הדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמים של Ex Vivo באמצעות מחזיק חדשני מודפס בתלת-ממד

Summary

העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול ניסיוני חדשני המשתמש במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לאפשר הדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה של גלובוסים דחוסים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לצפות בפעילות איתות הסידן התאי באפיתל קרנית פצועה מגלובוסים ex vivo בזמן אמת.

Abstract

ריפוי פצעי אפיתל בקרנית הוא תהליך נדידה היזום על ידי הפעלת קולטנים פורינרגיים המתבטאים בתאי אפיתל. הפעלה זו גורמת לאירועי גיוס סידן המתפשטים מתא לתא, החיוניים לייזום תנועתיות תאית לתוך מיטת הפצע, ומקדמים ריפוי פצעים יעיל. מעבדת טרינקאוס-רנדל פיתחה מתודולוגיה להדמיית תגובת ריפוי פצעי הקרנית בגלובוסים ex vivo murine בזמן אמת. גישה זו כוללת הרטבת גלובוס שלם מעכבר שעבר המתת חסד על פי פרוטוקולים שנקבעו ומיד דגירה של כדור הארץ באמצעות צבע מחוון סידן. בשלב זה ניתן ליישם כתם נגדי שמכתים תכונות אחרות של התא כדי לסייע בהדמיה ולהראות ציוני דרך תאיים. הפרוטוקול עבד היטב עם מספר צבעים שונים של תאים חיים המשמשים להכתמה נגדית, כולל אקטין SiR לצביעת אקטין וכתם קרום פלזמה אדום עמוק כדי להכתים את קרום התא. כדי לבחון את התגובה לפצע, אפיתל הקרנית נפגע באמצעות מחט 25 גרם, והגלובוסים ממוקמים במחזיק מודפס בתלת מימד. הממדים של המחזיק המודפס בתלת-ממד מכוילים כדי להבטיח אימוביליזציה של כדור הארץ לאורך כל משך הניסוי, וניתן לשנותם כך שיתאימו לעיניים בגדלים שונים. הדמיית תאים חיים של תגובת הפצע מבוצעת באופן רציף בעומקים שונים ברחבי הרקמה לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוטוקול זה מאפשר לנו להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה ובאיכות פרסום באמצעות מטרה אווירית של פי 20 במיקרוסקופ קונפוקלי. מטרות אחרות יכולות לשמש גם עבור פרוטוקול זה. הוא מייצג שיפור משמעותי באיכות הדמיית התאים החיים בגלובוסים ex vivo murine ומאפשר זיהוי של עצבים ואפיתל.

Introduction

קרנית
הקרנית היא מבנה שקוף ואווסקולרי המכסה את המשטח הקדמי של העין אשר שובר את האור כדי לאפשר ראייה ומגן על פנים העין מפני נזק. מכיוון שהקרנית חשופה לסביבה, היא רגישה לנזקים הן מסיבות מכניות (גירוד) והן מזיהום. פגיעה בקרנית אצל חולה בריא בדרך כלל מחלימה תוך 1-3 ימים. עם זאת, בחולים עם מחלות רקע, כולל מחסור בתאי גזע לימבליים וסוכרת מסוג II, תהליך הריפוי של פצעי הקרנית יכול להיות ממושך מאוד¹. מכיוון שהקרנית מאוד מופנמת, כיבים אלה שאינם מרפאים את הקרנית ושחיקות חוזרות ונשנות של הקרנית כואבים מאוד ופוגעים מאוד באיכות החיים של המטופלים החווים אותם¹.

איתות תאי
כאשר קרנית בריאה נפגעת, אירועי איתות סידן בתאים הסמוכים לפצע מקדימים וגורמים לנדידה תאית לתוך מיטת הפצע, שם הם סוגרים את הפציעה ללא סיכון של הצטלקות ^2,3. אירועי איתות אלה אופיינו היטב במודלים של תרביות תאי אפיתל בקרנית באמצעות הדמיית תאים חיים². ניסויים ראשוניים הדגימו איתות סידן גבוה יותר באופן משמעותי לאחר פציעה בתאים שאינם סוכרתיים בהשוואה לתאים סוכרתיים. עם זאת, אפיון אירועי האיתות הסלולרי בגלובוסים ex vivo התגלה כאתגר טכני.

הדמיית תאים חיים
מחקרים קודמים תיעדו בהצלחה אירועי איתות סידן ממודלים של תרביות תאים במבחנה של ריפוי פצעי בקרנית ^4,5,6. פיתוח מתודולוגיה להפקת תמונות באיכות גבוהה של אירועי איתות אלה ברקמת ex vivo הוא עניין רב מכיוון שהוא יאפשר לחקור אירועים אלה במערכת מורכבת ונאמנה יותר לחיים. גישות קודמות כללו כריתה של הקרנית ואחריה אימוביליזציה בג'ל PEG^המושרה על ידי UV ^7,8,9. אימוביליזציה היא צעד חיוני אך מאתגר בעבודה עם רקמות חיות, מכיוון שהיא חייבת להישאר בת קיימא ולחות לאורך כל הניסוי. יתר על כן, אסור שאימוביליזציה תפגע ברקמה. בעוד שתמיסת PEG שיתקה את הרקמה, הרזולוציה והאיכות של התמונות שהופקו לא היו עקביות. לכן, מחזיקי הדפסה בתלת-ממד פותחו כדי לשתק גלובוסים שלמים כדי להפיק תמונות באיכות גבוהה יותר עם פחות סיכון לנזק לרקמות.

הגישה
מחזיק ייחודי המודפס בתלת-ממד פותח כדי לשתק גלובוסים שלמים של ex vivo להדמיית תאים חיים. מחזיק זה מונע נזק משני מקורות עיקריים: הוא מאפשר הדמיה של כדור הארץ ללא צורך לנתח את הקרנית, והוא מבטל את החשיפה לאור UV. ללא מקורות נזק אלה, התמונות שהתקבלו ייצגו בצורה מדויקת יותר את התגובה לפציעות השריטות שנעשו בניסוי. יתר על כן, המחזיק שהודפס בתלת-ממד כויל לממדים המדויקים של עין המורין. זה סיפק התאמה טובה בהרבה מאשר אימוביליזציה בפתרון PEG, מה שהוביל לתמונה באיכות גבוהה יותר ביעדים בעלי עוצמה נמוכה יותר עקב ירידה בתנועת הרקמות. פס כיסוי המחובר לחלק העליון של המחזיק מבטיח כי הגלובוס נשאר ללא תנועה לאורך כל משך הניסוי וכי אין תזוזה של הגלובוס כאשר מדיית הצמיחה מוחלת כדי לשמור על הידרציה וכדאיות. היכולת להדפיס את המחזיק למידות מדויקות מאפשרת לנו גם לייצר התאמה אופטימלית לעיניים מורין בגדלים שונים בשל הגיל או מצב המחלה. טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת באופן רחב יותר כדי לפתח מחזיקים לעיניים של מינים שונים בהתבסס על מידותיהם.

Protocol

ההליכים המערבים נבדקים מן החי אושרו על ידי האגודה למחקר בראייה ורפואת עיניים לשימוש בבעלי חיים בטיפול עיניים ומחקר ראייה ופרוטוקול IACUC של אוניברסיטת בוסטון (201800302).

1. עיצוב המחזיקים ופס העטיפה המודפסים בתלת מימד

1. עצב את המחזיקים המודפסים בתלת-ממד ואת פס הכיסוי תוך התחשבות בקוטר הממוצע של גלובוסים של עכברים, והדפס את העיצוב בתלת-ממד (איור 1A, B).
2. שמור על קוטר הדופן הפנימית של המחזיק מעט גדול יותר מהקוטר הממוצע של כדור הארץ כדי לקחת בחשבון את הגדלים השונים של עכברים בודדים. שמור על גובה המחזיק בכמחצית מקוטר הגלובוס, והבטח התאמה הדוקה של הגלובוס כאשר הוא מאובטח על-ידי פס הכיסוי המודפס בתלת-ממד.
3. הגדילו את מכסה המחזיק לאורך הקוטר החיצוני של המחזיק ברוחב של 1/4 עד 1/2 מקוטר המחזיק. מוט הכיסוי הוא בגודל המאפשר גישה לגלובוס כאשר הוא מאובטח במחזיק לצורך הידרציה והסרת העין בסיום הניסוי.
4. הדפס את המחזיק ואת פס הכיסוי.

2. איסוף דגימות

1. עכברי המתת חסד (עכברים זכרים C57BL/6 בגילאי 9-12 שבועות ו-27 שבועות שימשו למחקר זה) תוך שימוש בפרוטוקולים מבוססים בהתאם להנחיות המוסדיות. עבור פרוטוקול זה, לבצע המתת חסד עם פחמן דו חמצני ואחריו עריפת ראש.
2. הסר את ראש העכבר והנח אותו מיד על קרח כדי לשמור על הכדאיות של הרקמה. ניתן לנטרל את הגלובוסים באמצעות כלי דיסקציה תוך מניעת נזק לרקמות.
3. פרופטוז את כדור הארץ באמצעות פינצטה. גזור את עצב הראייה באמצעות מספריים לנתיחה ממש מתחת למקום שבו הוא מוחזק על ידי הפינצטה.
   הערה: לאמצעי זהירות נוספים, בצע את השלבים הבאים במכסה מנוע של זרימה למינרית.
4. לדגום את הגלובוסים ב-2 מ"ל של מדיום בצלחת תרבית תאים p35 כולל מחוון סידן ו/או כתם קרום התא במשך שעה אחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ בתנאי תאורה נמוכים. יש לוודא שהגלובוסים שקועים במדיום הכתמים לקבלת צביעה אחידה.
   1. עבור הניסויים שבוצעו כאן, השתמש במחוון הסידן, Fluo4-AM (1:100)2, וכתם נגדי של קרום התא, כתם קרום פלזמה אדום עמוק (1:10,000)2, עם ריכוז סופי של 1% (v/v) DMSO ו-0.1% (w/v) חומצה פלורונית ^ב-2 מ"ל של מדיום נטול סרום קרטינוציטים (KSFM) עם תוספי הצמיחה הבאים: 25 מיקרוגרם/מ"ל תמצית יותרת המוח של בקר, גורם גדילה אפידרמלי 0.02 ננומטר, 0.3 mM CaCl₂, ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות/מ"ל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה).
      הערה: תנאי הדגירה וזמני הדגירה משתנים בהתאם למחוון הסידן, סוג הרקמה ונפח הדגימה. בעת שימוש בחומצה פלורונית, מומלץ להיזהר מכיוון שהיא הופכת את הרקמה לחדירה. פרוטוקול זה דורש 10% חומצה פלורונית. ריכוזים נמוכים יותר של חומצה פלורונית נקבעו בניסוי כלא יעילים, וריכוזים גבוהים יותר מסתכנים בנזק לרקמה.

3. הכנת מחזיקי המדגם

1. הדביקו את המחזיקים לכיסוי תחתון זכוכית נקי עם דבק שלא נעשה בו שימוש בעבר. הדבק המשמש בפרוטוקול זה מגיע ממיכלים חד-פעמיים כדי להבטיח סטריליות ומכל חדש שלא נפתח משמש בכל פעם.
2. שטפו את המחזיק ב-70% אתנול. הניחו דבק על המחזיק והדביקו את המחזיק למכסה התחתון של הזכוכית. ודא שאין דבק נמצא באזור הפנימי של המחזיק מכיוון שדבק יכול פלואורסצנטי, מה שמסבך את ההדמיה.
3. המתן עד שהדבק יתמצק. ודא שהמחזיק מאובטח מפני הכיסוי.
   הערה: לוחות תאים P35 עם כיסויים עם תחתית זכוכית שימשו לניסויים שהוצגו בכתב יד זה. ניתן להחליף שקופיות ו/או לוחות אחרים עם תחתית זכוכית בהתאם לצרכי הניסוי.

4. פצע של גלובוסים בעין

1. הסר את הגלובוסים מתמיסת הכתם באמצעות טפטפות עיניים סטריליות, תוך הקפדה על מניעת נזק לרקמות באזור העניין. שוטפים את הגלובוסים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות מי מלח סטריליים עם אגירת פוספטים להסרת כתמים עודפים, ומניחים את הגלובוסים בתווך להובלה למיקרוסקופ.
2. פצעו את הגלובוסים באמצעות מחט סטרילית של 25 גרם באזור העניין.
   1. באמצעות טפטפת עיניים סטרילית, הרימו והחזיקו את כדור הארץ מהחלק האחורי של העין. זה ישמור על יציבות הגלובוס, ימנע ממנו להתגלגל ויאפשר ליצור פצעים עקביים. באמצעות מערך זה, עצב הראייה יהיה בתוך פיית טפטפת העין, והקרנית תהיה פונה החוצה.
   2. לפצע שריטה, העבירו בעדינות מחט סטרילית של 25 גרם על פני הקרנית החשופה. לפצע ניקוב, יש ללחוץ בעדינות את המחט ישירות לתוך הקרנית המרכזית. ודא שהפצע אינו מנקב את הקרנית.
      הערה: דלג על שלב זה אם אין צורך בתגובת פצע או בסביבה פצועה לצורך הניסוי. מחקרים קודמים הראו כי גם פצעי שריטה וגם פצעי ניקוב בקרניות מורין המיוצרים בשיטה זו עקביים הן בקוטר והן בעומק¹⁰. אישור מידות הפצע בין גלובוסים עצמאיים בוצע באמצעות ניתוח אזור עניין.

5. מיקום המדגם על המחזיק

1. הניחו את אזור הקרנית או האזור הלימבולי על הכיסוי באזור הפנימי של המחזיק והתייצבו באמצעות הכיסוי המודפס בתלת-ממד (איור 1C-H).
2. ודא כי הגלובוס ממוקם כראוי וכי אתר העניין נמצא במגע עם מכסה הזכוכית. לאחר שהגלובוס הוכנס למחזיק, אל תנסה להסיר את הגלובוס מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לרקמות.
3. הדביקו את העטיפה המודפסת בתלת-ממד למחזיק באמצעות דבק, כדי להבטיח ייצוב. ודא שפס הכיסוי נצמד למחזיק ולא לגלובוס.
   הערה: האזור שיש להצטלם ממוקם למטה מכיוון שהפרוטוקול נכתב לשימוש במיקרוסקופ הפוך. ניתן להתאים את הפרוטוקול למיקרוסקופים זקופים באמצעות מחזיקים בעלי רדיוס פנימי קטן יותר והסרת מוט הכיסוי. התוצאה תהיה פחות ייצוב כדור הארץ.

6. הדמיה לדוגמה

1. הפעל את המיקרוסקופ ואת התא הסביבתי וודא שהתא לח. הגדר את התא הסביבתי ל-35 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך הניסוי.
   הערה: מיקרוסקופים עם תאים סביבתיים עדיפים להליך זה כדי למנוע התייבשות ולשמור על כדור הארץ בטמפרטורות אופטימליות אך אינם נדרשים.
2. הניחו את הכיסוי, המחזיק והגלובוס המיוצב על במת המיקרוסקופ בתוך התא הסביבתי והתמונה באמצעות טכניקות הדמיה של תאים חיים⁹.
3. יש לטפטף מדיית צמיחה נוספת על הכיסוי כדי למנוע התייבשות ולשמור על כדאיות הרקמות. ודא שיש מספיק מדיום בבאר כדי לכסות את הגלובוס במחזיק. בהתאם למשך ההדמיה, יש להוסיף מדיום טרי בעת הצורך לאורך כל הניסוי.
4. התחל בניסויים באמצעות טכניקות ופרוטוקולים של הדמיית תאים חיים. השתמש בהגדרות לייזר בהספק נמוך כדי לשמר את הרקמה ולמנוע נזק לרקמות בניסויים ממושכים. השתמש במטרות מתאימות למרחקי עבודה ארוכים. הניסויים בכתב יד זה בוצעו באמצעות מטרה של פי 20.
   הערה: כוח הלייזר וההגברה, משך הניסוי, המיקום ומישור ההדמיה הם כולם משתנים בהתאם לפרמטרים הניסוייים. ניסויי הדמיה על גלובוסים שלמים שאורכם נע בין שעה ל-4 שעות בוצעו בהצלחה בפרסומים קודמים¹⁰.
5. הקלט ושמור נתונים בתבנית הקובץ המועדפת. התוכנה המשמשת את המיקרוסקופ מייצרת קבצי .czi להקלטת נתונים.
6. יש להשליך את הגלובוסים בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים הסטנדרטיים בסוף הפרוטוקול.

תוצאות

פרוטוקול זה שימש להפקה עקבית של נתונים ותמונות באיכות פרסום¹⁰. התמונות המתקבלות מייצגות שיפור משמעותי בהשוואה לגישות קודמות (איור 2). באמצעות המחזיק המודפס בתלת-ממד, ניתן לצלם תמונות לאורך שכבות הקרנית, וניתן לצפות בגיוס סידן במישורי z שונים (איור 3

Discussion

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה של תאים חיים המשתמשת במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לייצב ולשתק עיניים שלמות של בעלי חיים. הוא נועד לעקוף מספר חסרונות משמעותיים המוכרים בפרוטוקולי הדמיה קודמים של תאים חיים של רקמת קרנית ex vivo . פרוטוקול זה מציע יתרונות רבים להדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic	Creality (Shenzen, China)	N/A	Material for holder
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-14-C	Well for imaging.
Autodesk Fusion 360 software	Autodesk (San Rafael, CA).	N/A	Software used for printing the holders.
BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)	305124	For experimentally-induced wounds to the globes
CellMask DeepRed	Invitrogen (Carlsbad, CA)	C10046	Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Complete Home Super Glue	Walgreens (Deerfield, IL)	N/A	For attaching the holder to the imaging well
Ender 3 Pro 3D printer	Creality (Shenzen, China)	N/A	For printing the holder
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	License Number: GPL2	Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Keratinocyte Serum-Free Medium	Gibco (Waltham, MA)	17005042	25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium
Phophate-Buffered Saline (PBS)	Corning, Medlabtech (Manassas, VA)	21-040-CV	Used to wash excess stain off of corneas before imaging
Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan	Zeiss (Thornwood, NY)	N/A	20x magnification objective was used