Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo no qual um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes com leucemia linfoblástica aguda é usado como estratégia para avaliar e monitorar as toxicidades associadas ao receptor de antígeno quimérico CD19-alvo.

Resumo

A terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CART) emergiu como uma ferramenta poderosa para o tratamento de vários tipos de malignidades CD19⁺ , o que levou à recente aprovação pelo FDA de várias terapias celulares CART direcionadas para CD19 (CART19). No entanto, a terapia celular CART está associada a um conjunto único de toxicidades que carregam sua própria morbidade e mortalidade. Isso inclui a síndrome de liberação de citocinas (SRC) e a neuroinflamação (NI). O uso de modelos pré-clínicos em camundongos tem sido crucial na pesquisa e desenvolvimento da tecnologia CART para avaliar tanto a eficácia quanto a toxicidade da CART. Os modelos pré-clínicos disponíveis para testar essa imunoterapia celular adotiva incluem modelos de camundongos singênicos, xenoenxertos, transgênicos e humanizados. Não há um modelo único que espelhe perfeitamente o sistema imunológico humano, e cada modelo tem pontos fortes e fracos. Este artigo tem como objetivo descrever um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes usando blastos leucêmicos de pacientes com leucemia linfoblástica aguda como estratégia para avaliar toxicidades associadas à CART19, RSC e NI. Demonstrou-se que esse modelo recapitula as toxicidades associadas à CART19, bem como a eficácia terapêutica observada na clínica.

Introdução

A terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CART) revolucionou o campo da imunoterapia contra o câncer. Provou ser bem-sucedida no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) recidivante/refratária, linfoma de grandes células B, linfoma de células do manto, linfoma folicular e mieloma múltiplo1,2,3,4,5,6,7^, levando a recentes aprovações do FDA. Apesar do sucesso inicial nos ensaios clínicos, o tratamento com terapia celular CART resulta em toxicidades muitas vezes graves e ocasionalmente letais. As toxicidades mais comuns após a terapia celular com CART incluem o desenvolvimento de RN e RN, também conhecida como síndrome de neurotoxicidade associada a células efetoras imunes (ICANS)^8,9. A RSC é causada devido à superativação e expansão maciça das células CART in vivo, levando à secreção subsequente de múltiplas citocinas inflamatórias, incluindo interferon-γ, fator de necrose tumoral-α, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e interleucina-6 (IL-6). Isso resulta em hipotensão, febre alta, síndrome de extravasamento capilar, insuficiência respiratória, falência de múltiplos órgãos e, em alguns casos, morte^10,11. A RSC desenvolve-se em 50-100% dos casos após terapia celular com CART19^11,12,13. A ICANS é outro evento adverso único associado à terapia celular com CART e é caracterizada por edema cerebral generalizado, confusão, obnubilação, afasia, fraqueza motora e, ocasionalmente, convulsões ^9,14. Qualquer grau de ICANS ocorre em até 70% dos pacientes, e os graus 3-4 são relatados em 20-30% dos pacientes 5,10,15,16. Em geral, a SRC e a ICANS são comuns e podem ser fatais.

O manejo da ICANS após a terapia celular com CART é desafiador. A maioria dos pacientes com ICANS também apresenta RSC¹⁷, que muitas vezes pode ser tratada com o antagonista do receptor de IL-6 tocilizumabe ou esteroides¹⁸. Um relato anterior revelou que a intervenção precoce com tocilizumabe diminuiu a taxa de RSC grave, mas não afetou a incidência ou a gravidade da ICANS¹⁹. Atualmente, não há tratamento efetivo ou agente profilático para o ICANS, sendo crucial investigar estratégias^{preventivas 20}.

Acredita-se que as células mieloides e as citocinas/quimiocinas associadas sejam os principais impulsionadores do desenvolvimento da RSC e ICANS²¹. Enquanto a RSC está diretamente relacionada à elevação extrema de citocinas e expansão de células T, a fisiopatologia da ICANS é amplamente desconhecida^22,23. Portanto, é imperativo estabelecer um modelo de camundongo que recapitule essas toxicidades após a terapia celular com CART para estudar os mecanismos e desenvolver estratégias preventivas.

Existem vários modelos animais pré-clínicos atualmente usados para estudar, otimizar e validar a eficácia de células CART, bem como para monitorar suas toxicidades associadas. Estes incluem camundongos singênicos, xenoenxertos, transgênicos imunocompetentes, transgênicos humanizados e xenoenxertos derivados de pacientes, além de modelos de primatas. No entanto, cada um desses modelos apresenta desvantagens, e alguns não refletem as verdadeiras preocupações de eficácia ou segurança das células CART^24,25. Portanto, é imperativo a escolha criteriosa do melhor modelo para os objetivos pretendidos do estudo.

Este artigo procura descrever a metodologia utilizada para avaliar a toxicidade associada às células CART, RNC e NI, utilizando um modelo in vivo de xenoenxerto derivado de ALL (PDX) (Figura 1). Especificamente, nos métodos aqui descritos, as células CART19 geradas em nosso laboratório são utilizadas seguindo protocolos previamente descritos. Resumidamente, as células T humanas são isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores saudáveis por meio de uma técnica de gradiente de densidade, estimuladas com esferas CD3/CD28 no dia 0 e transduzidas lentiviricamente no dia 1 com CARs compostas por um fragmento variável de cadeia única direcionado para CD19 fundido aos domínios de sinalização 4-1BB e CD3ζ. Essas células CART são então expandidas, desfrisadas no 6º dia e criopreservadas no 8º dia 26,27,28,29,30. Como descrito anteriormente, camundongos são submetidos a tratamento linfodepletante, seguido pela administração de blastos leucêmicos derivados do paciente (LLA)²⁸. Primeiro, verifica-se a enxertia tumoral por meio da coleta de sangue submandibular. Após o estabelecimento de uma carga tumoral apropriada, as células CART19 são administradas aos camundongos. Em seguida, os ratos são pesados diariamente para avaliar o bem-estar. A ressonância magnética (RM) de pequenos animais é realizada para avaliar a infecção hospitalar, juntamente com o sangramento da cauda para avaliar a expansão de células T e a produção de citocinas/quimiocinas. As técnicas descritas abaixo são altamente recomendadas para serem usadas como modelo para estudar toxicidades associadas a células CART em um modelo PDX.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Mayo Clinic, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC A00001767) e Comitê Institucional de Biossegurança (IBC, Bios00000006.04).

NOTA: Todos os materiais utilizados para trabalhar com ratos devem ser estéreis.

1. Injeção de bussulfano em camundongos NSG

1. Obter camundongos machos, 8-12 semanas de idade, imunocomprometidos, NOD-SCID IL2rγnull (NSG), e pesá-los antes da injeção.
   NOTA: Para significância estatística, recomenda-se usar pelo menos cinco camundongos por grupo e repetir este experimento pelo menos mais uma vez com camundongos fêmeas.
2. Preparar bussulfano para injeção intraperitoneal (i.p.). Usando uma seringa de insulina de 1 mL, encha lenta e cuidadosamente a seringa com exatamente 30 mg/kg de bussulfano, seguido de injeção i.p nos camundongos, e coloque-os de volta na gaiola.

2. Injeção de TODOS os blastos derivados do paciente (CD19⁺) nos camundongos NSG

NOTA: Este protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Biossegurança da Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).

1. Coletar blastos leucêmicos primários do sangue periférico de pacientes com LLA recidivante e refratária.
2. Preparar células-alvo para injeção intravenosa (IV).
   1. Conte as células-alvo CD19⁺ usando um hemocitômetro e registre o volume final e a concentração das células.
      NOTA: Para determinar a viabilidade celular, é altamente recomendável utilizar o azul de tripano durante a contagem das células.
   2. Pellet as células por centrifugação a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   3. Ressuspender o pellet celular em solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 50 × 10⁶ células/mL em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e colocar no gelo.
   4. Vórtice do dedo o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo as células-alvo até que as células estejam completamente homogeneizadas.
   5. Usando uma seringa de insulina de 1 mL, encha lenta e cuidadosamente a seringa com exatamente 100 μL das células-alvo preparadas e mexa na seringa para remover bolhas.
      NOTA: O volume de 100 μL administrará 5 × 10⁶ células a cada rato.
   6. Coloque os ratos sob luz morna por 5-10 min. Uma vez que a veia da cauda se torne ingurgitada e mais visível a olho nu, coloque os ratos em uma câmara de confinamento/contenção apropriada.
   7. Limpe a cauda do rato com um cotonete com álcool. Injete as células-alvo diretamente na veia da cauda (i.v.) e coloque o camundongo de volta na gaiola. Após a inoculação das células-alvo, monitorar os camundongos diariamente ou conforme recomendado pelo comitê de ética animal local.

3. Avaliação do enxerto tumoral

1. A partir de 6 semanas após a injeção da célula-alvo, avaliar o enxerto tumoral usando citometria de fluxo para medir a expressão de células CD19⁺ no sangue periférico.
2. Dosagem de sangue periférico para avaliação da expansão CD19⁺
   1. Retirar o sangue dos ratinhos 6-8 semanas após a injeção de células CART19.
      NOTA: Vários métodos podem ser usados para retirar sangue. Para esse protocolo, a coleta de sangue submandibular é o método de escolha.
   2. Anestesiar o camundongo com isoflurano em câmara de indução com isoflurano a 5%. Uma vez obtida a anestesia, manter a 1-3% o isoflurano inalado através de um cone nasal.
      NOTA: É altamente recomendável aplicar pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos.
   3. Retire o mouse da câmara e segure o mouse com a mão não dominante, segurando a pele solta sobre o pescoço. Puncione a veia com uma lanceta ligeiramente atrás da mandíbula.
      NOTA: Apenas a ponta da agulha (1-2 mm) é necessária para entrar na veia.
   4. À medida que o sangue estiver pingando, colete pelo menos 50 μL em um tubo revestido com heparina e misture bem invertendo o tubo para cima e para baixo várias vezes. Transfira 30 μL de sangue para um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.
      NOTA: Para o sangue restante, gire o tubo a 17.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. Transfira o soro (camada sobrenadante) para um tubo de microcentrífuga limpo e marcado de 1,5 mL e armazene-o a −80 °C (para uso no ensaio de citocinas).
   5. Adicionar 2 ml de tampão de lise (tampão de lise à base de cloreto de amónio 10x diluído a 1x utilizando água isenta de nucleases) no tubo de fundo redondo de 5 ml que contém o sangue. Misture muito bem agitando o tubo. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 20 minutos para garantir a lise adequada dos glóbulos vermelhos.
   6. Adicionar 2 mL de tampão de fluxo (PBS, 0,2 g/L de cloreto de potássio, 0,2 g/L de fosfato de potássio monobásico, 8 g/L de cloreto de sódio e 1,15 g/L de fosfato dibásico de sódio contendo 2% de soro fetal bovino e 1% de azida sódica).
   7. Centrifugar o tubo a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante e adicionar 2 mL de tampão de fluxo. Repita este passo de lavagem 2x.
   8. Decantar cuidadosamente o conteúdo do tubo. Observe a pequena quantidade de líquido com um pellet remanescente no tubo. Adicione 100 μL de tampão de fluxo e ressuspenda muito bem.
   9. Transfira todo o líquido restante no tubo de fluxo de 5 mL para uma placa de 96 poços. Certifique-se de que cada amostra está devidamente rotulada. Adicionar 100 μL de tampão de fluxo aos poços correspondentes e centrifugar a placa de 96 poços a 650 × g durante 3 min a 4 °C.
3. Avaliar a expansão das células-alvo CD19⁺ por citometria de fluxo (Figura 2).
   1. Preparar uma mistura principal contendo 0,3 μL de coloração viva/morta, 0,13 μg (2,5 μL) de anticorpo anti-humano CD19, 0,06 μg (2,5 μL) de anticorpo anti-humano CD45, 5 μg (2,5 μL) de anti-camundongo CD45 e 42,2 μL de tampão de fluxo para um total de 50 μL por amostra. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 15 minutos.
   2. Lavar com 150 μL de tampão de fluxo seguido de centrifugação a 650 × g durante 3 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 195 μL de tampão de fluxo e 5 μL de esferas de contagem.
   3. Adquira em um citômetro de fluxo para determinar o nível de expressão de células CD19⁺ . Para fins de gating e análise, primeiro gate a população de interesse (CD19⁺) com base nas características de dispersão frontal versus lateral, seguido por uma única população de gating e, em seguida, células vivas. Uma vez que as células vivas são gated, avaliar a população CD45 humana versus CD45 de camundongo, e da população humana, porta a população-alvo CD19⁺ .
4. Quantificar para determinar a quantidade presente em 70 μL, e então expressar em células/μL usando a equação (1):
   Contagem absoluta de células CD19+ = ([células CD19⁺/contas de contagem] × número de contas de contagem dentro de 5 μL)/70
   NOTA: Repetir o ensaio de sangue periférico a cada 5 dias para avaliar a expansão celular CD19⁺ . Coletar no máximo 200 μL de sangue cumulativamente a cada 2 semanas, de acordo com as diretrizes do comitê local de ética animal. Uma vez que os camundongos tenham atingido uma carga de doença de ≥10 células/μL, randomize para células CART19 ou grupos de controle (seção 4).

4. Administração de células CART19 in vivo

1. Preparação das células CART19 (~Dia 80):
   NOTA: A geração de células CART19 já foi previamente publicada 27,30,31. Este procedimento deve ser realizado dentro de um Gabinete de Biossegurança Nível 2+ utilizando técnica asséptica e equipamentos de proteção individual.
   1. Descongelar as células CART19 num recipiente de banho-maria (37 °C). Em seguida, lave as células em meio de células T morno (MTC) para remover o dimetil sulfóxido.
      NOTA: A MTC é composta por 10% de soro AB humano (v/v), penicilina-estreptomicina-glutamina a 1% (v/v) e meio celular hematopoiético livre de soro^27,30.
   2. Centrifugar as células CART19 a 300 × g por 8 min a 4 °C e ressuspender em MTC quente até uma concentração final de 2 × 10⁶ células/mL. Deixe as células CART descansarem em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂) durante a noite, mas por não mais de 16 h.
2. Administração de células CART19 por injeção i.v. (Dia ~80)
   1. Conte as células CART19 e gire para baixo a 300 × g durante 8 minutos a 4 °C.
   2. Ressuspender as células CART19 com 10 mL de PBS e girar para baixo a 300 × g por 8 min a 4 °C.
   3. Ressuspender as células CART19 para uma concentração final de 40 × 10⁶ células/mL com PBS, transferir as células para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL e colocá-las no gelo.
   4. Realizar injeções na veia da cauda celular CART19 (conforme detalhado acima) injetando 100 μL de células ressuspensas i.v.
      NOTA: Um volume de 100 μL administrará 4 × 10⁶ células a cada rato. Incluir um grupo de camundongos não tratados como controle negativo.

5. Avaliação das toxicidades associadas às células CART19

1. Após a administração de células CART19, monitore os camundongos 2x por dia para avaliar quaisquer alterações em seu bem-estar, como fraqueza motora, corpo curvado e perda de peso corporal.
   NOTA: Todas essas alterações físicas correlacionam-se com os sintomas da RSC neste modelo²⁸.
2. Uma vez que os camundongos começam a desenvolver fraqueza motora e redução de peso (redução de 10-20% em relação à linha de base), colete sangue periférico para analisar a carga tumoral e realizar isolamento sérico para citocinas, de acordo com a metodologia descrita na seção 3 (Figura 3).
3. Armazenar os tubos de microcentrífuga de soro a −80 °C e usar os soros para analisar as quimiocinas e citocinas usando um ensaio Multiplex (Figura 4).
   NOTA: Se os ratos apresentarem sinais de paralisia dos membros posteriores, parecerem moribundos ou letárgicos, e a perda de peso for > de 20% do seu peso corporal até ao ponto de limitar a sua capacidade de alcançar comida e/ou água, então serão sujeitos à eutanásia.

6. Ressonância magnética

OBS: Um aparelho de RM pré-clínico (para pequenos animais) com ímã de furo vertical foi utilizado para ressonância magnética in vivo e aquisição de imagens^32,33.

1. Misture 120 μL de Gadolínio + 880 μL de solução salina e carregue em uma seringa de insulina de 1 mL. Injectar 100 μL em cada rato (i.p.).
   NOTA: O gadolínio deve ser injetado 15-20 minutos antes do início do experimento.
2. Anestesiar camundongos com isoflurano (2-3%) em câmara de indução por 10-15 min.
   NOTA: É altamente recomendável aplicar pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos.
3. Coloque a coluna do mouse na sonda de berço compatível com roedores. Em seguida, prossiga para posicionar o mouse prendendo os dentes na barra de mordida.
4. Puxe a cabeça do mouse na bobina de volume de 25 mm e ajuste o cone nasal preso ao sistema de anestesia com isoflurano. Aperte o botão da barra de mordida para manter a posição durante a varredura.
   NOTA: Se estiver a realizar uma ressonância magnética com contraste, certifique-se de que o gadolínio (neste caso) ou o agente de contraste é injetado pelo menos 10 minutos antes de colocar o aparelho no íman de furo. Durante todo o tempo de exame, os camundongos serão anestesiados pela inalação de isoflurano a 2-3% em ar através do cone nasal, e sua frequência respiratória será monitorada simultaneamente.
5. Para avaliação da respiração, use um dispositivo de monitoramento respiratório/respiratório.
   OBS: É importante avaliar também a temperatura corporal para prevenir possíveis hipotermias devido à exposição prolongada à anestesia. Recomenda-se o uso de almofadas térmicas para controlar a temperatura corporal.
   1. Conecte a sonda do monitor respiratório perto do diafragma e fixe-a com fita cirúrgica. Mantenha a taxa de respiração entre 20-60 respirações por minuto para que a condição do rato seja estável.
      NOTA: Esta taxa fornece imagens de ressonância magnética mais estáveis e evita artefatos de movimento na imagem adquirida. Se a frequência respiratória for maior do que a faixa de 20-60 respirações por minuto, aumente a concentração de isoflurano. Se a frequência respiratória for inferior a 20 respirações por minuto, a anestesia é muito profunda; portanto, a concentração precisa ser diminuída.
6. Insira a sonda animal no pequeno furo dentro do sistema de ressonância magnética de pequenos animais de furo vertical. Ajuste a cabeça do animal no centro da bobina. Fixe o aparelho com a trava para que ele fique em pé e conecte o instrumento ao computador.
7. Abra e use o software (por exemplo, Paravision) para configurar as posições de varredura e os tipos de varreduras. Determinar as posições axiais e sagitais ideais, mantendo-as consistentes para todos os grupos experimentais.
   NOTA: Recomenda-se usar a aquisição de um exame de varredura como referência antes dos exames de ressonância magnética de corpo inteiro.
8. Proceder com a coleta dos dados da RM (conforme descrito anteriormente^32,34,35,36). Obtenha imagens de RM ponderadas em T1 e T2 usando a configuração sugerida mencionada abaixo.
   1. Para as imagens ponderadas em T1 na RM, utilizar a sequência multislice multieco ponderada em T1 (MSME) com tempo de repetição (TR) de 300 ms, tempo de eco (TE) de 9,5 ms, campo de visão (FOV) de 4 cm x 2 cm x 2 cm e matriz de 192 x 96 x 96 cm.
   2. Para as imagens ponderadas em T2 foram utilizadas uma sequência Multislice Multiecho (MSME) com TR de 300 ms, TE de 9,5 ms, FOV de 4 cm x 2 cm x 2 cm e matriz de 192 x 96 x 96.
9. Quando as varreduras estiverem concluídas, remova a sonda do furo. Extraia suavemente o rato, removendo os dentes da barra de mordida. Monitorar o animal em uma gaiola separada até que ele esteja totalmente consciente e tenha recuperado a função motora adequada.
10. Após a extração dos dados do software, utilizar software de análise para quantificação e renderização do volume 3D (Figura 4) das regiões de hiperintensidade.
    NOTA: Se possível, é altamente recomendável ter dois observadores cegos separados para a análise dos dados.

Resultados

O objetivo deste protocolo é avaliar a toxicidade associada às células CART usando um modelo PDX de células tumorais de pacientes com LLA (Figura 1). Primeiro, camundongos NSG receberam injeções i.p. de bussulfano (30 mg/kg) com o objetivo de imunossuprimi-los e facilitar o enxerto de células CART²⁸. No dia seguinte, receberam ~5 × 10⁶ PBMCs (i.v.) derivados de TODOS os pacientes. Os camundongos foram monitorados para enxerto por ~13 semanas atr...

Discussão

Neste relatório, uma metodologia para avaliar a toxicidade associada a células CART usando um modelo ALL PDX foi descrita. Mais especificamente, este modelo procura mimetizar duas toxicidades potencialmente fatais, RSC e NI, que os pacientes frequentemente experimentam após a infusão de células CART. Ela recapitula muitas características das toxicidades da CART observadas na clínica: perda de peso, disfunção motora, neuroinflamação, produção de citocinas inflamatórias e quimiocinas e infiltração de difere...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q