Evaluación de los efectos tóxicos asociados a las células T del receptor de antígeno quimérico mediante un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de pacientes con leucemia linfoblástica aguda

Resumen

Aquí, describimos un protocolo en el que se utiliza un modelo de xenoinjerto derivado de pacientes con leucemia linfoblástica aguda como estrategia para evaluar y monitorear las toxicidades asociadas a las células T del receptor de antígeno quimérico dirigido a CD19.

Resumen

La terapia con células del receptor de antígeno quimérico T (CART) se ha convertido en una herramienta poderosa para el tratamiento de múltiples tipos de neoplasias malignas CD19⁺ , lo que ha llevado a la reciente aprobación por parte de la FDA de varias terapias celulares CART dirigidas a CD19 (CART19). Sin embargo, la terapia con células CART se asocia con un conjunto único de toxicidades que conllevan su propia morbilidad y mortalidad. Esto incluye el síndrome de liberación de citocinas (CRS, por sus siglas en inglés) y la neuroinflamación (NI, por sus siglas en inglés). El uso de modelos preclínicos de ratón ha sido crucial en la investigación y el desarrollo de la tecnología CART para evaluar tanto la eficacia como la toxicidad de CART. Los modelos preclínicos disponibles para probar esta inmunoterapia celular adoptiva incluyen modelos singénicos, xenoinjertos, transgénicos y de ratón humanizado. No existe un modelo único que refleje a la perfección el sistema inmunológico humano, y cada modelo tiene fortalezas y debilidades. El objetivo de este artículo es describir un modelo de xenoinjerto derivado de pacientes que utiliza blastocitos leucémicos de pacientes con leucemia linfoblástica aguda como estrategia para evaluar las toxicidades asociadas a CART19, CRS y NI. Se ha demostrado que este modelo recapitula las toxicidades asociadas a CART19, así como la eficacia terapéutica observada en la clínica.

Introducción

La terapia celular con receptor de antígeno quimérico T (CART) ha revolucionado el campo de la inmunoterapia contra el cáncer. Ha demostrado ser exitoso en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (LLA) recidivante/refractaria, el linfoma de células B grandes, el linfoma de células del manto, el linfoma folicular y el mieloma múltiple 1,2,3,4,5,6,7^, lo que ha llevado a las recientes aprobaciones de la FDA. A pesar del éxito inicial en los ensayos clínicos, el tratamiento con terapia celular CART produce toxicidades que a menudo son graves y, en ocasiones, letales. Las toxicidades más comunes después de la terapia con células CART incluyen el desarrollo de CRS y NI, también conocido como síndrome de neurotoxicidad asociado a células efectoras inmunitarias (ICANS)^8,9. El CRS se debe a la sobreactivación y expansión masiva de las células CART in vivo, lo que conduce a la posterior secreción de múltiples citocinas inflamatorias, incluyendo interferón-γ, factor de necrosis tumoral-α, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) e interleucina-6 (IL-6). Esto resulta en hipotensión, fiebres altas, síndrome de fuga capilar, insuficiencia respiratoria, falla multiorgánica y, en algunos casos, la muerte^10,11. El SRC se desarrolla en el 50-100% de los casos después de la terapia celular CART19^11,12,13. El ICANS es otro evento adverso único asociado a la terapia con células CART y se caracteriza por edema cerebral generalizado, confusión, obnubilación, afasia, debilidad motora y, ocasionalmente, convulsiones ^9,14. Cualquier grado de ICANS ocurre en hasta el 70% de los pacientes, y los grados 3-4 se reportan en el 20-30% de los pacientes 5,10,15,16. En general, el SRI y el ICANS son comunes y pueden ser fatales.

El manejo de ICANS después de la terapia con células CART es un desafío. La mayoría de los pacientes con ICANS también experimentan CRS¹⁷, que a menudo se puede tratar con el antagonista del receptor de IL-6 tocilizumab o esteroides¹⁸. Un informe previo reveló que la intervención temprana con tocilizumab disminuyó la tasa de SRC grave, pero no afectó la incidencia ni la gravedad de la ICANS¹⁹. En la actualidad, no existe un tratamiento eficaz ni un agente profiláctico para el ICANS, por lo que es crucial investigar estrategias preventivas²⁰.

Se cree que las células mieloides y las citoquinas/quimiocinas asociadas son los principales impulsores del desarrollo del SRC y de la ICANS²¹. Mientras que el SRC está directamente relacionado con la elevación extrema de las citocinas y la expansión de las células T, la fisiopatología de las ICANS es en gran parte desconocida^22,23. Por lo tanto, es imperativo establecer un modelo de ratón que recapitule estas toxicidades después de la terapia con células CART para estudiar los mecanismos y desarrollar estrategias preventivas.

En la actualidad existen múltiples modelos animales preclínicos que se utilizan para estudiar, optimizar y validar la eficacia de las células CART, así como para monitorizar sus toxicidades asociadas. Estos incluyen ratones singénicos, xenoinjertos, transgénicos inmunocompetentes, transgénicos humanizados y xenoinjertos derivados de pacientes, además de modelos de primates. Sin embargo, cada uno de estos modelos tiene inconvenientes, y algunos no reflejan la verdadera eficacia o seguridad de las células CART^24,25. Por lo tanto, es imperativo elegir cuidadosamente el mejor modelo para los objetivos previstos del estudio.

El objetivo de este artículo es describir la metodología que se utiliza para evaluar las toxicidades asociadas a las células CART, CRS y NI, utilizando un modelo in vivo de xenoinjerto derivado de pacientes (PDX) de LLA (Figura 1). En concreto, en los métodos aquí descritos, se utilizan células CART19 generadas en el laboratorio de los autores siguiendo los protocolos descritos anteriormente. En resumen, las células T humanas se aíslan de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos mediante una técnica de gradiente de densidad, se estimulan con perlas CD3/CD28 en el día 0 y se transducen lentiviralmente en el día 1 con CAR compuestas por un fragmento variable de cadena única dirigido a CD19 fusionado con los dominios de señalización 4-1BB y CD3ζ. A continuación, estas células CART se expanden, se desgranan el día 6 y se criopreservan el día 8 26,27,28,29,30. Como se ha descrito anteriormente, los ratones se someten a un tratamiento de agotamiento linfológico, seguido de la administración de blastocitos leucémicos (LLA) derivados del ^paciente28. En primer lugar, el injerto tumoral se verifica mediante la extracción de sangre submandibular. Tras el establecimiento de una carga tumoral adecuada, se administran células CART19 a los ratones. Luego, los ratones se pesan diariamente para evaluar su bienestar. Se realiza una resonancia magnética nuclear (RMN) de animales pequeños para evaluar la NI, junto con el sangrado de la cola para evaluar la expansión de las células T y la producción de citocinas/quimiocinas. Se recomienda encarecidamente el uso de las técnicas que se describen a continuación como modelo para estudiar las toxicidades asociadas a las células CART en un modelo PDX.

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas de la Junta de Revisión Institucional (IRB, por sus siglas en inglés), el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC A00001767, por sus siglas en inglés) y el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC, Bios00000006.04) de Mayo Clinic.

NOTA: Todos los materiales utilizados para trabajar con ratones deben ser estériles.

1. Inyección de busulfano a ratones NSG

1. Obtener ratones machos, de 8 a 12 semanas de edad, inmunocomprometidos, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) y pesarlos antes de la inyección.
   NOTA: Para obtener significación estadística, se recomienda utilizar al menos cinco ratones por grupo y repetir este experimento al menos una vez más con ratones hembra.
2. Prepare el busulfano para la inyección intraperitoneal (I.P.). Usando una jeringa de insulina de 1 ml, llene lenta y cuidadosamente la jeringa con exactamente 30 mg/kg de busulfán, seguido de una inyección i.p a los ratones, y colóquelos nuevamente en la jaula.

2. Inyección de TODOS los blastocitos derivados del paciente (CD19⁺) a los ratones NSG

NOTA: Este protocolo sigue las pautas del Comité Institucional de Bioseguridad de Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).

1. Recolectar blastocitos leucémicos primarios de la sangre periférica de pacientes con LLA recidivante y resistente al tratamiento.
2. Preparar las células diana para la inyección intravenosa (i.v.).
   1. Cuente las células diana CD19⁺ con un hemocitómetro y registre el volumen y la concentración finales de células.
      NOTA: Para determinar la viabilidad celular, se recomienda encarecidamente utilizar azul de tripano mientras se cuentan las células.
   2. Granular las células por centrifugación a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   3. Vuelva a suspender el gránulo celular en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración final de 50 × 10⁶ células/ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y colóquelo en hielo.
   4. Vórtice de dedo el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene las células diana hasta que las células estén completamente homogeneizadas.
   5. Con una jeringa de insulina de 1 ml, llene lenta y cuidadosamente la jeringa con exactamente 100 μl de las células diana preparadas y agite la jeringa para eliminar las burbujas.
      NOTA: El volumen de 100 μL administrará 5 × 10⁶ células a cada ratón.
   6. Coloque a los ratones bajo una luz cálida durante 5-10 minutos. Una vez que la vena de la cola se hinche y sea más visible a simple vista, coloque a los ratones en una cámara de confinamiento/restricción adecuada.
   7. Limpie la cola del ratón con un hisopo con alcohol. Inyecte las células diana directamente en la vena de la cola (i.v.) y vuelva a colocar al ratón en la jaula. Después de la inoculación de las células diana, controle a los ratones diariamente o según lo recomendado por el comité local de ética animal.

3. Evaluación del injerto tumoral

1. A partir de las 6 semanas después de la inyección de células diana, se evalúa el injerto tumoral mediante citometría de flujo para medir la expresión de células CD19⁺ en la sangre periférica.
2. Ensayo de sangre periférica para evaluar la expansión de CD19⁺
   1. Extraiga sangre de los ratones 6-8 semanas después de la inyección de células CART19.
      NOTA: Se pueden utilizar varios métodos para extraer sangre. Para este protocolo, la extracción de sangre submandibular es el método preferido de elección.
   2. Anestesiar al ratón con isoflurano en una cámara de inducción con isoflurano al 5%. Una vez que se logra la anestesia, mantener al 1-3% el isoflurano inhalado a través de un cono nasal.
      NOTA: Se recomienda encarecidamente aplicar ungüento oftálmico para prevenir la sequedad ocular.
   3. Retire el ratón de la cámara y sujételo con la mano no dominante agarrando la piel suelta sobre el cuello. Perfore la vena con una lanceta ligeramente detrás de la mandíbula.
      NOTA: Solo se requiere la punta de la aguja (1-2 mm) para ingresar a la vena.
   4. A medida que la sangre gotea, recoja al menos 50 μL en un tubo recubierto de heparina y mezcle bien invirtiendo el tubo hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera 30 μL de sangre a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL.
      NOTA: Para la sangre restante, centrifugar por el tubo a 17.000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el suero (capa sobrenadante) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio y etiquetado, y guárdelo a -80 °C (para su uso en el ensayo de citocinas).
   5. Agregue 2 ml de tampón de lisis (10 veces tampón de lisado a base de cloruro de amonio diluido a 1 veces con agua sin nucleasas) en el tubo inferior redondo de 5 ml que contiene la sangre. Mezclar muy bien mediante el vórtice del tubo. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos para asegurar una lisis adecuada de los glóbulos rojos.
   6. Añadir 2 mL de tampón de flujo (PBS, 0,2 g/L de cloruro de potasio, 0,2 g/L de fosfato de potasio monobásico, 8 g/L de cloruro de sodio y 1,15 g/L de fosfato de sodio dibásico que contiene 2% de suero fetal bovino y 1% de azida sódica).
   7. Centrifugar el tubo a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y añadir 2 mL de tampón de flujo. Repita este paso de lavado 2 veces.
   8. Decantar cuidadosamente el contenido del tubo. Observe la pequeña cantidad de líquido con un gránulo que queda en el tubo. Añadir 100 μL de tampón de flujo, y resuspender muy bien.
   9. Transfiera todo el líquido restante en el tubo de flujo de 5 ml a una placa de 96 pocillos. Asegúrese de que cada muestra esté correctamente etiquetada. Añadir 100 μL de tampón de flujo a los pocillos correspondientes y centrifugar la placa de 96 pocillos a 650 × g durante 3 min a 4 °C.
3. Evaluar la expansión de las células diana CD19⁺ mediante citometría de flujo (Figura 2).
   1. Prepare una mezcla maestra que contenga 0,3 μl de tinción viva/muerta, 0,13 μg (2,5 μl) de anticuerpo anti-CD19 humano, 0,06 μg (2,5 μl) de anticuerpo anti-CD45 humano, 5 μg (2,5 μl) de anti-CD45 de ratón y 42,2 μl de tampón de flujo para un total de 50 μl por muestra. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min.
   2. Lavar con 150 μL de tampón de flujo seguido de centrifugación a 650 × g durante 3 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en 195 μL de tampón de flujo y 5 μL de perlas de conteo.
   3. Adquirirlo en un citómetro de flujo para determinar el nivel de expresión de células CD19⁺ . Para fines de compuerta y análisis, primero se compuerta la población de interés (CD19⁺) en función de las características de dispersión frontal frente a lateral, seguida de una sola población de compuerta y, a continuación, células vivas. Una vez que las células vivas están controladas, se evalúa la población humana de CD45 frente a la de ratón CD45 y, a partir de la población humana, se puede controlar la población diana de CD19⁺ .
4. Cuantificar para determinar la cantidad presente en 70 μL, y luego expresar en células/μL usando la ecuación (1):
   Recuento absoluto de células CD19+ = ([células CD19⁺/perlas de recuento] × número de perlas de recuento dentro de 5 μL)/70
   NOTA: Repita el ensayo de sangre periférica cada 5 días para evaluar la expansión de las células CD19⁺ . No recolectar más de 200 μl de sangre acumulativamente cada 2 semanas de acuerdo con las pautas del comité local de ética animal. Una vez que los ratones hayan alcanzado una carga de enfermedad de ≥10 células/μl, aleatorizarlos a grupos de células CART19 o de control (sección 4).

4. Administración de células CART19 in vivo

1. Preparación de las células CART19 (~Día 80):
   NOTA: La generación de células CART19 ha sido publicada previamente 27,30,31. Este procedimiento debe realizarse dentro de un Gabinete de Bioseguridad Nivel 2+ utilizando técnica aséptica y equipo de protección individual.
   1. Descongele las celdas CART19 en un recipiente al baño maría (37 °C). Luego, lave las células en medio tibio de células T (MTC) para eliminar el dimetilsulfóxido.
      NOTA: La MTC está compuesta por un 10% de suero AB humano (v/v), un 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina (v/v) y medio de células hematopoyéticas libre de suero^27,30.
   2. Centrifugar las células CART19 a 300 × g durante 8 min a 4 °C y volver a suspender en MTC tibia hasta una concentración final de 2 × 10⁶ células/mL. Deje reposar las células CART en una incubadora (37 °C, 5% de_CO2) durante la noche, pero no más de 16 h.
2. Administración de células CART19 mediante inyección intravenosa (Día ~80)
   1. Cuente las celdas CART19 y centrifugue a 300 × g durante 8 minutos a 4 °C.
   2. Vuelva a suspender las células CART19 con 10 ml de PBS y centrifugar a 300 × g durante 8 min a 4 °C.
   3. Vuelva a suspender las células CART19 a una concentración final de 40 × 10⁶ células/ml con PBS, transfiera las células a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y colóquelas en hielo.
   4. Realice inyecciones en la vena de cola de la célula CART19 (como se detalló anteriormente) inyectando 100 μL de células resuspendidas por vía intravenosa.
      NOTA: Un volumen de 100 μL administrará 4 × 10⁶ células a cada ratón. Incluya un grupo de ratones no tratados como control negativo.

5. Evaluación de las toxicidades asociadas a las células CART19

1. Después de la administración de células CART19, monitoree a los ratones 2 veces al día para evaluar cualquier cambio en su bienestar, como debilidad motora, cuerpo encorvado y pérdida de peso corporal.
   NOTA: Todos estos cambios físicos se correlacionan con los síntomas del SRC en este modelo²⁸.
2. Una vez que los ratones comiencen a desarrollar debilidad motora y reducción de peso (reducción del 10-20% desde el valor basal), recolectar sangre periférica para analizar la carga tumoral y realizar el aislamiento sérico de citocinas según la metodología descrita en la sección 3 (Figura 3).
3. Almacene los tubos de microcentrífuga sérica a -80 °C y utilice los sueros para analizar las quimiocinas y citocinas mediante un ensayo Multiplex (Figura 4).
   NOTA: Si los ratones muestran signos de parálisis de las extremidades traseras, parecen moribundos o letárgicos, y la pérdida de peso es > del 20% de su peso corporal hasta el punto de limitar su capacidad para alcanzar la comida y/o el agua, entonces serán sometidos a la eutanasia.

6. Imágenes de resonancia magnética

NOTA: Se utilizó un escáner de resonancia magnética preclínica (para animales pequeños) con un imán de orificio vertical para la resonancia magnética in vivo y la adquisición de imágenes^32,33.

1. Mezcle 120 μL de gadolinio + 880 μL de solución salina y cárguelo en una jeringa de insulina de 1 mL. Inyectar 100 μL en cada ratón (i.p.).
   NOTA: El gadolinio debe inyectarse 15-20 minutos antes del inicio del experimento.
2. Anestesiar al ratón con isoflurano (2-3%) en una cámara de inducción durante 10-15 min.
   NOTA: Es muy recomendable aplicar pomada oftálmica para prevenir la sequedad ocular.
3. Coloque la espina dorsal del ratón en la sonda de cuna compatible con roedores. Luego, proceda a colocar el mouse enganchando sus dientes en la barra de mordida.
4. Tire de la cabeza del ratón hacia la bobina de volumen de 25 mm y ajuste el cono de la nariz atado al sistema de anestesia de isoflurano. Apriete la perilla de la barra de mordida para mantener la posición durante la exploración.
   NOTA: Si realiza una resonancia magnética con contraste, asegúrese de inyectar el gadolinio (en este caso) o el agente de contraste al menos 10 minutos antes de colocar el aparato en el imán del orificio. A lo largo del tiempo de la toma de imágenes, los ratones serán anestesiados mediante la inhalación de isoflurano al 2-3% en el aire a través del cono de la nariz, y su frecuencia respiratoria será monitoreada simultáneamente.
5. Para la evaluación de la respiración, use un dispositivo de monitoreo respiratorio/respiratorio.
   NOTA: Es importante evaluar también la temperatura corporal para prevenir una posible hipotermia debido a la exposición prolongada a la anestesia. Se recomienda utilizar almohadillas térmicas para controlar la temperatura corporal.
   1. Coloque la sonda del monitor de respiración cerca del diafragma y asegúrela con cinta quirúrgica. Mantenga la frecuencia respiratoria entre 20 y 60 respiraciones por minuto para que la condición del ratón sea estable.
      NOTA: Esta velocidad proporciona imágenes de resonancia magnética más estables y evita artefactos de movimiento en la imagen adquirida. Si la frecuencia respiratoria es superior al rango de 20-60 respiraciones por minuto, aumente la concentración de isoflurano. Si la frecuencia respiratoria es inferior a 20 respiraciones por minuto, la anestesia es demasiado profunda; por lo tanto, es necesario disminuir la concentración.
6. Inserte la sonda para animales en el orificio pequeño dentro del sistema de resonancia magnética para animales pequeños de orificio vertical. Ajusta la cabeza del animal en el centro de la bobina. Asegure el aparato con el candado para que pueda mantenerse en posición vertical y conecte el instrumento a la computadora.
7. Abra y utilice el software (por ejemplo, Paravision) para configurar las posiciones de escaneo y los tipos de escaneos. Determinar las posiciones axiales y sagitales óptimas manteniéndolas consistentes para todos los grupos experimentales.
   NOTA: Se recomienda utilizar la adquisición de una exploración de prueba como referencia antes de las resonancias magnéticas completas.
8. Proceda con la recolección de datos de resonancia magnética (como se describió anteriormente^32,34,35,36). Obtenga imágenes de resonancia magnética ponderadas en T1 y T2 utilizando la configuración sugerida que se menciona a continuación.
   1. Para las imágenes de RM ponderadas en T1, utilice una secuencia multieco multicorte (MSME) ponderada en T1 con un tiempo de repetición (TR) de 300 ms, un tiempo de eco (TE) de 9,5 ms, un campo de visión (FOV) de 4 cm x 2 cm x 2 cm y una matriz de 192 x 96 x 96.
   2. Para las imágenes de RM ponderadas en T2, se utilizó una secuencia multieco multicorte (MSME) con un TR de 300 ms, un TE de 9,5 ms, un campo de visión de 4 cm x 2 cm x 2 cm y una matriz de 192 x 96 x 96.
9. Una vez que se completen los escaneos, retire la sonda del orificio. Extrae suavemente el ratón quitando los dientes de la barra de mordida. Vigile al animal en una jaula separada hasta que esté completamente consciente y haya recuperado la función motora adecuada.
10. Después de la extracción de los datos del software, utilice un software de análisis para la cuantificación y el renderizado del volumen 3D (Figura 4) de las regiones de hiperintensidad.
    NOTA: Si es posible, se recomienda encarecidamente tener dos observadores ciegos separados para el análisis de los datos.

Resultados

El objetivo de este protocolo es evaluar las toxicidades asociadas a las células CART utilizando un modelo de ratón PDX a partir de células tumorales de pacientes con LLA (Figura 1). En primer lugar, los ratones NSG recibieron inyecciones i.p. de busulfano (30 mg/kg) con el objetivo de inmunosuprimirlos y facilitar el injerto de células CART²⁸. Al día siguiente, recibieron ~5 × 10⁶ PBMC (i.v.) derivadas de pacientes con LLA. Los ratones fueron monitor...

Discusión

En este informe, se ha descrito una metodología para evaluar las toxicidades asociadas a las células CART utilizando un modelo ALL PDX. Más específicamente, este modelo busca imitar dos toxicidades potencialmente mortales, CRS y NI, que los pacientes a menudo experimentan después de la infusión de células CART. Recapitula muchas características de las toxicidades de CART observadas en la clínica: pérdida de peso, disfunción motora, neuroinflamación, producción inflamatoria de citoquinas y quimiocinas, y la i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q