Évaluation des toxicités associées aux lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique à l’aide d’un modèle murin xénogreffé dérivé d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole dans lequel un modèle de xénogreffe dérivée d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë est utilisé comme stratégie pour évaluer et surveiller les toxicités associées aux lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique CD19.

Résumé

La thérapie cellulaire par récepteur T de l’antigène chimérique (CART) est devenue un outil puissant pour le traitement de plusieurs types de tumeurs malignes CD19⁺ , ce qui a conduit à l’approbation récente par la FDA de plusieurs thérapies cellulaires CART ciblées par CD19 (CART19). Cependant, la thérapie cellulaire CART est associée à un ensemble unique de toxicités qui entraînent leur propre morbidité et mortalité. Cela inclut le syndrome de libération de cytokines (SRC) et la neuroinflammation (NI). L’utilisation de modèles murins précliniques a été cruciale dans la recherche et le développement de la technologie CART pour évaluer à la fois l’efficacité et la toxicité CART. Les modèles précliniques disponibles pour tester cette immunothérapie cellulaire adoptive comprennent des modèles de souris syngéniques, xénogreffées, transgéniques et humanisées. Il n’existe pas de modèle unique qui reflète parfaitement le système immunitaire humain, et chaque modèle a des forces et des faiblesses. Cet article sur les méthodes vise à décrire un modèle de xénogreffe dérivé d’un patient utilisant des blastes leucémiques de patients atteints de leucémie lymphoblastique aiguë comme stratégie pour évaluer les toxicités associées à CART19, CRS et NI. Il a été démontré que ce modèle récapitule les toxicités associées à CART19 ainsi que l’efficacité thérapeutique observée en clinique.

Introduction

La thérapie cellulaire par récepteur T de l’antigène chimérique (CART) a révolutionné le domaine de l’immunothérapie du cancer. Il s’est avéré efficace dans le traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë (LAL) récidivante / réfractaire, du lymphome à grandes cellules B, du lymphome à cellules du manteau, du lymphome folliculaire et du myélome multiple 1,2,3,4,5,6,7^, conduisant à des approbations récentes de la FDA. Malgré le succès initial des essais cliniques, le traitement par thérapie cellulaire CART entraîne des toxicités souvent graves et parfois mortelles. Les toxicités les plus courantes après la thérapie cellulaire CART comprennent le développement du SRC et de l’IN, également appelé syndrome de neurotoxicité associée aux cellules effectrices immunitaires (ICANS)^8,9. Le SRC est dû à la suractivation et à l’expansion massive des cellules CART in vivo, entraînant la sécrétion ultérieure de multiples cytokines inflammatoires, notamment l’interféron-γ, le facteur de nécrose tumorale α, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et l’interleukine-6 (IL-6). Il en résulte une hypotension, de fortes fièvres, un syndrome de fuite capillaire, une insuffisance respiratoire, une défaillance multiviscérale et, dans certains cas,^{la mort 10,11}. Le SRC se développe dans 50 à 100 % des cas après la thérapie cellulaire CART19^11,12,13. ICANS est un autre événement indésirable unique associé à la thérapie cellulaire CART et se caractérise par un œdème cérébral généralisé, une confusion, une obnubilation, une aphasie, une faiblesse motrice et, occasionnellement, des convulsions ^9,14. Tout grade d’ICANS survient chez jusqu’à 70% des patients, et des grades 3-4 sont rapportés chez 20-30% des patients 5,10,15,16. Dans l’ensemble, les SRC et les ICANS sont courants et peuvent être mortels.

La prise en charge d’ICANS après la thérapie cellulaire CART est difficile. La plupart des patients atteints d’ICANS présentent également un CRS¹⁷, qui peut souvent être traité avec l’antagoniste des récepteurs de l’IL-6 tocilizumab ou des stéroïdes¹⁸. Un rapport précédent a révélé qu’une intervention précoce avec le tocilizumab diminuait le taux de SRC sévère mais n’affectait pas l’incidence ou la gravité de l’ICANS¹⁹. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace ou d’agent prophylactique pour ICANS, et il est crucial d’étudier des stratégies préventives²⁰.

Les cellules myéloïdes et les cytokines/chimiokines associées seraient les principaux moteurs du développement du SRC et de l’ICANS²¹. Alors que le CRS est directement lié à l’élévation extrême des cytokines et à l’expansion des lymphocytes T, la physiopathologie d’ICANS est largement inconnue^22,23. Il est donc impératif d’établir un modèle murin qui récapitule ces toxicités après la thérapie cellulaire CART pour étudier les mécanismes et développer des stratégies préventives.

Plusieurs modèles animaux précliniques sont actuellement utilisés pour étudier, optimiser et valider l’efficacité des cellules CART, ainsi que pour surveiller leurs toxicités associées. Il s’agit notamment de souris syngéniques, xénogreffées, transgéniques immunocompétentes, transgéniques humanisées et xénogreffes dérivées de patients, en plus des modèles de primates. Cependant, chacun de ces modèles présente des inconvénients, et certains ne reflètent pas les véritables préoccupations en matière d’efficacité ou d’innocuité des cellules CART^24,25. Par conséquent, il est impératif de choisir soigneusement le meilleur modèle pour les objectifs visés de l’étude.

Cet article vise à décrire la méthodologie utilisée pour évaluer les toxicités associées aux cellules CART, CRS et NI, à l’aide d’un modèle in vivo de xénogreffe dérivée de patients (PDX) LAL (Figure 1). Plus précisément, dans les méthodes décrites ici, les cellules CART19 générées dans le laboratoire des auteurs sont utilisées selon les protocoles décrits précédemment. En bref, les lymphocytes T humains sont isolés à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de donneurs sains par une technique de gradient de densité, stimulés avec des billes CD3/CD28 au jour 0 et transduits lentiviraux le jour 1 avec des CARs composés d’un fragment variable à chaîne unique ciblant CD19 fusionné aux domaines de signalisation 4-1BB et CD3ζ. Ces cellules CART sont ensuite dilatées, déperlées le jour 6 et cryoconservées le jour 8 26,27,28,29,30. Comme indiqué précédemment, les souris sont soumises à un traitement lymphodéplétif, suivi de l’administration de blastes leucémiques dérivés du patient (LAL)²⁸. Tout d’abord, la greffe de tumeur est vérifiée par prélèvement de sang sous-maxillaire. Après l’établissement d’une charge tumorale appropriée, des cellules CART19 sont administrées aux souris. Ensuite, les souris sont pesées quotidiennement pour évaluer leur bien-être. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) chez les petits animaux est effectuée pour évaluer l’IN, ainsi que le saignement de la queue pour évaluer l’expansion des lymphocytes T et la production de cytokines / chimiokines. Les techniques décrites ci-dessous sont fortement recommandées pour être utilisées comme modèle pour étudier les toxicités associées aux cellules CART dans un modèle PDX.

Protocole

Ce protocole suit les directives du comité d’examen institutionnel (IRB), du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC A00001767) et du comité institutionnel de biosécurité (IBC, Bios00000006.04) de la Mayo Clinic.

NOTE: Tous les matériaux utilisés pour travailler avec les souris doivent être stériles.

1. Injection de busulfan à des souris NSG

1. Obtenir des souris mâles immunodéprimées âgées de 8 à 12 semaines NOD-SCID IL2rγnull (NSG) et les peser avant l’injection.
   NOTE: Pour la signification statistique, il est recommandé d’utiliser au moins cinq souris par groupe et de répéter cette expérience au moins une fois de plus avec des souris femelles.
2. Préparer le busulfan pour injection intrapéritonéale (i.p.). À l’aide d’une seringue à insuline de 1 mL, remplir lentement et soigneusement la seringue avec exactement 30 mg / kg de busulfan, suivie d’une injection intraveineuse aux souris, et les replacer dans la cage.

2. Injection de TOUS les blastes dérivés du patient (CD19⁺) aux souris NSG

REMARQUE: Ce protocole suit les directives du comité institutionnel de biosécurité de la Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).

1. Recueillir les blastes leucémiques primaires du sang périphérique des patients atteints de LAL récidivante et réfractaire.
2. Préparer les cellules cibles pour l’injection intraveineuse (i.v.).
   1. Compter les cellules cibles de CD19⁺ à l’aide d’un hémocytomètre et noter le volume final et la concentration des cellules.
      REMARQUE: Pour déterminer la viabilité cellulaire, il est fortement recommandé d’utiliser le bleu de trypan lors du comptage des cellules.
   2. Enduire les cellules par centrifugation à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   3. Resuspendre la pastille cellulaire dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à une concentration finale de 50 × 10⁶ cellules/mL dans un tube à microcentrifuger de 1,5 mL et placer sur de la glace.
   4. Tourbillon de doigt : tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant les cellules cibles jusqu’à ce que les cellules soient complètement homogénéisées.
   5. À l’aide d’une seringue à insuline de 1 mL, remplissez lentement et soigneusement la seringue avec exactement 100 μL des cellules cibles préparées et agitez la seringue pour éliminer les bulles.
      REMARQUE: Le volume de 100 μL administrera 5 × 10⁶ cellules à chaque souris.
   6. Placez les souris sous une lumière chaude pendant 5-10 min. Une fois que la veine de la queue devient engorgée et plus visible à l’œil nu, placez les souris dans une chambre de confinement / contention appropriée.
   7. Essuyez la queue de la souris avec un tampon imbibé d’alcool. Injectez les cellules cibles directement dans la veine de la queue (i.v.) et replacez la souris dans la cage. Après l’inoculation des cellules cibles, surveiller les souris quotidiennement ou selon les recommandations du comité local d’éthique animale.

3. Évaluation de la greffe de tumeur

1. À partir de 6 semaines après l’injection de cellules cibles, évaluer la greffe tumorale en utilisant la cytométrie de flux pour mesurer l’expression des cellules CD19⁺ dans le sang périphérique.
2. Test de sang périphérique pour évaluer l’expansion des CD19⁺
   1. Prélever le sang des souris 6 à 8 semaines après l’injection de cellules CART19.
      REMARQUE: Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour prélever du sang. Pour ce protocole, le prélèvement sanguin sous-maxillaire est la méthode de choix privilégiée.
   2. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane dans une chambre d’induction avec 5% d’isoflurane. Une fois l’anesthésie terminée, maintenir à 1-3% l’isoflurane inhalé par un cône nasal.
      REMARQUE: Il est fortement recommandé d’appliquer une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse oculaire.
   3. Retirez la souris de la chambre et tenez-la avec la main non dominante en saisissant la peau lâche sur le cou. Percer la veine avec une lancette légèrement derrière la mandibule.
      REMARQUE: Seule la pointe de l’aiguille (1-2 mm) est nécessaire pour entrer dans la veine.
   4. Pendant que le sang coule, recueillir au moins 50 μL dans un tube recouvert d’héparine et bien mélanger en inversant le tube de haut en bas plusieurs fois. Transférer 30 μL de sang dans un tube en polystyrène à fond rond de 5 mL.
      NOTE: Pour le sang restant, faire tourner le tube vers le bas à 17 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Transférer le sérum (couche surnageante) dans un tube microcentrifuge propre et marqué de 1,5 mL et le conserver à -80 °C (pour une utilisation dans le dosage des cytokines).
   5. Ajouter 2 mL de tampon de lyse (10x tampon de lyse à base de chlorure d’ammonium dilué à 1x avec de l’eau sans nucléase) dans le tube inférieur rond de 5 ml contenant le sang. Mélangez très bien en faisant tourbillonner le tube. Incuber le tube à température ambiante pendant 20 min pour assurer une bonne lyse des globules rouges.
   6. Ajouter 2 mL de tampon d’écoulement (PBS, 0,2 g/L de chlorure de potassium, 0,2 g/L de phosphate de potassium monobasique, 8 g/L de chlorure de sodium et 1,15 g/L de phosphate dibasique de sodium contenant 2 % de sérum fœtal bovin et 1 % d’azoture de sodium).
   7. Centrifuger le tube à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Décanter le surnageant et ajouter 2 mL de tampon d’écoulement. Répétez cette étape de lavage 2x.
   8. Décanter soigneusement le contenu du tube. Observez la petite quantité de liquide avec une pastille restant dans le tube. Ajouter 100 μL de tampon de débit et remettre en suspension très bien.
   9. Transférer tout le liquide restant dans le tube d’écoulement de 5 mL dans une plaque de 96 puits. Assurez-vous que chaque échantillon est correctement étiqueté. Ajouter 100 μL de tampon de débit aux puits correspondants et centrifuger la plaque de 96 puits à 650 × g pendant 3 min à 4 °C.
3. Évaluer l’expansion des cellules cibles CD19⁺ par cytométrie en flux (Figure 2).
   1. Préparer un mélange maître contenant 0,3 μL de coloration vivante/morte, 0,13 μg (2,5 μL) d’anticorps anti-CD19 humain, 0,06 μg (2,5 μL) d’anticorps anti-CD45 humain, 5 μg (2,5 μL) de CD45 anti-souris et 42,2 μL de tampon d’écoulement pour un total de 50 μL par échantillon. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 min.
   2. Laver avec 150 μL de tampon de débit suivi d’une centrifugation à 650 × g pendant 3 min à 4 °C. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 195 μL de tampon d’écoulement et 5 μL de billes de comptage.
   3. Acquérir sur un cytomètre en flux pour déterminer le niveau d’expression des cellules CD19⁺ . Aux fins de contrôle et d’analyse, il faut d’abord ouvrir la porte à la population d’intérêt (CD19⁺) en fonction des caractéristiques de diffusion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale, puis par une seule population de points de contrôle, puis par des cellules vivantes. Une fois que les cellules vivantes sont fermées, évaluer la population de CD45 humain par rapport à la population de CD45 de souris et, à partir de la population humaine, la population cible de CD19⁺ .
4. Quantifier pour déterminer la quantité présente dans 70 μL, puis exprimer en cellules/μL à l’aide de l’équation (1) :
   Compte absolu de CD19+ = ([CD19⁺ cellules/billes de comptage] × nombre de billes de comptage dans 5 μL)/70
   REMARQUE : Répétez le test sanguin périphérique tous les 5 jours pour évaluer l’expansion des cellules CD19⁺ . Ne pas prélever plus de 200 μL de sang cumulativement toutes les 2 semaines conformément aux directives du comité local d’éthique animale. Une fois que les souris ont atteint une charge de morbidité de ≥10 cellules/μL, randomiser dans les cellules CART19 ou les groupes témoins (section 4).

4. Administration de cellules CART19 in vivo

1. Préparation des cellules CART19 (~Jour 80):
   NOTE: La génération de cellules CART19 a déjà été publiée 27,30,31. Cette procédure doit être effectuée à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité de niveau 2+ à l’aide d’une technique aseptique et d’un équipement de protection individuelle.
   1. Décongeler les cellules CART19 dans un récipient à bain-marie (37 °C). Ensuite, lavez les cellules dans un milieu de cellules T chaud (MTC) pour éliminer le diméthylsulfoxyde.
      REMARQUE: La MTC est composée de 10% de sérum AB humain (v / v), de 1% de pénicilline-streptomycine-glutamine (v / v) et de milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum^27,30.
   2. Centrifuger les cellules CART19 à 300 × g pendant 8 min à 4 °C et les remettre en suspension dans une MTC chaude jusqu’à une concentration finale de 2 × 10⁶ cellules/mL. Laisser reposer les cellules CART dans un incubateur (37 °C, 5% CO₂) pendant une nuit, mais pas plus de 16 h.
2. Administration de cellules CART19 par injection intraveineuse (Jour ~80)
   1. Compter les cellules CART19 et faire tourner vers le bas à 300 × g pendant 8 min à 4 °C.
   2. Resuspendre les cellules CART19 avec 10 mL de PBS et faire tourner vers le bas à 300 × g pendant 8 min à 4 °C.
   3. Resuspendre les cellules CART19 à une concentration finale de 40 × 10⁶ cellules/mL avec du PBS, transférer les cellules dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL et les placer sur de la glace.
   4. Effectuer des injections de veines caudales CART19 (comme détaillé ci-dessus) en injectant 100 μL de cellules en suspension i.v.
      REMARQUE: Un volume de 100 μL administrera 4 × 10⁶ cellules à chaque souris. Inclure un groupe de souris non traitées comme témoin négatif.

5. Évaluation des toxicités associées aux cellules CART19

1. Après l’administration de cellules CART19, surveillez les souris 2 fois par jour pour évaluer tout changement dans leur bien-être, tel que la faiblesse motrice, le corps voûté et la perte de poids corporel.
   REMARQUE: Tous ces changements physiques sont en corrélation avec les symptômes du SRC dans ce modèle²⁸.
2. Une fois que les souris commencent à développer une faiblesse motrice et une réduction de poids (réduction de 10 à 20% par rapport à la ligne de base), prélever du sang périphérique pour analyser la charge tumorale et procéder à l’isolement sérique des cytokines selon la méthodologie décrite à la rubrique 3 (Figure 3).
3. Conserver les tubes de microcentrifugation sérique à -80 °C et utiliser les sérums pour analyser les chimiokines et les cytokines à l’aide d’un test multiplex (Figure 4).
   REMARQUE: Si les souris présentent des signes de paralysie des membres postérieurs, semblent moribondes ou léthargiques et que la perte de poids est > 20% de leur poids corporel jusqu’au point qui limite leur capacité à atteindre la nourriture et / ou l’eau, elles seront soumises à l’euthanasie.

6. Imagerie IRM

REMARQUE : Un scanner IRM préclinique (pour petits animaux) avec un aimant à alésage vertical a été utilisé pour la résonance magnétique in vivo et l’acquisition d’images^32,33.

1. Mélanger 120 μL de Gadolinium + 880 μL de solution saline et charger dans une seringue à insuline de 1 mL. Injecter 100 μL dans chaque souris (i.p.).
   REMARQUE: Le gadolinium doit être injecté 15-20 min avant le début de l’expérience.
2. Anesthésier la souris à l’aide d’isoflurane (2-3%) dans une chambre d’induction pendant 10-15 min.
   REMARQUE: Il est fortement recommandé d’appliquer une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse oculaire.
3. Placez la colonne vertébrale de la souris sur la sonde de berceau compatible rongeurs. Ensuite, procédez au positionnement de la souris en accrochant ses dents sur la barre de morsure.
4. Tirez la tête de la souris dans la bobine de volume de 25 mm et ajustez le cône nasal attaché au système d’anesthésie à l’isoflurane. Serrez le bouton de la barre de morsure pour maintenir la position pendant toute la durée de l’analyse.
   REMARQUE: Si vous effectuez une IRM à contraste amélioré, assurez-vous que le gadolinium (dans ce cas) ou l’agent de contraste est injecté au moins 10 minutes avant de placer l’appareil dans l’aimant d’alésage. Pendant toute la durée de l’imagerie, les souris seront anesthésiées par inhalation d’isoflurane à 2-3% dans l’air via le cône nasal, et leur fréquence respiratoire sera surveillée simultanément.
5. Pour l’évaluation de la respiration, utilisez un appareil de surveillance respiratoire ou respiratoire.
   REMARQUE: Il est important d’évaluer également la température corporelle afin de prévenir une hypothermie possible due à une exposition prolongée à l’anesthésie. Il est recommandé d’utiliser des coussins chauffants pour contrôler la température corporelle.
   1. Fixez la sonde du moniteur respiratoire près du diaphragme et fixez-la avec du ruban chirurgical. Maintenez le taux respiratoire entre 20 et 60 respirations par minute afin que l’état de la souris soit stable.
      REMARQUE: Ce taux fournit des images IRM plus stables et empêche les artefacts de mouvement dans l’image acquise. Si la fréquence respiratoire est supérieure à la plage de 20 à 60 respirations par minute, augmentez la concentration d’isoflurane. Si la fréquence respiratoire est inférieure à 20 respirations par minute, l’anesthésie est trop profonde; Par conséquent, la concentration doit être diminuée.
6. Insérez la sonde animale dans le petit calibre du système d’IRM pour petits animaux à alésage vertical. Ajustez la tête de l’animal au centre de la bobine. Fixez l’appareil avec le verrou afin qu’il puisse se tenir debout et connectez l’instrument à l’ordinateur.
7. Ouvrez et utilisez le logiciel (p. ex., Paravision) pour configurer les positions et les types de numérisation. Déterminer les positions axiales et sagittales optimales tout en les maintenant cohérentes pour tous les groupes expérimentaux.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser l’acquisition d’un scan d’essai comme référence avant les IRM complètes.
8. Procéder à la collecte des données d’IRM (comme décrit précédemment^32,34,35,36). Obtenez des images IRM pondérées T1 et T2 en utilisant la configuration suggérée mentionnée ci-dessous.
   1. Pour les images IRM pondérées T1, utilisez une séquence multiécho multicoupes pondérée T1 (MSME) avec un temps de répétition (TR) de 300 ms, un temps d’écho (TE) de 9,5 ms, un champ de vision (FOV) de 4 cm x 2 cm x 2 cm et une matrice de 192 x 96 x 96.
   2. Pour les images IRM pondérées en T2, utilisez une séquence Multislice Multiecho (MSME) avec un TR de 300 ms, un TE de 9,5 ms, un champ de vision de 4 cm x 2 cm x 2 cm et une matrice de 192 x 96 x 96 a été utilisée.
9. Une fois les scans terminés, retirez la sonde de l’alésage. Extrayez doucement la souris en retirant les dents de la barre de morsure. Surveillez l’animal dans une cage séparée jusqu’à ce qu’il soit pleinement conscient et qu’il ait retrouvé une fonction motrice adéquate.
10. Après l’extraction des données du logiciel, utilisez un logiciel d’analyse pour la quantification et le rendu de volume 3D (Figure 4) des régions d’hyperintensité.
    REMARQUE : Dans la mesure du possible, il est fortement recommandé d’avoir deux observateurs à l’insu distincts pour l’analyse des données.

Résultats

L’objectif de ce protocole est d’évaluer les toxicités associées aux cellules CART à l’aide d’un modèle de souris PDX à partir de cellules tumorales de patients atteints de LAL (Figure 1). Tout d’abord, les souris NSG ont reçu des injections i.p. de busulfan (30 mg / kg) dans le but de les immunosupprimer et de faciliter la greffe de cellules CART²⁸. Le lendemain, ils ont reçu ~5 × 10^{6 PBMC} (i.v.) dérivés de TOUS les patients. Les souri...

Discussion

Dans ce rapport, une méthodologie pour évaluer les toxicités associées aux cellules CART à l’aide d’un modèle ALL PDX a été décrite. Plus précisément, ce modèle cherche à imiter deux toxicités potentiellement mortelles, CRS et NI, que les patients éprouvent souvent après la perfusion de cellules CART. Il récapitule de nombreuses caractéristiques des toxicités CART observées en clinique : perte de poids, dysfonctionnement moteur, neuroinflammation, production de cytokines inflammatoires et de chimi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q