Визуализация живых клеток неповрежденных глобусов Ex Vivo с использованием нового 3D-печатного держателя

Резюме

Настоящая работа описывает новый экспериментальный протокол, который использует 3D-печатный держатель для обеспечения визуализации живых клеток с высоким разрешением энуклеированных глобусов. Благодаря этому протоколу клеточная сигнальная активность кальция в раненом эпителии роговицы из глобусов ex vivo может наблюдаться в режиме реального времени.

Аннотация

Заживление эпителиальной раны роговицы – это миграционный процесс, инициируемый активацией пуринергических рецепторов, экспрессируемых на эпителиальных клетках. Эта активация приводит к событиям мобилизации кальция, которые распространяются от клетки к клетке, которые необходимы для инициирования клеточной подвижности в раневом слое, способствуя эффективному заживлению ран. Лаборатория Тринкауса-Рэндалла разработала методологию визуализации реакции заживления ран роговицы в шарах мышей ex vivo в режиме реального времени. Этот подход включает в себя энуклеацию неповрежденного глобуса от мыши, которая была усыплена в соответствии с установленными протоколами, и немедленную инкубацию земного шара с помощью индикаторного красителя кальция. На этом этапе может быть применено встречное пятно, которое окрашивает другие особенности клетки, чтобы помочь с визуализацией и показать клеточные ориентиры. Протокол хорошо работал с несколькими различными красителями живых клеток, используемыми для контрокраширования, включая Актин SiR для окрашивания актина и темно-красное окрашивание плазматической мембраны для окрашивания клеточной мембраны. Чтобы исследовать реакцию на рану, эпителий роговицы повреждается с помощью иглы 25 G, а глобусы помещаются в 3D-печатный держатель. Размеры 3D-печатного держателя калибруются для обеспечения иммобилизации земного шара на протяжении всего эксперимента и могут быть изменены для размещения глаз разных размеров. Визуализация реакции раны живыми клетками выполняется непрерывно на различных глубинах по всей ткани с течением времени с использованием конфокальной микроскопии. Этот протокол позволяет нам генерировать изображения с высоким разрешением и качеством публикации с использованием 20-кратного воздушного объектива на конфокальном микроскопе. Другие цели также могут быть использованы для этого протокола. Он представляет собой значительное улучшение качества визуализации живых клеток в шарах мышей ex vivo и позволяет идентифицировать нервы и эпителий.

Введение

Роговица
Роговица представляет собой четкую, аваскулярную структуру, покрывающую переднюю поверхность глаза, которая преломляет свет, чтобы обеспечить зрение и защищает внутреннюю часть глаза от повреждений. Поскольку роговица подвергается воздействию окружающей среды, она подвержена повреждениям как от механических причин (царапины), так и от инфекции. Травма роговицы у здорового пациента обычно заживает в течение 1-3 дней. Однако у пациентов с основными состояниями, включая дефицит лимбальных стволовых клеток и диабет II типа, процесс заживления ран роговицы может быть значительно продлен¹. Поскольку роговица сильно иннервируется, эти незаживающие язвы роговицы и рецидивирующие эрозии роговицы очень болезненны и значительно снижают качество жизни пациентов, испытывающих их¹.

Передача сигналов сотовой связи
Когда в противном случае здоровая роговица повреждена, сигнальные события кальция в клетках, прилегающих к ране, предшествуют и вызывают клеточную миграцию в раневое ложе, где они закрывают травму без риска рубцевания ^2,3. Эти сигнальные события были хорошо охарактеризованы в моделях культур эпителиальных клеток роговицы с использованием визуализации живых клеток². Предварительные эксперименты демонстрируют значительно большую передачу сигналов кальция после травмы в недиабетических клетках по сравнению с диабетическими клетками. Однако характеристика событий передачи сигналов клетками в глобусах ex vivo оказалась технической проблемой.

Визуализация живых клеток
Предыдущие исследования успешно регистрировали сигнальные события кальция из моделей посева клеток in vitro заживления ран роговицы ^4,5,6. Разработка методологии для получения высококачественных изображений этих сигнальных событий в ткани ex vivo представляет большой интерес, поскольку она позволила бы изучать эти события в более сложной и реалистичной системе. Предыдущие подходы включали рассечение роговицы с последующей иммобилизацией в УФ-индуцированном геле PEG ^7,8,9. Иммобилизация является важным, но сложным шагом при работе с живой тканью, поскольку она должна оставаться жизнеспособной и гидратированной на протяжении всего эксперимента. Кроме того, иммобилизация не должна повреждать ткани. В то время как раствор PEG обездвиживал ткань, разрешение и качество полученных изображений не были последовательными. Поэтому были разработаны 3D-печатные держатели для иммобилизации неповрежденных глобусов для получения изображений более высокого качества с меньшим риском повреждения тканей.

Подход
Уникальный 3D-печатный держатель был разработан для иммобилизации неповрежденных глобусов ex vivo для визуализации живых клеток. Этот держатель предотвращает повреждение от двух основных источников: он позволяет визуализировать энуклеированный глобус без необходимости рассечения роговицы и исключает воздействие ультрафиолетового света. Без этих источников повреждений полученные изображения более точно представляли реакцию на царапины, сделанные экспериментально. Кроме того, держатель для 3D-печати был откалиброван в соответствии с точными размерами мышиного глаза. Это обеспечило гораздо лучшую посадку, чем иммобилизация в растворе ПЭГ, что привело к более высокому качеству изображения при более мощных объективах из-за уменьшения движения тканей. Крышка, прикрепленная к верхней части держателя, гарантирует, что глобус остается неподвижным на протяжении всего эксперимента и что при применении питательных сред для поддержания гидратации и жизнеспособности не происходит смещения земного шара. Возможность печати держателя до точных размеров также позволяет нам генерировать оптимальную посадку для мышиных глаз разных размеров из-за возраста или статуса заболевания. Эта технология может быть применена более широко для разработки держателей для глаз различных видов на основе их размеров.

протокол

Процедуры с участием животных были одобрены Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в офтальмологической помощи и исследованиях зрения и протоколом IACUC Бостонского университета (201800302).

1. Проектирование 3D-печатных держателей и обложек

1. Спроектируйте 3D-печатные держатели и обложку с учетом среднего диаметра глобусов мыши и напечатайте дизайн на 3D-принтере (рисунок 1A, B).
2. Держите диаметр внутренней стенки держателя немного больше, чем средний диаметр глобуса, чтобы учесть различные размеры отдельных мышей. Держите высоту держателя на уровне около половины диаметра глобуса, обеспечивая плотное прилегание глобуса при закреплении 3D-печатной крышки.
3. Размер планки крышки держателя соответствует длине внешнего диаметра держателя с шириной от 1/4 до 1/2 диаметра держателя. Крышка имеет размер, обеспечивающий доступ к глобусу, когда он закреплен в держателе для гидратации и удаления глаза в конце эксперимента.
4. Распечатайте держатель и крышку.

2. Сбор образцов

1. Усыпление мышей (для этого исследования использовались самцы мышей C57BL/6 в возрасте 9-12 недель и 27 недель) с использованием установленных протоколов в соответствии с институциональными руководящими принципами. Для этого протокола выполните эвтаназию с углекислым газом с последующим обезглавливанием.
2. Удалите головку мыши и поместите ее сразу на лед, чтобы сохранить жизнеспособность ткани. Энуклеат глобусов с помощью инструментов для рассечения, предотвращая при этом повреждение тканей.
3. Проптозируйте земной шар с помощью пинцета. Обрежьте зрительный нерв с помощью ножниц для рассечения чуть ниже, где он удерживается пинцетом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для дальнейших мер предосторожности выполните следующие действия в ламинарной вытяжке.
4. Инкубируют глобусы в 2 мл среды в чашке для культивирования клеток p35, включая индикатор кальция и/или окрашивание клеточной мембраны в течение 1 ч в инкубаторе 37 °C, 5% CO₂ с условиями низкой освещенности. Убедитесь, что глобусы погружены в среду окрашивания для равномерного окрашивания.
   1. Для экспериментов, проведенных здесь, используйте индикатор кальция Fluo4-AM (1:100)² и встречное пятно клеточной мембраны, темно-красное пятно плазматической мембраны (1:10 000)² с конечной концентрацией 1% (v/v) DMSO и 0,1% (мас./об.) плуроновой кислоты в 2 мл кератиноцитарной сывороточной среды (KSFM) со следующими добавками роста: 25 мкг/мл экстракта гипофиза крупного рогатого скота, 0,02 нМ эпидермального фактора роста, 0,3 мМ_CaCl2 и пенициллин-стрептомицин (100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия и время инкубации варьируются в зависимости от показателя кальция, типа ткани и объема образца. При использовании плуроновой кислоты рекомендуется соблюдать осторожность, так как она делает ткани проницаемыми. Этот протокол требует 10% плуроновой кислоты. Экспериментально было установлено, что более низкие концентрации плуроновой кислоты неэффективны, а более высокие концентрации рискуют повредить ткань.

3. Подготовка держателей образцов

1. Прикрепите держатели к чистой стеклянной крышке с клеем, который ранее не использовался. Клей, используемый в этом протоколе, поступает из одноразовых контейнеров для обеспечения стерильности, и каждый раз используется новый, неоткрытый контейнер.
2. Вымойте держатель в 70% этаноле. Поместите клей на держатель и приклейте держатель к стеклянной нижней крышке. Убедитесь, что клей не находится во внутренней области держателя, так как клей может флуоресцировать, усложняя визуализацию.
3. Подождите, пока клей затвердеет. Убедитесь, что держатель защищен от крышки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, представленных в этой рукописи, использовались клеточные пластины P35 со стеклянным дном. Другие слайды и/или пластины со стеклянным дном могут быть заменены в зависимости от потребностей эксперимента.

4. Ранение глазных шаров

1. Удалите глобусы из окрашивающего раствора с помощью стерильных глазных капельниц, позаботившись о предотвращении повреждения тканей интересующей области. Промывайте глобусы в течение 5 минут при комнатной температуре, используя стерильный фосфатно-буферный физиологический раствор для удаления лишнего пятна, и поместите глобусы в среду для транспортировки в микроскоп.
2. Намотайте глобусы с помощью стерильной иглы 25 Г в интересующей области.
   1. Используя стерильную пипетку для глаз, поднимите и удерживайте глобус от задней части глаза. Это сохранит земной шар стабильным, предотвратит его скатывание и позволит сделать постоянные раны. Используя эту установку, зрительный нерв будет находиться внутри сопла пипетки глаза, а роговица будет обращена наружу.
   2. Для царапины раны осторожно переместите стерильную иглу весом 25 г по открытой роговице. Для колотой раны аккуратно вдавите иглу непосредственно в центральную роговицу. Следите за тем, чтобы рана не проколола роговицу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот шаг, если для эксперимента не требуется раневая реакция или раненая среда. Предыдущие исследования показали, что как царапины, так и колотые раны мышей, сделанные с использованием этого метода, являются последовательными как по диаметру, так и по глубине¹⁰. Подтверждение размеров раны между независимыми глобусами проводилось с помощью анализа интересующей области.

5. Размещение образца на держателе

1. Поместите роговицу или лимбальную область на крышку во внутренней области держателя и стабилизируйте с помощью 3D-печатной крышки (рисунок 1C-H).
2. Убедитесь, что глобус расположен правильно и что интересующий его участок находится в контакте со стеклянным чехлом. После того, как глобус был помещен в держатель, не пытайтесь удалить глобус, так как это может привести к повреждению тканей.
3. Приклейте 3D-печатную крышку к держателю с помощью клея, обеспечивая стабилизацию. Убедитесь, что планка крышки прилипает к держателю, а не к глобусу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Область, подлежащая изображению, помещается вниз, потому что протокол записан для использования на перевернутом микроскопе. Протокол может быть адаптирован для вертикальных микроскопов с использованием держателей с меньшим внутренним радиусом и снятием крышки. Это приведет к меньшей стабилизации земного шара.

6. Образец изображения

1. Включите микроскоп и камеру окружающей среды и убедитесь, что камера увлажнена. Установите экологическую камеру на 35 °C и 5% CO₂ на время эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопы с камерами окружающей среды предпочтительны для этой процедуры, чтобы предотвратить обезвоживание и поддерживать земной шар при оптимальных температурах, но не требуются.
2. Поместите крышку, держатель и стабилизированный глобус на ступень микроскопа в камере окружающей среды и изображение с использованием методов визуализации живых клеток⁹.
3. Пипетка дополнительно наносит питательные среды на крышку для предотвращения обезвоживания и поддержания жизнеспособности тканей. Убедитесь, что в колодце достаточно среды, чтобы покрыть глобус в держателе. В зависимости от продолжительности визуализации, добавляйте свежую среду, когда это необходимо, на протяжении всего эксперимента.
4. Начните эксперименты с использованием методов и протоколов визуализации живых клеток. Используйте маломощные лазерные установки для сохранения ткани и предотвращения повреждения тканей в длительных экспериментах. Используйте соответствующие цели для больших рабочих расстояний. Эксперименты в этой рукописи проводились с использованием 20-кратного объектива.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность и коэффициент усиления лазера, продолжительность эксперимента, местоположение и плоскость изображения являются переменными в зависимости от экспериментальных параметров. Эксперименты по визуализации на неповрежденных глобусах продолжительностью от 1 ч до 4 ч были успешно выполнены в прошлых публикациях¹⁰.
5. Записывайте и сохраняйте данные в предпочтительном формате файла. Программное обеспечение, используемое микроскопом, создает файлы .czi для записи данных.
6. Распоряжаться глобусами в соответствии со стандартными институциональными протоколами в конце протокола.

Результаты

Этот протокол использовался для последовательного получения данных и изображений¹⁰ качества публикации. Полученные изображения представляют собой значительное улучшение по сравнению с предыдущими подходами (рисунок 2). С помощью 3D-печатного держателя мож...

Обсуждение

Этот протокол описывает метод визуализации живых клеток, который использует 3D-печатный держатель для стабилизации и обездвиживания неповрежденных глаз животных. Он предназначен для обхода нескольких существенных недостатков, признанных предыдущими протоколами визуализации живых к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic	Creality (Shenzen, China)	N/A	Material for holder
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-14-C	Well for imaging.
Autodesk Fusion 360 software	Autodesk (San Rafael, CA).	N/A	Software used for printing the holders.
BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)	305124	For experimentally-induced wounds to the globes
CellMask DeepRed	Invitrogen (Carlsbad, CA)	C10046	Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Complete Home Super Glue	Walgreens (Deerfield, IL)	N/A	For attaching the holder to the imaging well
Ender 3 Pro 3D printer	Creality (Shenzen, China)	N/A	For printing the holder
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	License Number: GPL2	Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Keratinocyte Serum-Free Medium	Gibco (Waltham, MA)	17005042	25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium
Phophate-Buffered Saline (PBS)	Corning, Medlabtech (Manassas, VA)	21-040-CV	Used to wash excess stain off of corneas before imaging
Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan	Zeiss (Thornwood, NY)	N/A	20x magnification objective was used