Imaging di cellule vive di globi ex vivo intatti utilizzando un nuovo supporto stampato in 3D

Riepilogo

Il presente lavoro descrive un nuovo protocollo sperimentale che utilizza un supporto stampato in 3D per consentire l'imaging di cellule vive ad alta risoluzione di globi enucleati. Attraverso questo protocollo, l'attività di segnalazione del calcio cellulare nell'epitelio corneale ferito da globi ex vivo può essere osservata in tempo reale.

Abstract

La guarigione della ferita epiteliale corneale è un processo migratorio avviato dall'attivazione dei recettori purinergici espressi sulle cellule epiteliali. Questa attivazione si traduce in eventi di mobilizzazione del calcio che si propagano da cellula a cellula, che sono essenziali per iniziare la motilità cellulare nel letto della ferita, promuovendo un'efficiente guarigione della ferita. Il laboratorio Trinkaus-Randall ha sviluppato una metodologia per l'imaging della risposta di guarigione delle ferite corneali in globi murini ex vivo in tempo reale. Questo approccio prevede l'enucleazione di un globo intatto da un topo che è stato eutanasia secondo protocolli stabiliti e l'incubazione immediata del globo con un colorante indicatore di calcio. Una contromacchia che colora altre caratteristiche della cellula può essere applicata in questa fase per aiutare con l'imaging e mostrare punti di riferimento cellulari. Il protocollo ha funzionato bene con diversi coloranti di cellule vive utilizzati per la controcolorazione, tra cui l'actina SiR per colorare l'actina e la colorazione della membrana plasmatica rosso intenso per colorare la membrana cellulare. Per esaminare la risposta a una ferita, l'epitelio corneale viene ferito utilizzando un ago da 25 G e i globi vengono posizionati in un supporto stampato in 3D. Le dimensioni del supporto stampato in 3D sono calibrate per garantire l'immobilizzazione del globo per tutta la durata dell'esperimento e possono essere modificate per ospitare occhi di diverse dimensioni. L'imaging cellulare vivo della risposta della ferita viene eseguito continuamente a varie profondità in tutto il tessuto nel tempo utilizzando la microscopia confocale. Questo protocollo ci consente di generare immagini ad alta risoluzione e di qualità pubblicativa utilizzando un obiettivo aereo 20x su un microscopio confocale. Altri obiettivi possono essere utilizzati anche per questo protocollo. Rappresenta un miglioramento significativo nella qualità dell'imaging di cellule vive in globi murini ex vivo e consente l'identificazione di nervi ed epitelio.

Introduzione

Cornea
La cornea è una struttura avascolare chiara che copre la superficie anteriore dell'occhio che rifrange la luce per consentire la visione e protegge l'interno dell'occhio dai danni. Poiché la cornea è esposta all'ambiente, è suscettibile di danni sia da cause meccaniche (graffi) che da infezioni. Una lesione corneale in un paziente altrimenti sano guarisce in genere entro 1-3 giorni. Tuttavia, nei pazienti con condizioni di base tra cui deficit di cellule staminali limbari e diabete di tipo II, il processo di guarigione della ferita corneale può essere notevolmente prolungato¹. Poiché la cornea è altamente innervata, queste ulcere corneali non cicatrizzanti e le erosioni corneali ricorrenti sono molto dolorose e diminuiscono notevolmente la qualità della vita dei pazienti che le sperimentano¹.

Segnalazione cellulare
Quando una cornea altrimenti sana è ferita, gli eventi di segnalazione del calcio nelle cellule adiacenti alla ferita precedono e inducono la migrazione cellulare nel letto della ferita, dove chiudono la lesione senza il rischio di cicatrici ^2,3. Questi eventi di segnalazione sono stati ben caratterizzati in modelli di coltura cellulare epiteliale corneale utilizzando l'imaging cellulare vivo². Gli esperimenti preliminari dimostrano significativamente più segnalazione di calcio dopo la lesione nelle cellule non diabetiche rispetto alle cellule diabetiche. Tuttavia, la caratterizzazione degli eventi di segnalazione cellulare nei globi ex vivo si è rivelata una sfida tecnica.

Imaging cellulare vivo
Studi precedenti hanno registrato con successo eventi di segnalazione del calcio da modelli di coltura cellulare in vitro di guarigione della ferita corneale ^4,5,6. Lo sviluppo di una metodologia per produrre immagini di alta qualità di questi eventi di segnalazione in tessuto ex vivo è di grande interesse perché consentirebbe lo studio di questi eventi in un sistema più complesso e realistico. Gli approcci precedenti hanno comportato la dissezione della cornea seguita dall'immobilizzazione in un gel PEG indotto dai raggi UV ^7,8,9. L'immobilizzazione è un passo essenziale ma impegnativo quando si lavora con tessuti vivi, in quanto deve rimanere vitale e idratato per tutto il corso dell'esperimento. Inoltre, l'immobilizzazione non deve danneggiare il tessuto. Mentre la soluzione PEG immobilizzava il tessuto, la risoluzione e la qualità delle immagini prodotte non erano coerenti. Pertanto, i supporti stampati in 3D sono stati sviluppati per immobilizzare globi intatti per produrre immagini di qualità superiore con meno rischi di danni ai tessuti.

L'approccio
È stato sviluppato un esclusivo supporto stampato in 3D per immobilizzare globi ex vivo intatti per l'imaging di cellule vive. Questo supporto previene i danni da due fonti principali: consente l'imaging di un globo enucleato senza la necessità di sezionare la cornea ed elimina l'esposizione alla luce UV. Senza queste fonti di danno, le immagini ottenute rappresentavano più accuratamente la risposta alle lesioni da graffio fatte sperimentalmente. Inoltre, il supporto stampato in 3D è stato calibrato alle dimensioni precise dell'occhio murino. Ciò ha fornito un adattamento molto migliore rispetto all'immobilizzazione nella soluzione PEG, portando a un'immagine di qualità superiore a obiettivi a bassa potenza a causa della diminuzione del movimento dei tessuti. Una barra di copertura attaccata alla parte superiore del supporto assicura che il globo rimanga immobile per tutta la durata dell'esperimento e che non vi sia alcuno spostamento del globo quando vengono applicati terreni di crescita per mantenere l'idratazione e la vitalità. La possibilità di stampare il supporto su dimensioni precise ci consente anche di generare una vestibilità ottimale per occhi murini di diverse dimensioni a causa dell'età o dello stato di malattia. Questa tecnologia può essere applicata in modo più ampio per sviluppare supporti per gli occhi di diverse specie in base alle loro dimensioni.

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Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia per l'uso di animali nella cura oftalmica e nella ricerca sulla visione e dal protocollo IACUC dell'Università di Boston (201800302).

1. Progettazione dei supporti stampati in 3D e della barra di copertura

1. Progetta i supporti stampati in 3D e la barra di copertura tenendo conto del diametro medio dei globi del mouse e stampa in 3D il design (Figura 1A, B).
2. Mantenere il diametro della parete interna del supporto leggermente più grande del diametro medio del globo per tenere conto delle diverse dimensioni dei singoli topi. Mantieni l'altezza del supporto a circa la metà del diametro del globo, assicurando una perfetta aderenza del globo quando fissato dalla barra di copertura stampata in 3D.
3. Dimensionare la barra di copertura del supporto alla lunghezza del diametro esterno del supporto con una larghezza compresa tra 1/4 e 1/2 del diametro del supporto. La barra di copertura è dimensionata per consentire l'accesso al globo quando fissata nel supporto per l'idratazione e la rimozione dell'occhio alla conclusione dell'esperimento.
4. Stampare il supporto e la barra di copertura.

2. Raccolta dei campioni

1. Per questo studio sono stati utilizzati topi eutanasia (topi maschi C57BL / 6 di età compresa tra 9-12 settimane e 27 settimane di età) utilizzando protocolli stabiliti in conformità con le linee guida istituzionali. Per questo protocollo, eseguire l'eutanasia con anidride carbonica seguita da decapitazione.
2. Rimuovere la testa del topo e posizionarla immediatamente sul ghiaccio per preservare la vitalità del tessuto. Enucleare i globi utilizzando strumenti di dissezione prevenendo danni ai tessuti.
3. Proptose il globo usando una pinzetta. Aggancia il nervo ottico usando le forbici da dissezione appena sotto dove è tenuto dalle pinzette.
   NOTA: per ulteriori precauzioni, eseguire i seguenti passaggi in una cappa a flusso laminare.
4. Incubare i globi in 2 ml di terreno in un piatto di coltura cellulare p35 che include un indicatore di calcio e/o una colorazione di membrana cellulare per 1 ora in un incubatore a 37 °C, 5% di CO₂ con condizioni di scarsa illuminazione. Assicurarsi che i globi siano immersi nel mezzo di colorazione per una colorazione uniforme.
   1. Per gli esperimenti eseguiti qui, utilizzare l'indicatore di calcio, Fluo4-AM (1:100)2, e la colorazione contro la membrana cellulare, colorazione della membrana plasmatica rosso intenso (1:10.000)2, con una concentrazione finale dell'1% (v/v) di DMSO e dello 0,1% (p/v) di acido pluronico in ² ml di terreno privo di siero di cheratinociti (KSFM) con i seguenti integratori di crescita: 25 μg/mL di estratto ipofisario bovino, 0,02 nM fattore di crescita epidermico, 0,3 mM CaCl₂ e penicillina-streptomicina (100 unità/ml e 100 μg/ml, rispettivamente).
      NOTA: Le condizioni e i tempi di incubazione variano a seconda dell'indicatore di calcio, del tipo di tessuto e del volume del campione. Quando si utilizza l'acido pluronico, si consiglia cautela in quanto rende permeabile il tessuto. Questo protocollo richiede il 10% di acido pluronico. Concentrazioni più basse di acido pluronico sono state determinate sperimentalmente per essere inefficaci, e concentrazioni più elevate rischiano danni al tessuto.

3. Preparazione dei portacampioni

1. Far aderire i supporti a un coprislip con fondo di vetro pulito con colla che non è stata utilizzata in precedenza. La colla utilizzata in questo protocollo proviene da contenitori monouso per garantire la sterilità e ogni volta viene utilizzato un nuovo contenitore non aperto.
2. Lavare il supporto in etanolo al 70%. Posizionare la colla sul supporto e far aderire il supporto al coperchio inferiore in vetro. Assicurarsi che non vi sia colla all'interno dell'area interna del supporto poiché la colla può fluoresce, complicando l'imaging.
3. Attendere che la colla si solidifichi. Verificare che il supporto sia saldamente contro il coprifoglio.
   NOTA: Le lastre di celle P35 con coperchi con fondo di vetro sono state utilizzate per gli esperimenti presentati in questo manoscritto. Altri vetrini e/o lastre con fondo di vetro possono essere sostituiti in base alle esigenze dell'esperimento.

4. Ferita dei globi oculari

1. Rimuovere i globi dalla soluzione colorante utilizzando contagocce sterili, avendo cura di prevenire danni ai tessuti nella regione di interesse. Lavare i globi per 5 minuti a temperatura ambiente utilizzando soluzione salina sterile tamponata con fosfato per rimuovere la macchia in eccesso e posizionare i globi nel mezzo per il trasporto al microscopio.
2. Avvolgere i globi usando un ago sterile da 25 G nella regione di interesse.
   1. Utilizzando un contagocce sterile, raccogliere e tenere il globo dalla parte posteriore dell'occhio. Ciò manterrà stabile il globo, impedirà che rotoli e consentirà di creare ferite consistenti. Utilizzando questa configurazione, il nervo ottico sarà all'interno dell'ugello contagocce e la cornea sarà rivolta verso l'esterno.
   2. Per una ferita da graffio, spostare delicatamente un ago sterile da 25 G sulla cornea esposta. Per una ferita da puntura, premere delicatamente l'ago direttamente nella cornea centrale. Assicurarsi che la ferita non fori la cornea.
      NOTA: ignorare questo passaggio se per l'esperimento non è necessaria una risposta della ferita o un ambiente ferito. Studi precedenti hanno dimostrato che sia le ferite da graffio che le ferite da puntura alle cornee murine realizzate con questo metodo sono coerenti sia nel diametro che nella profondità¹⁰. La conferma delle dimensioni della ferita tra globi indipendenti è stata eseguita utilizzando un'analisi della regione di interesse.

5. Posizionamento del campione sul supporto

1. Posizionare la cornea o la regione limbare sul coprivetrino nella zona interna del supporto e stabilizzare utilizzando la copertina stampata in 3D (Figura 1C-H).
2. Verificare che il globo sia posizionato correttamente e che il sito di interesse sia a contatto con il vetrino. Una volta che il globo è stato inserito nel supporto, non cercare di rimuovere il globo in quanto ciò potrebbe causare danni ai tessuti.
3. Far aderire la copertina stampata in 3D al supporto utilizzando la colla, garantendo la stabilizzazione. Assicurati che la barra di copertura aderisca al supporto e non al globo.
   NOTA: l'area da visualizzare viene posizionata verso il basso perché il protocollo è scritto per l'uso su un microscopio invertito. Il protocollo può essere adattato per microscopi verticali utilizzando supporti con un raggio interno più piccolo e la rimozione della barra di copertura. Ciò si tradurrà in una minore stabilizzazione del globo.

6. Imaging del campione

1. Accendere il microscopio e la camera ambientale e verificare che la camera sia umidificata. Impostare la camera ambientale a 35 °C e al 5% di CO₂ per tutta la durata dell'esperimento.
   NOTA: I microscopi con camere ambientali sono preferibili per questa procedura per prevenire la disidratazione e mantenere il globo a temperature ottimali, ma non sono necessari.
2. Posizionare il coprifoglio, il supporto e il globo stabilizzato sul palco del microscopio all'interno della camera ambientale e l'immagine utilizzando tecniche di imaging di cellule vive⁹.
3. Pipettare ulteriori mezzi di crescita sul vetrino di copertura per prevenire la disidratazione e mantenere la vitalità dei tessuti. Assicurarsi che ci sia abbastanza mezzo nel pozzo per coprire il globo nel supporto. A seconda della durata dell'imaging, aggiungere un nuovo mezzo quando necessario durante l'esperimento.
4. Inizia gli esperimenti utilizzando tecniche e protocolli di imaging di cellule vive. Utilizzare impostazioni laser a bassa potenza per preservare il tessuto e prevenire danni ai tessuti in esperimenti di lunga durata. Utilizzare obiettivi appropriati per lunghe distanze di lavoro. Gli esperimenti in questo manoscritto sono stati eseguiti utilizzando un obiettivo 20x.
   NOTA: La potenza e il guadagno del laser, la durata sperimentale, la posizione e il piano di imaging sono tutte variabili a seconda dei parametri sperimentali. Esperimenti di imaging su globi intatti di durata compresa tra 1 h e 4 h sono stati eseguiti con successo nelle pubblicazioni precedenti¹⁰.
5. Registra e salva i dati nel formato di file preferito. Il software utilizzato dal microscopio produce file .czi per la registrazione dei dati.
6. Smaltire i globi secondo i protocolli istituzionali standard alla fine del protocollo.

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Risultati

Questo protocollo è stato utilizzato per produrre costantemente dati e immagini di qualità di pubblicazione¹⁰. Le immagini ottenute rappresentano un miglioramento significativo rispetto agli approcci precedenti (Figura 2). Utilizzando il supporto stampato in 3D, le immagini possono essere catturate attraverso gli strati della cornea e si può osservare la mobilizzazione del calcio in diversi piani z (Figura 3). Questo approccio è stato...

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Discussione

Questo protocollo descrive una tecnica di imaging cellulare vivo che utilizza un supporto stampato in 3D per stabilizzare e immobilizzare gli occhi degli animali intatti. È progettato per aggirare diversi svantaggi significativi riconosciuti con precedenti protocolli di imaging di cellule vive del tessuto corneale ex vivo . Questo protocollo offre molti vantaggi per l'imaging di cellule vive di globi intatti. Riduce significativamente i danni tissutali non necessari che potrebbero interferire con la risposta di...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic	Creality (Shenzen, China)	N/A	Material for holder
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-14-C	Well for imaging.
Autodesk Fusion 360 software	Autodesk (San Rafael, CA).	N/A	Software used for printing the holders.
BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)	305124	For experimentally-induced wounds to the globes
CellMask DeepRed	Invitrogen (Carlsbad, CA)	C10046	Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Complete Home Super Glue	Walgreens (Deerfield, IL)	N/A	For attaching the holder to the imaging well
Ender 3 Pro 3D printer	Creality (Shenzen, China)	N/A	For printing the holder
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	License Number: GPL2	Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Keratinocyte Serum-Free Medium	Gibco (Waltham, MA)	17005042	25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium
Phophate-Buffered Saline (PBS)	Corning, Medlabtech (Manassas, VA)	21-040-CV	Used to wash excess stain off of corneas before imaging
Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan	Zeiss (Thornwood, NY)	N/A	20x magnification objective was used