使用新型3D打印支架对完整的 离体 地球仪进行活细胞成像

摘要

这项工作描述了一种新的实验方案，该方案利用3D打印支架来实现去核球的高分辨率活细胞成像。通过该协议，可以实时观察离 体 球受伤角膜上皮中的细胞钙信号活性。

摘要

角膜上皮伤口愈合是由上皮细胞上表达的嘌呤能受体的激活引发的迁移过程。这种激活导致钙动员事件在细胞之间传播，这对于启动细胞运动进入伤口床至关重要，促进有效的伤口愈合。Trinkaus-Randall实验室开发了一种在 离体 鼠球中实时成像角膜伤口愈合反应的方法。这种方法涉及从已按照既定方案安乐死的小鼠身上取出完整的球体，并立即用钙指示剂染料孵育球体。在此阶段可以应用染色细胞其他特征的复染剂，以帮助成像并显示细胞标志。该方案适用于用于复染的几种不同的活细胞染料，包括用于染色肌动蛋白的SiR肌动蛋白和用于染色细胞膜的深红色质膜染色。为了检查对伤口的反应，使用25G针损伤角膜上皮，并将地球仪放置在3D打印支架中。3D打印支架的尺寸经过校准，以确保在整个实验期间地球固定，并且可以修改以适应不同大小的眼睛。随着时间的推移，使用共聚焦显微镜在整个组织的不同深度连续进行伤口反应的活细胞成像。该协议使我们能够在共聚焦显微镜上使用20倍空气物镜生成高分辨率，出版质量的图像。其他目标也可用于此协议。它代表了 离体 鼠球活细胞成像质量的显着提高，并允许识别神经和上皮。

引言

角膜
角膜是一种透明的无血管结构，覆盖眼睛前表面，可折射光线以实现视力并保护眼睛内部免受损伤。由于角膜暴露在环境中，它容易受到机械原因（抓挠）和感染的损害。其他方面健康的患者的角膜损伤通常会在 1-3 天内愈合。然而，在患有包括角膜缘干细胞缺乏症和II型糖尿病在内的潜在疾病患者中，角膜伤口愈合过程可以大大延长¹。由于角膜是高度神经支配的，这些不愈合的角膜溃疡和复发性角膜糜烂非常痛苦，并大大降低了经历它们的患者的生活质量¹。

细胞信号传导
当原本健康的角膜受伤时，伤口附近细胞中的钙信号事件先于并促使细胞迁移到伤口床上，在那里它们闭合损伤而没有疤痕的风险^2，3。这些信号传导事件已在使用活^{细胞成像的}角膜上皮细胞培养模型中得到了很好的表征2。初步实验表明，与糖尿病细胞相比，非糖尿病细胞损伤后的钙信号传导明显更多。然而，在 离体 球中表征细胞信号事件已被证明是一项技术挑战。

活细胞成像
以前的研究已经成功地记录了角膜^{伤口愈合的}体外细胞培养模型的钙信号传导事件4，^5，6。开发一种方法在离体组织中产生这些信号事件的高质量图像是非常有趣的，因为它将允许在更复杂和逼真的系统中研究这些事件。以前的方法包括解剖角膜，然后固定在紫外线诱导的PEG凝胶⁷，^8，9中。在处理活组织时，固定化是一个重要但具有挑战性的步骤，因为它必须在整个实验过程中保持活力和水合。此外，固定不得损坏组织。虽然PEG溶液固定了组织，但产生的图像的分辨率和质量并不一致。因此，开发了3D打印支架来固定完整的地球仪，以产生更高质量的图像，同时降低组织损伤的风险。

A. 方法
开发了一种独特的3D打印支架，用于固定完整的 离体 地球仪以进行活细胞成像。该支架可防止来自两个主要来源的损坏:它允许对去核眼球进行成像而无需解剖角膜，并且它消除了暴露于紫外线。没有这些损伤源，获得的图像更准确地代表了对实验造成的划痕伤害的反应。此外，3D打印支架被校准到小鼠眼睛的精确尺寸。这提供了比PEG溶液中固定更好的拟合，由于组织运动减少，在低倍物镜下可获得更高质量的图像。固定器顶部的盖杆可确保地球仪在整个实验过程中保持不动，并且在应用生长培养基以保持水合作用和活力时，地球仪不会移位。将支架打印到精确尺寸的能力也使我们能够为由于年龄或疾病状态而不同大小的鼠眼产生最佳贴合度。这项技术可以更广泛地应用于根据不同物种的尺寸开发支架。

研究方案

涉及动物受试者的程序得到了视觉和眼科研究协会在眼科护理和视觉研究中使用动物以及波士顿大学IACUC协议（201800302）的批准。

1. 设计3D打印支架和盖杆

1. 设计3D打印支架和盖杆，考虑鼠标地球仪的平均直径，并3D打印设计（图1A，B）。
2. 保持支架内壁的直径略大于地球仪的平均直径，以考虑个体小鼠的不同大小。将支架的高度保持在地球直径的一半左右，确保在由 3D 打印的盖杆固定时紧密贴合地球。
3. 将支架盖杆的尺寸调整为支架外径的长度，宽度为支架直径的 1/4 到 1/2。盖杆的尺寸允许在固定在支架中以补水和在实验结束时取出眼睛时进入地球仪。
4. 打印支架和盖杆。

2. 样品采集

1. 安乐死小鼠（本研究使用9-12周龄和27周龄的雄性C57BL / 6小鼠）使用符合机构指南的既定方案。对于此协议，用二氧化碳执行安乐死，然后斩首。
2. 取出小鼠头并立即将其放在冰上以保持组织的活力。使用解剖工具将地球仪去核，同时防止组织损伤。
3. 用镊子支撑地球。用解剖剪刀夹住视神经，就在镊子固定视神经的下方。
   注意:有关进一步的预防措施，请在层流罩中执行以下步骤。
4. 将球体在p35细胞培养皿中的2mL培养基中孵育，包括钙指示剂和/或细胞膜染色剂，在37°C，5%CO₂ 培养箱中在低光照条件下孵育1小时。确保将球浸没在染色介质中以实现均匀染色。
   1. 对于此处进行的实验，使用钙指示剂Fluo4-AM （1:100）2和细胞膜复染，深红色质膜染色剂（1:10，000）²，最终浓度为1%（v / v）DMSO和0.1%（w / v）普鲁糖酸在2mL角质形成细胞无血清培养基（KSFM）中，并使用以下生长补充剂:25μg/ mL牛垂体提取物， 0.02 nM 表皮生长因子、0.3 mM CaCl₂ 和青霉素-链霉素（分别为 100 单位/mL 和 100 μg/mL）。
      注意:孵育条件和时间因钙指示剂、组织类型和样品体积而异。使用多脲酸时，建议谨慎使用，因为它会使组织具有渗透性。该协议要求10%的多花酸。较低浓度的多花酸已被实验确定为无效，较高浓度的风险可能会损害组织。

3. 样品架的制备

1. 用以前未使用过的胶水将支架粘在干净的玻璃底盖玻片上。该协议中使用的胶水来自一次性容器，以确保无菌，并且每次都使用新的未开封容器。
2. 用70%乙醇洗涤支架。将胶水涂在支架上，然后将支架粘在玻璃底盖玻片上。确保支架内部区域内没有胶水，因为胶水会发出荧光，使成像复杂化。
3. 等到胶水凝固。确认支架与盖玻片牢固。
   注意:带有玻璃底盖玻片的P35细胞板用于本手稿中介绍的实验。其他玻璃底载玻片和/或板可以根据实验的需要进行替代。

4. 眼球损伤

1. 使用无菌滴管从染色溶液中取出地球仪，注意防止组织损伤感兴趣区域。使用无菌磷酸盐缓冲盐水在室温下洗涤地球仪5分钟以去除多余的污渍，并将地球仪放入培养基中以运输到显微镜。
2. 使用无菌 25 G 针在感兴趣区域缠绕眼球。
   1. 使用无菌滴管，从眼睛后部拿起并握住眼球。这将保持地球稳定，防止其滚动，并允许制造一致的伤口。使用这种设置，视神经将位于滴管喷嘴内，角膜将朝外。
   2. 对于划痕伤口，轻轻地将无菌 25 G 针穿过暴露的角膜。对于穿刺伤口，将针头直接轻轻按入中央角膜。确保伤口不会刺穿角膜。
      注意:如果实验不需要伤口反应或受伤环境，请跳过此步骤。先前的研究表明，使用这种方法制成的小鼠角膜划痕伤口和穿刺伤口在直径和深度上都是一致的¹⁰。使用感兴趣区域分析确认独立球体之间的伤口尺寸。

5. 样品放置在支架上

1. 将角膜或角膜缘区域放在支架内部区域的盖玻片上，并使用3D打印的盖子稳定（图1C-H）。
2. 确认地球仪的位置正确，并且感兴趣的位置与玻璃盖玻片接触。将地球仪放入支架后，请勿尝试取下地球仪，因为这可能会导致组织损伤。
3. 使用胶水将3D打印的盖子粘在支架上，确保稳定性。确保盖杆粘附在支架上，而不是地球仪上。
   注意:要成像的区域被放下，因为协议是为在倒置显微镜上使用而编写的。该方案可以适用于使用具有较小内半径的支架和移除盖杆的正置显微镜。这将导致全球稳定性降低。

6. 样品成像

1. 打开显微镜和环境室，并验证室是否加湿。在实验期间将环境室设置为35°C和5%CO₂ 。
   注意:此程序最好使用带环境室的显微镜，以防止脱水并将地球仪保持在最佳温度，但不是必需的。
2. 将盖玻片、支架和稳定球体放在环境室内的显微镜载物台上，并使用活细胞成像技术成像⁹.
3. 将额外的生长培养基移液到盖玻片上，以防止脱水并保持组织活力。确保孔中有足够的介质覆盖支架中的地球仪。根据成像的持续时间，在整个实验过程中需要时添加新鲜培养基。
4. 使用活细胞成像技术和方案开始实验。在长时间的实验中使用低功率激光设置来保存组织并防止组织损伤。在长工作距离下使用适当的物镜。本手稿中的实验是使用 20 倍物镜进行的。
   注意:激光功率和增益、实验持续时间、位置和成像平面都是变量，具体取决于实验参数。在过去的出版物中，对持续时间为1小时至4小时的完整地球仪进行了成像实验¹⁰。
5. 以首选文件格式记录和保存数据。显微镜使用的软件生成.czi文件用于数据记录。
6. 按照协议末尾的标准机构协议处理地球仪。

结果

该协议已用于始终如一地生成出版质量的数据和图像¹⁰。与以前的方法相比，获得的图像具有显着的改进（图2）。使用3D打印支架，可以在整个角膜层中捕获图像，并且可以观察到不同z平面中的钙动员（图3）。该方法已被用于比较年轻和老年小鼠伤口处顶端和基底细胞层之间的细胞 - 细胞信号传导¹⁰。

讨论

该协议描述了一种活细胞成像技术，该技术使用3D打印支架来稳定和固定完整的动物眼睛。它旨在规避先前离 体 角膜组织活细胞成像方案所识别的几个显着缺点。该协议为完整地球仪的活细胞成像提供了许多优势。它显着减少了不必要的组织损伤，这些损伤可能会干扰对实验诱导的划痕伤口的伤口愈合反应。这包括解剖和暴露于紫外线对神经和上皮的损害。此外，该协议通过固定组织的方...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic	Creality (Shenzen, China)	N/A	Material for holder
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-14-C	Well for imaging.
Autodesk Fusion 360 software	Autodesk (San Rafael, CA).	N/A	Software used for printing the holders.
BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)	305124	For experimentally-induced wounds to the globes
CellMask DeepRed	Invitrogen (Carlsbad, CA)	C10046	Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Complete Home Super Glue	Walgreens (Deerfield, IL)	N/A	For attaching the holder to the imaging well
Ender 3 Pro 3D printer	Creality (Shenzen, China)	N/A	For printing the holder
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	License Number: GPL2	Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Keratinocyte Serum-Free Medium	Gibco (Waltham, MA)	17005042	25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium
Phophate-Buffered Saline (PBS)	Corning, Medlabtech (Manassas, VA)	21-040-CV	Used to wash excess stain off of corneas before imaging
Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan	Zeiss (Thornwood, NY)	N/A	20x magnification objective was used