Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا يتم فيه استخدام نموذج xenograft المشتق من سرطان الدم الليمفاوي الحاد كاستراتيجية لتقييم ومراقبة السمية المرتبطة بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري التي تستهدف CD19.

Abstract

برز العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CART) كأداة قوية لعلاج أنواع متعددة من الأورام الخبيثة CD19 + ، مما أدى إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية مؤخرا على العديد من علاجات الخلايا CART (CART19) التي تستهدف CD19. ومع ذلك ، يرتبط العلاج بالخلايا CART بمجموعة فريدة من السميات التي تحمل معدلات المراضة والوفيات الخاصة بها. وهذا يشمل متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) والالتهاب العصبي (NI). كان استخدام نماذج الفئران قبل السريرية أمرا حاسما في البحث والتطوير لتكنولوجيا CART لتقييم كل من فعالية CART وسمية CART. تشمل النماذج قبل السريرية المتاحة لاختبار هذا العلاج المناعي الخلوي بالتبني نماذج الفئران الجينية ، و xenograft ، والمعدلة وراثيا ، والإنسانية. لا يوجد نموذج واحد يعكس بسلاسة جهاز المناعة البشري ، ولكل نموذج نقاط قوة وضعف. تهدف ورقة الطرق هذه إلى وصف نموذج xenograft المشتق من المريض باستخدام أرومات اللوكيميا من المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي الحاد كاستراتيجية لتقييم السمية المرتبطة ب CART19 ، CRS ، و NI. وقد ثبت أن هذا النموذج يلخص السمية المرتبطة ب CART19 بالإضافة إلى الفعالية العلاجية كما رأينا في العيادة.

Introduction

أحدث العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CART) ثورة في مجال العلاج المناعي للسرطان. لقد أثبت نجاحه في علاج سرطان الدم الليمفاوي الحاد الانتكاسي / المقاوم (ALL) ، وسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح ، وسرطان الغدد الليمفاوية الجريبي ، والورم النقوي المتعدد1،2،3،4،5،6،7 ، مما أدى إلى موافقات إدارة الغذاء والدواء الأخيرة. على الرغم من النجاح الأولي في التجارب السريرية ، فإن العلاج بخلايا CART يؤدي إلى سميات غالبا ما تكون شديدة ومميتة في بعض الأحيان. تشمل السميات الأكثر شيوعا بعد العلاج بخلايا CART تطوير CRS و NI ، والتي يشار إليها أيضا باسم متلازمة السمية العصبية المرتبطة بالخلايا المستجيبة المناعية (ICANS) 8,9. يحدث CRS بسبب الإفراط في التنشيط والتوسع الهائل لخلايا CART في الجسم الحي ، مما يؤدي إلى إفراز لاحق للعديد من السيتوكينات الالتهابية ، بما في ذلك γ الإنترفيرون ، وعامل نخر الورم α ، وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) ، والإنترلوكين -6 (IL-6). هذا يؤدي إلى انخفاض ضغط الدم ، وارتفاع في درجة الحرارة ، ومتلازمة تسرب الشعيرات الدموية ، وفشل الجهاز التنفسي ، وفشل متعدد الأعضاء ، وفي بعض الحالات ، الموت10,11. يتطور CRS في 50-100٪ من الحالات بعد العلاج بالخلايا CART1911،12،13. ICANS هو حدث ضار فريد آخر مرتبط بالعلاج بخلايا CART ويتميز بالوذمة الدماغية المعممة ، والارتباك ، والانقطاع ، وفقدان القدرة على الكلام ، والضعف الحركي ، وأحيانا النوبات 9,14. تحدث أي درجة من ICANS في ما يصل إلى 70٪ من المرضى ، ويتم الإبلاغ عن الدرجات 3-4 في 20-30٪ من المرضى5،10،15،16. بشكل عام ، CRS و ICANS شائعان ويمكن أن يكونا قاتلين.

تمثل إدارة ICANS بعد العلاج بالخلايا CART تحديا. يعاني معظم المرضى الذين يعانون من ICANS أيضا من CRS17 ، والذي يمكن علاجه غالبا باستخدام مضاد مستقبلات IL-6 توسيليزوماب أو المنشطات18. كشف تقرير سابق أن التدخل المبكر مع توسيليزوماب قلل من معدل CRS الشديد ولكنه لم يؤثر على حدوث أو شدة ICANS19. في الوقت الحالي ، لا يوجد علاج فعال أو عامل وقائي ل ICANS ، ومن الأهمية بمكان التحقيق في الاستراتيجيات الوقائية20.

يعتقد أن الخلايا النخاعية والسيتوكينات / الكيموكينات المرتبطة بها هي الدوافع الرئيسية لتطوير CRS و ICANS21. في حين أن CRS يرتبط ارتباطا مباشرا بالارتفاع الشديد للسيتوكينات وتوسع الخلايا التائية ، فإن الفيزيولوجيا المرضية ل ICANS غير معروفة إلى حد كبير22,23. لذلك ، من الضروري إنشاء نموذج فأر يلخص هذه السميات بعد العلاج بخلايا CART لدراسة الآليات وتطوير الاستراتيجيات الوقائية.

هناك العديد من النماذج الحيوانية قبل السريرية المستخدمة حاليا لدراسة وتحسين والتحقق من فعالية خلايا CART ، وكذلك لمراقبة السمية المرتبطة بها. وتشمل هذه الفئران الوراثية ، والطعم الأجنبي ، والمعدلة وراثيا ذات الكفاءة المناعية ، والمعدلة وراثيا المتوافقة مع البشر ، والفئران المشتقة من المريض ، بالإضافة إلى نماذج الرئيسيات. ومع ذلك ، فإن كل نموذج من هذه النماذج له عيوب ، وبعضها لا يعكس الفعالية الحقيقية أو مخاوف السلامة لخلايا CART24,25. لذلك ، لا بد من اختيار أفضل نموذج بعناية للأهداف المقصودة من الدراسة.

تسعى هذه المقالة إلى وصف المنهجية المستخدمة لتقييم السميات المرتبطة بخلايا CART ، CRS و NI ، باستخدام نموذج xenograft المشتق من المريض (PDX) في الجسم الحي (الشكل 1). على وجه التحديد ، في الطرق الموضحة هنا ، يتم استخدام خلايا CART19 التي تم إنشاؤها في مختبر المؤلفين باتباع البروتوكولات الموصوفة مسبقا. باختصار ، يتم عزل الخلايا التائية البشرية من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية من متبرع سليم (PBMCs) عبر تقنية تدرج الكثافة ، ويتم تحفيزها بخرز CD3 / CD28 في اليوم 0 ، ويتم تحويلها عدسيا في اليوم الأول مع CARs المكونة من جزء متغير أحادي السلسلة يستهدف CD19 يندمج في مجالات إشارات 4-1BB و CD3ζ. ثم يتم توسيع خلايا CART هذه ، وإزالة الخرز في اليوم 6 ، وحفظها بالتبريد في اليوم 826،27،28،29،30. كما هو موضح سابقا ، تخضع الفئران للعلاج اللمفاوي المستنفد ، يليه إعطاء أرومات اللوكيميا المشتقة من المريض (ALL)28. أولا ، يتم التحقق من تطعيم الورم عن طريق جمع الدم تحت الفك السفلي. بعد إنشاء عبء الورم المناسب ، يتم إعطاء خلايا CART19 للفئران. بعد ذلك ، يتم وزن الفئران يوميا لتقييم الرفاهية. يتم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة (MRI) لتقييم NI ، جنبا إلى جنب مع نزيف الذيل لتقييم توسع الخلايا التائية وإنتاج السيتوكين / الكيموكين. يوصى بشدة باستخدام التقنيات الموضحة أدناه كنموذج لدراسة السميات المرتبطة بخلايا CART في نموذج PDX.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول إرشادات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع ل Mayo Clinic، واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC A00001767)، واللجنة المؤسسية للسلامة الحيوية (IBC، Bios00000006.04).

ملاحظة: يجب أن تكون جميع المواد المستخدمة للعمل مع الفئران معقمة.

1. حقن بوسلفان لفئران NSG

  1. احصل على ذكور ، من عمر 8-12 أسبوعا ، تعاني من نقص المناعة ، NOD-SCID IL2rγnull (NSG) الفئران ، ووزنها قبل الحقن.
    ملاحظة: للدلالة الإحصائية ، يوصى باستخدام خمسة فئران على الأقل لكل مجموعة وتكرار هذه التجربة مرة أخرى على الأقل مع إناث الفئران.
  2. تحضير بوسلفان للحقن داخل الصفاق (i.p.) باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل ، املأ المحقنة ببطء وبعناية ب 30 مجم / كجم بالضبط من بوسلفان ، متبوعا بحقن i.p للفئران ، وضعها مرة أخرى في القفص.

2. حقن جميع الانفجارات المشتقة من المريض (CD19 +) لفئران NSG

ملاحظة: يتبع هذا البروتوكول إرشادات لجنة السلامة الحيوية المؤسسية في Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).

  1. جمع أرومات اللوكيميا الأولية من الدم المحيطي للمرضى الذين يعانون من ابيضاض الدم العضلي الحاد الانتكاسي والمقاوم للحرارة.
  2. تحضير الخلايا المستهدفة للحقن في الوريد (IV).
    1. عد الخلايا المستهدفة CD19 + باستخدام مقياس الدم ، وسجل الحجم النهائي وتركيز الخلايا.
      ملاحظة: لتحديد صلاحية الخلية ، يوصى بشدة باستخدام التريبان الأزرق أثناء عد الخلايا.
    2. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى تركيز نهائي يبلغ 50 × 106 خلايا / مل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وضعها على الجليد.
    4. دوامة الإصبع أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل الذي يحتوي على الخلايا المستهدفة حتى يتم تجانس الخلايا تماما.
    5. باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل ، املأ المحقنة ببطء وبعناية ب 100 ميكرولتر بالضبط من الخلايا المستهدفة المحضرة ، وحرك المحقنة لإزالة الفقاعات.
      ملاحظة: حجم 100 ميكرولتر سيدير 5 × 106 خلايا لكل ماوس.
    6. ضع الفئران تحت ضوء دافئ لمدة 5-10 دقائق. بمجرد أن يصبح الوريد الذيل محتقنا وأكثر وضوحا للعين المجردة ، ضع الفئران في غرفة حبس / تقييد مناسبة.
    7. امسح ذيل الماوس بمسحة كحول. حقن الخلايا المستهدفة مباشرة في الوريد الذيل (IV) ، ووضع الماوس مرة أخرى في القفص. بعد تلقيح الخلايا المستهدفة ، راقب الفئران يوميا أو على النحو الموصى به من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية.

3. تقييم تطعيم الورم

  1. بدءا من 6 أسابيع بعد حقن الخلية المستهدفة ، قم بتقييم تطعيم الورم باستخدام قياس التدفق الخلوي لقياس تعبير خلايا CD19 + في الدم المحيطي.
  2. فحص الدم المحيطي لتقييم توسع CD19 +
    1. سحب الدم من الفئران بعد 6-8 أسابيع من حقن خلية CART19.
      ملاحظة: يمكن استخدام عدة طرق لسحب الدم. بالنسبة لهذا البروتوكول ، فإن جمع الدم تحت الفك السفلي هو الطريقة المفضلة للاختيار.
    2. تخدير الماوس مع isoflurane في غرفة التعريفي مع 5 ٪ isoflurane. بمجرد الحصول على التخدير ، حافظ على 1-3٪ إيزوفلوران يستنشق من خلال مخروط الأنف.
      ملاحظة: يوصى بشدة بوضع مرهم العيون لمنع جفاف العين.
    3. أخرج الفأر من الحجرة ، وأمسك الماوس باليد غير المهيمنة عن طريق إمساك الجلد الرخو على الرقبة. ثقب الوريد مع لانسيت خلف الفك السفلي قليلا.
      ملاحظة: مطلوب فقط طرف الإبرة (1-2 مم) لدخول الوريد.
    4. أثناء تقطير الدم ، اجمع ما لا يقل عن 50 ميكرولتر في أنبوب مغلف بالهيبارين ، واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب لأعلى ولأسفل عدة مرات. انقل 30 ميكرولتر من الدم إلى أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 مل.
      ملاحظة: بالنسبة للدم المتبقي، قم بتدوير الأنبوب لأسفل عند 17000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المصل (طبقة طافت) إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وموسوم سعة 1.5 مل ، وقم بتخزينه في -80 درجة مئوية (للاستخدام في فحص السيتوكين).
    5. أضف 2 مل من محلول التحلل (10x محلول تحلل قائم على كلوريد الأمونيوم مخفف إلى 1x باستخدام ماء خال من النيوكلياز) في الأنبوب القاعي المستدير سعة 5 مل الذي يحتوي على الدم. تخلط جيدا عن طريق دوامة الأنبوب. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لضمان التحلل السليم لخلايا الدم الحمراء.
    6. أضف 2 مل من محلول التدفق (PBS ، 0.2 جم / لتر من كلوريد البوتاسيوم ، 0.2 جم / لتر من فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، 8 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، و 1.15 جم / لتر من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني و 1٪ أزيد الصوديوم).
    7. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية ، وأضف 2 مل من المخزن المؤقت للتدفق. كرر خطوة الغسيل هذه 2x.
    8. صب بعناية محتويات الأنبوب. راقب كمية صغيرة من السوائل مع وجود حبيبات متبقية في الأنبوب. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق ، وأعد التعليق جيدا.
    9. انقل كل السائل المتبقي في أنبوب التدفق سعة 5 مل إلى صفيحة 96 بئرا. تأكد من تسمية كل عينة بشكل صحيح. أضف 100 ميكرولتر من مخزن التدفق إلى الآبار المقابلة وأجهزة الطرد المركزي لوحة 96 بئرا عند 650 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. تقييم توسع الخلايا المستهدفة CD19 + عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 2).
    1. قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على 0.3 ميكرولتر من البقع الحية / الميتة ، و 0.13 ميكروغرام (2.5 ميكرولتر) من الجسم المضاد CD19 المضاد للإنسان ، و 0.06 ميكروغرام (2.5 ميكرولتر) من الجسم المضاد CD45 المضاد للإنسان ، و 5 ميكروغرام (2.5 ميكرولتر) من CD45 المضاد للفأر ، و 42.2 ميكرولتر من مخزن التدفق المؤقت لما مجموعه 50 ميكرولتر لكل عينة. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. يغسل ب 150 ميكرولتر من محلول التدفق متبوعا بالطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات في 195 ميكرولتر من مخزن التدفق و 5 ميكرولتر من عد الخرز.
    3. الحصول على مقياس التدفق الخلوي لتحديد مستوى تعبير خلية CD19 + . لأغراض البوابات والتحليل ، قم أولا ببوابة السكان محل الاهتمام (CD19 +) بناء على خصائص التشتت الأمامي مقابل الجانبي ، متبوعا بمجموعة بوابات واحدة ، ثم الخلايا الحية. بمجرد بوابة الخلايا الحية ، قم بتقييم CD45 البشري مقابل مجموعة CD45 للفأر ، ومن السكان البشريين ، قم ببوابة السكان المستهدفين CD19 + .
  4. حدد الكمية لتحديد الكمية الموجودة في 70 ميكرولتر ، ثم عبر عنها في الخلايا / ميكرولتر باستخدام المعادلة (1):
    عدد خلايا CD19 + المطلق = ([خلايا CD19 + / عد الخرزات] × عدد حبات العد في حدود 5 ميكرولتر) / 70
    ملاحظة: كرر فحص الدم المحيطي كل 5 أيام لتقييم توسع خلايا CD19 + . جمع ما لا يزيد عن 200 ميكرولتر من الدم بشكل تراكمي كل أسبوعين وفقا لإرشادات لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية. بمجرد أن تصل الفئران إلى عبء المرض البالغ ≥10 خلايا / ميكرولتر ، يتم اختيارها عشوائيا إلى خلية CART19 أو مجموعات التحكم (القسم 4).

4. إدارة خلايا CART19 في الجسم الحي

  1. تحضير خلايا CART19 (~ يوم 80):
    ملاحظة: تم نشر جيل خلايا CART19 مسبقا27،30،31. يجب تنفيذ هذا الإجراء داخل خزانة السلامة البيولوجية المستوى 2+ باستخدام تقنية التعقيم ومعدات الحماية الشخصية.
    1. قم بإذابة خلايا CART19 في وعاء حمام مائي (37 درجة مئوية). ثم اغسل الخلايا في وسط الخلايا التائية الدافئة (TCM) لإزالة ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
      ملاحظة: يتكون الطب الصيني التقليدي من 10٪ مصل AB البشري (v / v) ، و 1٪ البنسلين - الستربتومايسين - الجلوتامين (v / v) ، ووسط الخلية المكونة للدم الخالي من المصل27،30.
    2. قم بطرد خلايا CART19 عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وأعد تعليقها في TCM الدافئ إلى تركيز نهائي قدره 2 × 106 خلايا / مل. اترك خلايا CART ترتاح في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) طوال الليل ولكن لمدة لا تزيد عن 16 ساعة.
  2. إعطاء خلايا CART19 عن طريق الحقن الوريدي (يوم ~ 80)
    1. عد خلايا CART19 ، وقم بتدويرها لأسفل عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. أعد تعليق خلايا CART19 ب 10 مل من PBS ، وقم بتدويرها لأسفل عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. أعد تعليق خلايا CART19 إلى تركيز نهائي يبلغ 40 × 106 خلايا / مل باستخدام برنامج تلفزيوني ، وانقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل ، وضعها على الجليد.
    4. قم بإجراء حقن الوريد الذيل للخلايا CART19 (كما هو مفصل أعلاه) عن طريق حقن 100 ميكرولتر من الخلايا المعلقة i.v.
      ملاحظة: حجم 100 ميكرولتر سيدير 4 × 106 خلايا لكل ماوس. قم بتضمين مجموعة من الفئران غير المعالجة كعنصر تحكم سلبي.

5. تقييم السمية المرتبطة بالخلايا CART19

  1. بعد إعطاء خلية CART19 ، راقب الفئران 2x يوميا لتقييم أي تغييرات في رفاهيتها ، مثل ضعف الحركة والجسم المنحني وفقدان وزن الجسم.
    ملاحظة: كل هذه التغييرات الجسدية ترتبط بأعراض CRS في هذا النموذج28.
  2. بمجرد أن تبدأ الفئران في تطوير ضعف الحركة وانخفاض الوزن (انخفاض بنسبة 10-20٪ من خط الأساس) ، قم بجمع الدم المحيطي لتحليل عبء الورم وإجراء عزل المصل للسيتوكينات وفقا للمنهجية الموضحة في القسم 3 (الشكل 3).
  3. قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في المصل عند -80 درجة مئوية ، واستخدم الأمصال لتحليل الكيموكينات والسيتوكينات باستخدام مقايسة Multiplex (الشكل 4).
    ملاحظة: إذا ظهرت على الفئران علامات شلل الأطراف الخلفية ، وبدت محتضرة أو خاملة ، وكان فقدان الوزن > 20٪ من وزن الجسم حتى النقطة التي تحد من قدرتها على الوصول إلى الطعام و / أو الماء ، فستتعرض للقتل الرحيم.

6. التصوير بالرنين المغناطيسي

ملاحظة: تم استخدام ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي قبل السريري (للحيوانات الصغيرة) مع مغناطيس تجويف عمودي للرنين المغناطيسي في الجسم الحي والحصول على الصور32،33.

  1. امزج 120 ميكرولتر من الجادولينيوم + 880 ميكرولتر من محلول ملحي ، وقم بتحميله في حقنة أنسولين سعة 1 مل. حقن 100 ميكرولتر في كل فأر (أي p.).
    ملاحظة: يجب حقن الجادولينيوم قبل 15-20 دقيقة من بدء التجربة.
  2. تخدير الماوس باستخدام الأيزوفلوران (2-3٪) في غرفة الحث لمدة 10-15 دقيقة.
    ملاحظة: يوصى بشدة بوضع مرهم العيون لمنع جفاف العين.
  3. ضع العمود الفقري للفأر على مسبار المهد المتوافق مع القوارض. ثم ، تابع وضع الماوس عن طريق ربط أسنانه على شريط اللدغة.
  4. اسحب رأس الماوس إلى ملف الحجم 25 مم ، واضبط مخروط الأنف المربوط بنظام التخدير isoflurane. أحكم ربط مقبض شريط العضة للحفاظ على الوضع طوال مدة الفحص.
    ملاحظة: في حالة إجراء فحص التصوير بالرنين المغناطيسي المعزز بالتباين ، تأكد من حقن الجادولينيوم (في هذه الحالة) أو عامل التباين قبل 10 دقائق على الأقل من وضع الجهاز في مغناطيس التجويف. طوال فترة التصوير ، سيتم تخدير الفئران عن طريق استنشاق 2-3 ٪ إيزوفلوران في الهواء عبر مخروط الأنف ، وسيتم مراقبة معدل التنفس في وقت واحد.
  5. لتقييم التنفس ، استخدم جهاز مراقبة التنفس / التنفس.
    ملاحظة: من المهم تقييم درجة حرارة الجسم أيضا من أجل منع انخفاض حرارة الجسم المحتمل بسبب التعرض الطويل للتخدير. يوصى باستخدام منصات الحرارة للتحكم في درجة حرارة الجسم.
    1. قم بتوصيل مسبار مراقبة التنفس بالقرب من الحجاب الحاجز ، وقم بتثبيته بشريط جراحي. حافظ على معدل التنفس بين 20-60 نفسا في الدقيقة حتى تكون حالة الفأر مستقرة.
      ملاحظة: يوفر هذا المعدل صور تصوير بالرنين المغناطيسي أكثر استقرارا ويمنع حدوث آثار الحركة في الصورة التي تم الحصول عليها. إذا كان معدل التنفس أعلى من 20-60 نفسا في الدقيقة ، فقم بزيادة تركيز الأيزوفلوران. إذا كان معدل التنفس أقل من 20 نفسا في الدقيقة ، يكون التخدير عميقا جدا. لذلك ، يجب تقليل التركيز.
  6. أدخل مسبار الحيوان في التجويف الصغير داخل نظام التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة ذو التجويف الرأسي. اضبط رأس الحيوان في وسط الملف. قم بتأمين الجهاز بالقفل حتى يتمكن من الوقوف في وضع مستقيم ، وقم بتوصيل الجهاز بالكمبيوتر.
  7. افتح البرنامج واستخدمه (على سبيل المثال ، Paravision) لإعداد مواضع الفحص وأنواع عمليات الفحص. تحديد المواضع المحورية والسهمية المثلى مع الحفاظ على اتساقها لجميع المجموعات التجريبية.
    ملاحظة: يوصى باستخدام الحصول على فحص تجريبي كمرجع قبل فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي الفعلية كاملة الطول.
  8. تابع جمع بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي (كما هو موضح سابقا32،34،35،36). احصل على كل من صور التصوير بالرنين المغناطيسي المرجحة T1 و T2 باستخدام الإعداد المقترح المذكور أدناه.
    1. بالنسبة لصور التصوير بالرنين المغناطيسي المرجحة T1 ، استخدم تسلسل متعدد الصدى متعدد الشرائح (MSME) مرجح T1 مع وقت تكرار (TR) يبلغ 300 مللي ثانية ، وزمن صدى (TE) يبلغ 9.5 مللي ثانية ، ومجال رؤية (FOV) يبلغ 4 سم × 2 سم × 2 سم ، ومصفوفة 192 × 96 × 96.
    2. بالنسبة لصور التصوير بالرنين المغناطيسي المرجحة T2 ، استخدم تسلسل Multislice Multiecho (MSME) مع TR من 300 مللي ثانية ، و TE من 9.5 مللي ثانية ، ومجال الرؤية من 4 سم × 2 سم × 2 سم ، ومصفوفة من 192 × 96 × 96 تم استخدامها.
  9. بمجرد اكتمال عمليات الفحص ، قم بإزالة المسبار من التجويف. استخراج الماوس برفق عن طريق إزالة الأسنان من شريط اللدغة. راقب الحيوان في قفص منفصل حتى يصبح واعيا تماما ويستعيد الوظيفة الحركية الكافية.
  10. بعد استخراج البيانات من البرنامج ، استخدم برنامج التحليل للقياس الكمي وتقديم حجم 3D (الشكل 4) لمناطق فرط الكثافة.
    ملاحظة: إذا أمكن، يشجع بشدة على وجود مراقبين منفصلين أعمى لتحليل البيانات.

النتائج

الهدف من هذا البروتوكول هو تقييم السمية المرتبطة بخلايا CART باستخدام نموذج الفئران PDX من الخلايا السرطانية للمرضى الذين يعانون من ALL (الشكل 1). أولا ، تلقت الفئران NSG حقن i.p. من بوسلفان (30 ملغم / كغم) بهدف كبت المناعة لهم وتسهيل تطعيم خلايا CART28. في اليوم التالي ، تلقو...

Discussion

في هذا التقرير ، تم وصف منهجية لتقييم السمية المرتبطة بخلايا CART باستخدام نموذج ALL PDX. وبشكل أكثر تحديدا ، يسعى هذا النموذج إلى تقليد سميتين تهددان الحياة ، CRS و NI ، والتي غالبا ما يعاني منها المرضى بعد ضخ خلايا CART. يلخص العديد من السمات المميزة لسمية CART التي لوحظت في العيادة: فقدان الوزن ، وال?...

Disclosures

S.S.K. هو مخترع براءات الاختراع في مجال العلاج المناعي CAR المرخص لشركة Novartis (من خلال اتفاقية بين Mayo Clinic وجامعة بنسلفانيا وشركة Novartis) وشركة Mettaforge (من خلال Mayo Clinic). R.L.S. و S.S.K. مخترعون على براءات اختراع في مجال العلاج المناعي CAR المرخصة لشركة Humanigen. تتلقى SSK تمويلا بحثيا من Kite و Gilead و Juno و Celgene و Novartis و Humanigen و MorphoSys و Tolero و Sunesis و Leahlabs و Lentigen.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المعاهد الوطنية للصحة (R37CA266344 ، 1K99CA273304) ، ووزارة الدفاع (CA201127) ، وخط أنابيب Mayo Clinic K2R (SSK) ، ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK) ، ومؤسسة Predolin (R.L.S.). بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر موظفي مرفق الرنين المغناطيسي النووي الأساسي في Mayo Clinic. تم إنشاء الشكل 1 في عام BioRender.com

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
 APC Anti-Human CD19Biolegend302211
Alcohol Prep PadWecol6818
Analyze 14.0 softwareAnalyzeDirect Inc.N/Ahttps://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)Akorn17478-062-35Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution BD349202Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringesBD329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45Biolegend304032
Bruker Avance II 7 Tesla Bruker BiospinN/AMRI machine
Busulfan (NSC-750)SelleckchemS1692
CountBright absolute counting beadsInvitrogenC36950
CytoFLEX System B4-R2-V2Beckman CoulterC10343flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144 
ERT Control/Gating Module SA InstrumentsModel 1030Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
HemocytometerBright-LineZ359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; USCorning35-060-CI
Isoflurane (Liquid)Sigma-Aldrich792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
Microvette 500 Lithium heparinSarstedt20.1345.100Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads PanelMillipore SigmaHCYTMAG-60K-PX38Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
OmniscanGe Healthcare Inc.0407-0690-10Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45Biolegend103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
Round Bottom Polysterene Test tubeCorning352008
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
Stainless Steel Surgical BladeBard-Parker371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin's lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. Cancer Research. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192 CART CART xenograft PDX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved