبر قليلا من متوسط قطر الكرة الأرضية لحساب الأحجام المختلفة للفئران الفردية. حافظ على ارتفاع الحامل عند حوالي نصف قطر الكرة الأرضية ، مما يضمن ملاءمة محكمة للكرة الأرضية عند تأمينها بواسطة شريط الغطاء المطبوع 3D.
3. قم بقياس قضيب غطاء الحامل بطول القطر الخارجي للحامل بعرض يتراوح من 1/4 إلى 1/2 من قطر الحامل. تم تحديد حجم قضيب الغطاء للسماح بالوصول إلى الكرة الأرضية عند تثبيته في الحامل للترطيب وإزالة العين في نهاية التجربة.
4. اطبع الحامل وشريط الغطاء.

2. جمع العينات

1. تم استخدام فئران القتل الرحيم (ذكور C57BL / 6 فئران تتراوح أعمارهم بين 9-12 أسبوعا و 27 أسبوعا في هذه الدراسة) باستخدام البروتوكولات المعمول بها وفقا للإرشادات المؤسسية. بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بإجراء القتل الرحيم بثاني أكسيد الكربون متبوعا بقطع الرأس.
2. قم بإزالة رأس الماوس وضعه على الفور على الثلج للحفاظ على صلاحية الأنسجة. قم باستئصال الكرات الأرضية باستخدام أدوات التشريح مع منع تلف الأنسجة.
3. بروتينوز الكرة الأرضية باستخدام ملاقط. قص العصب البصري باستخدام مقص تشريح أسفل المكان الذي تمسكه به الملقط.
   ملاحظة: لمزيد من الاحتياطات ، قم بتنفيذ الخطوات التالية في غطاء التدفق الرقائقي.
4. احتضان الكرات الأرضية في 2 مل من الوسط في طبق زراعة الخلايا p35 بما في ذلك مؤشر الكالسيوم و / أو صبغة غشاء الخلية لمدة 1 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ مع ظروف الإضاءة المنخفضة. تأكد من غمر الكرات الأرضية في وسط التلوين لتلطيخ موحد.
   1. بالنسبة للتجارب التي أجريت هنا ، استخدم مؤشر الكالسيوم ، Fluo4-AM (1: 100) 2 ، وصبغة مضادة غشاء الخلية ، صبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة (1: 10000) 2 ، بتركيز نهائي 1٪ (v / v) DMSO و 0.1٪ (وزن / حجم) حمض بلورونيك في ² مل من وسط مصل الخلايا الكيراتينية الخالي (KSFM) مع مكملات النمو التالية: 25 ميكروغرام / مل مستخلص الغدة النخامية البقري ، 0.02 نانومتر عامل نمو البشرة ، 0.3 mM CaCl₂ ، والبنسلين الستربتومايسين (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل ، على التوالي).
      ملاحظة: تختلف ظروف وأوقات الحضانة اعتمادا على مؤشر الكالسيوم ونوع الأنسجة وحجم العينة. عند استخدام حمض pluronic ، ينصح بالحذر لأنه يجعل الأنسجة قابلة للنفاذ. يدعو هذا البروتوكول إلى 10٪ حمض بلورونيك. تم تحديد تركيزات أقل من حمض pluronic تجريبيا لتكون غير فعالة ، والتركيزات الأعلى خطر تلف الأنسجة.

3. إعداد حاملي العينات

1. قم بلصق الحوامل على غطاء زجاجي نظيف مع غراء لم يتم استخدامه من قبل. يأتي الغراء المستخدم في هذا البروتوكول من حاويات تستخدم مرة واحدة لضمان العقم ويتم استخدام حاوية جديدة غير مفتوحة في كل مرة.
2. اغسل الحامل بنسبة 70٪ إيثانول. ضع الغراء على الحامل وألصق الحامل بغطاء الغطاء السفلي الزجاجي. تأكد من عدم وجود غراء داخل المنطقة الداخلية للحامل لأن الغراء يمكن أن يتألق ، مما يعقد التصوير.
3. انتظر حتى يصلب الغراء. تأكد من أن الحامل محكم ضد قسيمة الغطاء.
   ملاحظة: تم استخدام ألواح الخلايا P35 ذات أغطية ذات قاع زجاجي للتجارب المعروضة في هذه المخطوطة. يمكن استبدال الشرائح و / أو الألواح الأخرى ذات القاع الزجاجي بناء على احتياجات التجربة.

4. جرح كرات العين

1. قم بإزالة الكرات الأرضية من محلول التلوين باستخدام قطارات العين المعقمة ، مع الحرص على منع تلف الأنسجة في المنطقة محل الاهتمام. اغسل الكرات الأرضية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات لإزالة البقع الزائدة ، وضع الكرات الأرضية في الوسط لنقلها إلى المجهر.
2. جرح الكرات الأرضية باستخدام إبرة معقمة 25 غرام في المنطقة محل الاهتمام.
   1. باستخدام قطارة العين المعقمة ، التقط الكرة الأرضية وأمسك بها من مؤخرة العين. سيؤدي ذلك إلى الحفاظ على استقرار الكرة الأرضية ، ومنعها من التدحرج ، والسماح بعمل جروح ثابتة. باستخدام هذا الإعداد ، سيكون العصب البصري داخل فوهة قطارة العين ، وستكون القرنية متجهة للخارج.
   2. لجرح الخدش ، حرك إبرة معقمة برفق 25 جم عبر القرنية المكشوفة. لجرح ثقب ، اضغط برفق على الإبرة مباشرة في القرنية المركزية. تأكد من أن الجرح لا يثقب القرنية.
      ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا لم تكن استجابة الجرح أو البيئة الجريحة مطلوبة للتجربة. أظهرت الدراسات السابقة أن كلا من جروح الخدش وجروح البزل في قرنية الفئران المصنوعة باستخدام هذه الطريقة متسقة في كل من القطر والعمق¹⁰. تم تأكيد أبعاد الجرح بين الكرات الأرضية المستقلة باستخدام تحليل منطقة الاهتمام.

5. وضع العينة على حامل

1. ضع القرنية أو منطقة القزحية على غطاء الغطاء في المنطقة الداخلية للحامل وثبت باستخدام الغطاء المطبوع 3D (الشكل 1C-H).
2. تأكد من وضع الكرة الأرضية بشكل صحيح وأن موقع الاهتمام ملامس لغطاء الغطاء الزجاجي. بمجرد وضع الكرة الأرضية في الحامل ، لا تحاول إزالة الكرة الأرضية لأن ذلك قد يتسبب في تلف الأنسجة.
3. التمسك غطاء مطبوع 3D لحامل باستخدام الغراء، وضمان الاستقرار. تأكد من أن شريط الغطاء يلتصق بالحامل وليس بالكرة الأرضية.
   ملاحظة: يتم وضع المنطقة المراد تصويرها لأسفل لأن البروتوكول مكتوب للاستخدام على مجهر مقلوب. يمكن تكييف البروتوكول مع المجاهر المستقيمة باستخدام حوامل ذات نصف قطر داخلي أصغر وإزالة شريط الغطاء. سيؤدي هذا إلى استقرار أقل للكرة الأرضية.

6. تصوير العينة

1. قم بتشغيل المجهر والغرفة البيئية وتحقق من ترطيب الغرفة. اضبط الغرفة البيئية على 35 درجة مئوية و 5٪ CO₂ طوال مدة التجربة.
   ملاحظة: يفضل استخدام المجاهر ذات الغرف البيئية لهذا الإجراء لمنع الجفاف والحفاظ على الكرة الأرضية في درجات حرارة مثالية ولكنها غير مطلوبة.
2. ضع الغطاء والحامل والكرة الأرضية المستقرة على مسرح المجهر داخل الغرفة البيئية والصورة باستخدام تقنيات التصوير بالخلايا الحية⁹.
3. ماصة وسائط نمو إضافية على غطاء الغطاء لمنع الجفاف والحفاظ على صلاحية الأنسجة. تأكد من وجود وسيط كاف في البئر لتغطية الكرة الأرضية في الحامل. اعتمادا على مدة التصوير ، أضف وسيطا جديدا عند الحاجة طوال التجربة.
4. ابدأ التجارب باستخدام تقنيات وبروتوكولات التصوير بالخلايا الحية. استخدم إعدادات الليزر منخفضة الطاقة للحفاظ على الأنسجة ومنع تلف الأنسجة في التجارب طويلة الأمد. استخدم الأهداف المناسبة لمسافات العمل الطويلة. أجريت التجارب في هذه المخطوطة باستخدام هدف 20x.
   ملاحظة: قوة الليزر وكسبه ، والمدة التجريبية ، والموقع ، ومستوى التصوير كلها متغيرات اعتمادا على المعلمات التجريبية. تم إجراء تجارب التصوير على الكرات الأرضية السليمة التي تتراوح مدتها من 1 ساعة إلى 4 ساعات بنجاح في المنشورات السابقة¹⁰.
5. تسجيل وحفظ البيانات بتنسيق الملف المفضل. ينتج البرنامج الذي يستخدمه المجهر ملفات .czi لتسجيل البيانات.
6. تخلص من الكرات الأرضية وفقا للبروتوكولات المؤسسية القياسية في نهاية البروتوكول.

النتائج

تم استخدام هذا البروتوكول لإنتاج بيانات وصور بجودة النشر^{باستمرار 10}. تمثل الصور التي تم الحصول عليها تحسنا كبيرا عند مقارنتها بالنهج السابقة (الشكل 2). باستخدام حامل الطباعة ثلاثية الأبعاد ، يمكن التقاط الصور في جميع أنحاء طبقات القرنية ، ويمكن ملاحظة تعبئة ال?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول تقنية تصوير الخلايا الحية التي تستخدم حامل مطبوع 3D لتثبيت وتثبيت عيون الحيوانات السليمة. إنه مصمم للتحايل على العديد من العيوب المهمة المعترف بها مع بروتوكولات تصوير الخلايا الحية السابقة لأنسجة القرنية خارج الجسم الحي . يوفر هذا البروتوكول العديد من المزايا لتصو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic	Creality (Shenzen, China)	N/A	Material for holder
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-14-C	Well for imaging.
Autodesk Fusion 360 software	Autodesk (San Rafael, CA).	N/A	Software used for printing the holders.
BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)	305124	For experimentally-induced wounds to the globes
CellMask DeepRed	Invitrogen (Carlsbad, CA)	C10046	Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Complete Home Super Glue	Walgreens (Deerfield, IL)	N/A	For attaching the holder to the imaging well
Ender 3 Pro 3D printer	Creality (Shenzen, China)	N/A	For printing the holder
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	License Number: GPL2	Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Keratinocyte Serum-Free Medium	Gibco (Waltham, MA)	17005042	25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium
Phophate-Buffered Saline (PBS)	Corning, Medlabtech (Manassas, VA)	21-040-CV	Used to wash excess stain off of corneas before imaging
Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan	Zeiss (Thornwood, NY)	N/A	20x magnification objective was used