Imágenes de células vivas de globos intactos ex vivo utilizando un novedoso soporte impreso en 3D

Resumen

El presente trabajo describe un novedoso protocolo experimental que utiliza un soporte impreso en 3D para permitir imágenes de células vivas de alta resolución de globos enucleados. A través de este protocolo, la actividad de señalización de calcio celular en el epitelio corneal herido de globos ex vivo se puede observar en tiempo real.

Resumen

La cicatrización de heridas epiteliales corneales es un proceso migratorio iniciado por la activación de receptores purinérgicos expresados en las células epiteliales. Esta activación da como resultado eventos de movilización de calcio que se propagan de célula a célula, que son esenciales para iniciar la motilidad celular en el lecho de la herida, promoviendo la cicatrización eficiente de la herida. El laboratorio de Trinkaus-Randall ha desarrollado una metodología para obtener imágenes de la respuesta de cicatrización de heridas corneales en globos murinos ex vivo en tiempo real. Este enfoque implica la enucleación de un globo intacto de un ratón que ha sido sacrificado según los protocolos establecidos e inmediatamente la incubación del globo con un tinte indicador de calcio. Una contratinción que tiñe otras características de la célula se puede aplicar en esta etapa para ayudar con las imágenes y mostrar puntos de referencia celulares. El protocolo funcionó bien con varios colorantes de células vivas diferentes utilizados para la contratinción, incluida la actina SiR para teñir la actina y la tinción de la membrana plasmática de color rojo intenso para teñir la membrana celular. Para examinar la respuesta a una herida, el epitelio corneal se lesiona con una aguja de 25 G, y los globos se colocan en un soporte impreso en 3D. Las dimensiones del soporte impreso en 3D están calibradas para garantizar la inmovilización del globo durante toda la duración del experimento y se pueden modificar para adaptarse a ojos de diferentes tamaños. Las imágenes de células vivas de la respuesta de la herida se realizan continuamente a varias profundidades en todo el tejido a lo largo del tiempo utilizando microscopía confocal. Este protocolo nos permite generar imágenes de alta resolución y calidad de publicación utilizando un objetivo de aire 20x en un microscopio confocal. Otros objetivos también se pueden utilizar para este protocolo. Representa una mejora significativa en la calidad de las imágenes de células vivas en globos murinos ex vivo y permite la identificación de nervios y epitelio.

Introducción

Córnea
La córnea es una estructura transparente y avascular que cubre la superficie anterior del ojo que refracta la luz para permitir la visión y protege el interior del ojo del daño. Como la córnea está expuesta al medio ambiente, es susceptible al daño tanto por causas mecánicas (rascado) como por infección. Una lesión corneal en un paciente sano generalmente se cura dentro de 1-3 días. Sin embargo, en pacientes con afecciones subyacentes, incluida la deficiencia de células madre limbares y la diabetes tipo II, el proceso de cicatrización de la herida corneal puede prolongarse en gran medida¹. Como la córnea está altamente inervada, estas úlceras corneales que no cicatrizan y las erosiones corneales recurrentes son muy dolorosas y disminuyen en gran medida la calidad de vida de los pacientes que las experimentan¹.

Señalización celular
Cuando una córnea sana se lesiona, los eventos de señalización de calcio en las células adyacentes a la herida preceden y provocan la migración celular al lecho de la herida, donde cierran la lesión sin riesgo de cicatrización ^2,3. Estos eventos de señalización han sido bien caracterizados en modelos de cultivo de células epiteliales corneales utilizando imágenes de células vivas². Los experimentos preliminares demuestran significativamente más señalización de calcio después de una lesión en células no diabéticas en comparación con las células diabéticas. Sin embargo, la caracterización de los eventos de señalización celular en globos ex vivo ha demostrado ser un desafío técnico.

Imágenes de células vivas
Estudios previos han registrado con éxito eventos de señalización de calcio a partir de modelos de cultivo celular in vitro de cicatrización de heridas corneales ^4,5,6. El desarrollo de una metodología para producir imágenes de alta calidad de estos eventos de señalización en tejido ex vivo es de gran interés porque permitiría el estudio de estos eventos en un sistema más complejo y real. Los enfoques anteriores han implicado la disección de la córnea seguida de la inmovilización en un gel PEG inducido por UV ^7,8,9. La inmovilización es un paso esencial pero desafiante cuando se trabaja con tejido vivo, ya que debe permanecer viable e hidratado durante todo el transcurso del experimento. Además, la inmovilización no debe dañar el tejido. Mientras que la solución de PEG inmovilizó el tejido, la resolución y la calidad de las imágenes producidas no fueron consistentes. Por lo tanto, los soportes impresos en 3D se desarrollaron para inmovilizar globos intactos para producir imágenes de mayor calidad con menos riesgo de daño tisular.

El enfoque
Se desarrolló un soporte impreso en 3D único para inmovilizar globos intactos ex vivo para obtener imágenes de células vivas. Este soporte evita el daño de dos fuentes principales: permite obtener imágenes de un globo enucleado sin la necesidad de diseccionar la córnea y elimina la exposición a la luz UV. Sin estas fuentes de daño, las imágenes obtenidas representaron con mayor precisión la respuesta a las lesiones por rasguños realizadas experimentalmente. Además, el soporte impreso en 3D se calibró con las dimensiones precisas del ojo murino. Esto proporcionó un ajuste mucho mejor que la inmovilización en la solución PEG, lo que llevó a una imagen de mayor calidad en objetivos de menor potencia debido a la disminución del movimiento del tejido. Una barra de cubierta unida a la parte superior del soporte asegura que el globo permanezca inmóvil durante toda la duración del experimento y que no haya desplazamiento del globo cuando se aplica un medio de crecimiento para mantener la hidratación y la viabilidad. La capacidad de imprimir el soporte a dimensiones precisas también nos permite generar un ajuste óptimo para ojos murinos de diferentes tamaños debido a la edad o estado de la enfermedad. Esta tecnología se puede aplicar más ampliamente para desarrollar soportes para los ojos de diferentes especies en función de sus dimensiones.

Protocolo

Los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Cuidados Oftalmológicos e Investigación de la Visión y el protocolo IACUC de la Universidad de Boston (201800302).

1. Diseño de los soportes impresos en 3D y la barra de cubierta

1. Diseñe los soportes impresos en 3D y la barra de cubierta que representan el diámetro promedio de los globos del ratón e imprima en 3D el diseño (Figura 1A, B).
2. Mantenga el diámetro de la pared interna del soporte ligeramente más grande que el diámetro promedio del globo para tener en cuenta los diferentes tamaños de ratones individuales. Mantenga la altura del soporte en aproximadamente la mitad del diámetro del globo, asegurando un ajuste ajustado del globo cuando se asegura con la barra de cubierta impresa en 3D.
3. Ajuste el tamaño de la barra de cubierta del soporte a la longitud del diámetro exterior del soporte con un ancho que sea de 1/4 a 1/2 del diámetro del soporte. La barra de cobertura está dimensionada para permitir el acceso al globo cuando se asegura en el soporte para la hidratación y la extracción del ojo al final del experimento.
4. Imprima el soporte y la barra de cubierta.

2. Recogida de muestras

1. Eutanasia en ratones (se utilizaron ratones machos C57BL/6 de 9-12 semanas y 27 semanas de edad para este estudio) utilizando protocolos establecidos de acuerdo con las directrices institucionales. Para este protocolo, realice la eutanasia con dióxido de carbono seguida de la decapitación.
2. Retire la cabeza del ratón y colóquela inmediatamente sobre hielo para preservar la viabilidad del tejido. Nuclee los globos usando herramientas de disección mientras previene el daño tisular.
3. Proptose el globo con pinzas. Recorte el nervio óptico con tijeras de disección justo debajo de donde lo sostienen las pinzas.
   NOTA: Para mayor precaución, realice los siguientes pasos en una campana de flujo laminar.
4. Incubar los globos en 2 ml de medio en una placa de cultivo celular p35 que incluya un indicador de calcio y/o tinción de membrana celular durante 1 h en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C con condiciones de poca luz. Asegúrese de que los globos estén sumergidos en el medio de tinción para una tinción uniforme.
   1. Para los experimentos realizados aquí, utilice el indicador de calcio, Fluo4-AM (1:100)2, y la contratificación de la membrana celular, tinción de membrana plasmática de color rojo intenso (1:10.000)2, con una concentración final de 1% (v/v) de DMSO y 0,1% (p/v) de ácido plurónico en ² mL de medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) con los siguientes suplementos de crecimiento: 25 μg/ml de extracto hipofisario bovino, 0,02 nM factor de crecimiento epidérmico, 0,3 mM CaCl₂ y penicilina-estreptomicina (100 unidades/ml y 100 μg/ml, respectivamente).
      NOTA: Las condiciones y tiempos de incubación son variables dependiendo del indicador de calcio, el tipo de tejido y el volumen de la muestra. Cuando se usa ácido plurónico, se recomienda precaución ya que hace que el tejido sea permeable. Este protocolo requiere un 10% de ácido plurónico. Se ha determinado experimentalmente que las concentraciones más bajas de ácido plurónico son ineficaces, y las concentraciones más altas corren el riesgo de dañar el tejido.

3. Preparación de portamuestras

1. Adhiera los soportes a un cubreobjetos limpio con fondo de vidrio con pegamento que no se haya utilizado anteriormente. El pegamento utilizado en este protocolo proviene de contenedores de un solo uso para garantizar la esterilidad y se usa un recipiente nuevo sin abrir cada vez.
2. Lave el soporte en etanol al 70%. Coloque pegamento en el soporte y adhiera el soporte al cubreobjetos inferior de vidrio. Asegúrese de que no haya pegamento dentro del área interna del soporte, ya que el pegamento puede fluorescer, lo que complica las imágenes.
3. Espere hasta que el pegamento se solidifique. Confirme que el soporte esté seguro contra el cubreobjetos.
   NOTA: Se utilizaron placas celulares P35 con cubreobjetos con fondo de vidrio para los experimentos presentados en este manuscrito. Otras diapositivas y / o placas con fondo de vidrio pueden ser sustituidas según las necesidades del experimento.

4. Heridas en los globos oculares

1. Retire los globos de la solución de tinción con goteros estériles, teniendo cuidado de evitar daños tisulares en la región de interés. Lave los globos durante 5 minutos a temperatura ambiente con solución salina estéril tamponada con fosfato para eliminar el exceso de mancha, y coloque los globos en el medio para transportarlos al microscopio.
2. Enrolle los globos con una aguja estéril de 25 G en la región de interés.
   1. Con un gotero estéril, levante y sostenga el globo desde la parte posterior del ojo. Esto mantendrá el globo estable, evitará que ruede y permitirá que se hagan heridas consistentes. Usando esta configuración, el nervio óptico estará dentro de la boquilla del gotero y la córnea estará mirando hacia afuera.
   2. Para una herida por rasguño, mueva suavemente una aguja estéril de 25 G a través de la córnea expuesta. Para una herida punzante, presione suavemente la aguja directamente en la córnea central. Asegúrese de que la herida no perfore la córnea.
      NOTA: Omita este paso si no se requiere una respuesta de herida o un entorno herido para el experimento. Estudios previos han demostrado que tanto las heridas por rasguños como las heridas punzantes en córneas murinas realizadas con este método son consistentes tanto en diámetro como en profundidad¹⁰. La confirmación de las dimensiones de la herida entre globos independientes se realizó mediante un análisis de región de interés.

5. Colocación de la muestra en el soporte

1. Coloque la córnea o la región limbal sobre el cubreobjetos en el área interna del soporte y estabilice utilizando la cubierta impresa en 3D (Figura 1C-H).
2. Confirme que el globo está colocado correctamente y que el sitio de interés está en contacto con el cubreobjetos de vidrio. Una vez que el globo se ha colocado en el soporte, no intente quitar el globo, ya que esto puede causar daño tisular.
3. Adhiera la cubierta impresa en 3D al soporte con pegamento, asegurando la estabilización. Asegúrese de que la barra de cubierta se adhiera al soporte y no al globo terráqueo.
   NOTA: El área que se va a fotografiar se coloca hacia abajo porque el protocolo está escrito para su uso en un microscopio invertido. El protocolo se puede adaptar para microscopios verticales utilizando soportes con un radio interior más pequeño y la eliminación de la barra de cubierta. Esto resultará en una menor estabilización del globo.

6. Imágenes de muestra

1. Encienda el microscopio y la cámara ambiental y verifique que la cámara esté humidificada. Ajuste la cámara ambiental a 35 °C y 5% de_CO2 durante la duración del experimento.
   NOTA: Los microscopios con cámaras ambientales son preferibles para este procedimiento para prevenir la deshidratación y mantener el globo a temperaturas óptimas, pero no son necesarios.
2. Coloque el cubreobjetos, el soporte y el globo estabilizado en la etapa del microscopio dentro de la cámara ambiental e imagen utilizando técnicas de imágenes de células vivas⁹.
3. Pipetear medios de crecimiento adicionales en el cubreobjetos para evitar la deshidratación y mantener la viabilidad del tejido. Asegúrese de que haya suficiente medio en el pozo para cubrir el globo en el soporte. Dependiendo de la duración de la imagen, agregue un medio fresco cuando sea necesario durante todo el experimento.
4. Comience los experimentos utilizando técnicas y protocolos de imágenes de células vivas. Utilice ajustes de láser de baja potencia para preservar el tejido y prevenir el daño tisular en experimentos de larga duración. Utilice objetivos apropiados para largas distancias de trabajo. Los experimentos en este manuscrito se realizaron utilizando un objetivo 20x.
   NOTA: La potencia y ganancia del láser, la duración experimental, la ubicación y el plano de imagen son variables dependiendo de los parámetros experimentales. Los experimentos de imágenes en globos intactos que van de 1 h a 4 h de duración se han realizado con éxito en publicaciones anteriores¹⁰.
5. Grabe y guarde los datos en el formato de archivo preferido. El software utilizado por el microscopio produce archivos .czi para el registro de datos.
6. Deseche los globos según los protocolos institucionales estándar al final del protocolo.

Resultados

Este protocolo se ha utilizado para producir consistentemente datos e imágenes con calidad de publicación¹⁰. Las imágenes obtenidas representan una mejora significativa en comparación con los enfoques anteriores (Figura 2). Usando el soporte impreso en 3D, las imágenes se pueden capturar a través de las capas de la córnea, y se puede observar la movilización de calcio en diferentes planos z (Figura 3). Este enfoque se ha utilizado...

Discusión

Este protocolo describe una técnica de imagen de células vivas que utiliza un soporte impreso en 3D para estabilizar e inmovilizar los ojos intactos de los animales. Está diseñado para eludir varias desventajas significativas reconocidas con protocolos previos de imágenes de células vivas de tejido corneal ex vivo . Este protocolo ofrece muchas ventajas para la obtención de imágenes de células vivas de globos intactos. Reduce significativamente el daño tisular innecesario que podría interferir con la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic	Creality (Shenzen, China)	N/A	Material for holder
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-14-C	Well for imaging.
Autodesk Fusion 360 software	Autodesk (San Rafael, CA).	N/A	Software used for printing the holders.
BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)	305124	For experimentally-induced wounds to the globes
CellMask DeepRed	Invitrogen (Carlsbad, CA)	C10046	Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Complete Home Super Glue	Walgreens (Deerfield, IL)	N/A	For attaching the holder to the imaging well
Ender 3 Pro 3D printer	Creality (Shenzen, China)	N/A	For printing the holder
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	License Number: GPL2	Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Keratinocyte Serum-Free Medium	Gibco (Waltham, MA)	17005042	25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium
Phophate-Buffered Saline (PBS)	Corning, Medlabtech (Manassas, VA)	21-040-CV	Used to wash excess stain off of corneas before imaging
Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan	Zeiss (Thornwood, NY)	N/A	20x magnification objective was used