Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, in dem ein von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie abgeleitetes Xenograft-Modell als Strategie zur Bewertung und Überwachung von CD19-gerichteten chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizitäten verwendet wird.

Zusammenfassung

Die chimäre Antigenrezeptor-T-Zelltherapie (CART) hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Behandlung mehrerer Arten von CD19⁺ -Malignomen entwickelt, was kürzlich zur FDA-Zulassung mehrerer CD19-gerichteter CART-Zelltherapien (CART19) geführt hat. Die CART-Zelltherapie ist jedoch mit einer einzigartigen Reihe von Toxizitäten verbunden, die ihre eigene Morbidität und Mortalität mit sich bringen. Dazu gehören das Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) und die Neuroinflammation (NI). Die Verwendung präklinischer Mausmodelle war für die Forschung und Entwicklung der CART-Technologie von entscheidender Bedeutung, um sowohl die Wirksamkeit von CARTs als auch die Toxizität von CARTs zu bewerten. Zu den verfügbaren präklinischen Modellen zur Erprobung dieser adoptiven zellulären Immuntherapie gehören syngene, xenotransplantierte, transgene und humanisierte Mausmodelle. Es gibt kein einzelnes Modell, das das menschliche Immunsystem nahtlos widerspiegelt, und jedes Modell hat Stärken und Schwächen. Diese Methodenarbeit zielt darauf ab, ein von Patienten abgeleitetes Xenotransplantatmodell zu beschreiben, das leukämische Blasten von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie als Strategie zur Bewertung von CART19-assoziierten Toxizitäten, CRS und NI verwendet. Es hat sich gezeigt, dass dieses Modell sowohl die CART19-assoziierten Toxizitäten als auch die therapeutische Wirksamkeit in der Klinik rekapituliert.

Einleitung

Die chimäre Antigenrezeptor-T-Zelltherapie (CART) hat die Krebsimmuntherapie revolutioniert. Es hat sich als erfolgreich bei der Behandlung von rezidivierter/refraktärer akuter lymphatischer Leukämie (ALL), großzelligem B-Zell-Lymphom, Mantelzell-Lymphom, follikulärem Lymphom und multiplem Myelom 1,2,3,4,5,6,7 erwiesen^, was zu den jüngsten FDA-Zulassungen geführt hat. Trotz der anfänglichen Erfolge in klinischen Studien führt die Behandlung mit der CART-Zelltherapie zu Toxizitäten, die oft schwerwiegend und gelegentlich tödlich sind. Zu den häufigsten Toxizitäten nach CART-Zelltherapie gehört die Entwicklung von CRS und NI, die auch als Immuneffektorzell-assoziiertes Neurotoxizitätssyndrom (ICANS) bezeichnet ^werden8,9. CRS wird durch die Überaktivierung und massive Expansion von CART-Zellen in vivo verursacht, was zur anschließenden Sekretion mehrerer inflammatorischer Zytokine führt, darunter Interferon-γ, Tumornekrosefaktor-α, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin-6 (IL-6). Dies führt zu Hypotonie, hohem Fieber, Kapillarlecksyndrom, Atemversagen, Multiorganversagen und in einigen Fällen zum Tod^10,11. CRS entwickelt sich in 50-100% der Fälle nach CART19-Zelltherapie^11,12,13. ICANS ist ein weiteres einzigartiges unerwünschtes Ereignis im Zusammenhang mit der CART-Zelltherapie und ist gekennzeichnet durch generalisierte Hirnödeme, Verwirrtheit, Benommenheit, Aphasie, motorische Schwäche und gelegentlich Krampfanfälle ^9,14. Jeder Grad von ICANS tritt bei bis zu 70 % der Patienten auf, und die Grade 3-4 werden bei 20-30 % der Patienten berichtet 5,10,15,16. Insgesamt sind CRS und ICANS weit verbreitet und können tödlich sein.

Die Behandlung von ICANS nach einer CART-Zelltherapie ist eine Herausforderung. Bei den meisten Patienten mit ICANS kommt es auch zu CRS¹⁷, das häufig mit dem IL-6-Rezeptorantagonisten Tocilizumab oder Steroiden¹⁸ behandelt werden kann. Ein früherer Bericht zeigte, dass eine frühzeitige Intervention mit Tocilizumab die Rate des schweren CRS verringerte, aber keinen Einfluss auf die Inzidenz oder den Schweregrad von ICANS^{hatte 19}. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung oder Prophylaxe für ICANS, und es ist von entscheidender Bedeutung, Präventionsstrategien zu untersuchen²⁰.

Es wird angenommen, dass myeloische Zellen und assoziierte Zytokine/Chemokine die Haupttreiber für die Entwicklung von CRS und ICANS^{sind 21}. Während CRS in direktem Zusammenhang mit der extremen Erhöhung der Zytokine und der T-Zell-Expansion steht, ist die Pathophysiologie von ICANS weitgehend unbekannt^22,23. Daher ist es zwingend erforderlich, ein Mausmodell zu etablieren, das diese Toxizitäten nach der CART-Zelltherapie rekapituliert, um die Mechanismen zu untersuchen und Präventionsstrategien zu entwickeln.

Derzeit gibt es mehrere präklinische Tiermodelle, die zur Untersuchung, Optimierung und Validierung der Wirksamkeit von CART-Zellen sowie zur Überwachung der damit verbundenen Toxizitäten verwendet werden. Dazu gehören syngene, xenotransplantierte, immunkompetente transgene, humanisierte transgene und patientenabgeleitete Xenotransplantat-Mäuse sowie Primatenmodelle. Jedes dieser Modelle hat jedoch Nachteile, und einige spiegeln nicht die tatsächliche Wirksamkeit oder Sicherheitsbedenken von CART-Zellen wider^24,25. Daher ist es unerlässlich, das beste Modell für die beabsichtigten Ziele der Studie sorgfältig auszuwählen.

In diesem Artikel wird versucht, die Methodik zu beschreiben, die zur Bewertung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten, CRS und NI, unter Verwendung eines ALL-patientenabgeleiteten Xenotransplantats (PDX) in vivo verwendet wird (Abbildung 1). Konkret werden bei den hier beschriebenen Methoden CART19-Zellen verwendet, die im Labor der Autoren nach zuvor beschriebenen Protokollen erzeugt wurden. Kurz gesagt, menschliche T-Zellen werden mit Hilfe einer Dichtegradiententechnik aus gesunden mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) des Spenders isoliert, an Tag 0 mit CD3/CD28-Kügelchen stimuliert und an Tag 1 mit CARs lentiviral transduziert, die aus einem CD19-gerichteten einkettigen variablen Fragment bestehen, das mit 4-1BB- und CD3ζ-Signaldomänen fusioniert ist. Diese CART-Zellen werden dann expandiert, am Tag 6 entkläutet und am Tag 8 kryokonserviert 26,27,28,29,30. Wie bereits erwähnt, werden die Mäuse einer lymphodepletierenden Behandlung unterzogen, gefolgt von der Verabreichung von patienteneigenen leukämischen Blasten (ALL)²⁸. Zunächst wird die Tumortransplantation durch submandibuläre Blutentnahme überprüft. Nach Etablierung einer entsprechenden Tumorlast werden den Mäusen CART19-Zellen verabreicht. Dann werden die Mäuse täglich gewogen, um das Wohlbefinden zu beurteilen. Die Kleintier-Magnetresonanztomographie (MRT) wird durchgeführt, um die NI zu beurteilen, zusammen mit Schwanzblutungen, um die T-Zell-Expansion und die Zytokin-/Chemokinproduktion zu beurteilen. Die unten beschriebenen Techniken werden dringend empfohlen, um als Modell zur Untersuchung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten in einem PDX-Modell verwendet zu werden.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB), des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) und des Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04) der Mayo Clinic.

HINWEIS: Alle Materialien, die für die Arbeit mit Mäusen verwendet werden, müssen steril sein.

1. Injektion von Busulfan an NSG-Mäuse

1. Besorgen Sie sich männliche, 8-12 Wochen alte, immungeschwächte NOD-SCID IL2rγnull (NSG) Mäuse und wiegen Sie sie vor der Injektion.
   HINWEIS: Für statistische Signifikanz wird empfohlen, mindestens fünf Mäuse pro Gruppe zu verwenden und dieses Experiment mindestens einmal mit weiblichen Mäusen zu wiederholen.
2. Bereiten Sie Busulfan für die intraperitoneale (i.p.) Injektion vor. Füllen Sie die Spritze mit einer 1-ml-Insulinspritze langsam und vorsichtig mit genau 30 mg/kg Busulfan, gefolgt von einer i.p.-Injektion an die Mäuse, und setzen Sie sie zurück in den Käfig.

2. Injektion von ALLEN patienteneigenen Blasten (CD19⁺) in die NSG-Mäuse

HINWEIS: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04) der Mayo Clinic.

1. Entnahme von primären leukämischen Blasten aus dem peripheren Blut von Patienten mit rezidivierter und refraktärer ALL.
2. Bereiten Sie die Zielzellen für die intravenöse (i.v.) Injektion vor.
   1. Zählen Sie CD19⁺ -Zielzellen mit einem Hämozytometer und zeichnen Sie das endgültige Volumen und die Konzentration der Zellen auf.
      HINWEIS: Um die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen, wird dringend empfohlen, Trypanblau beim Zählen der Zellen zu verwenden.
   2. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 °C pelletiert.
   3. Das Zellpellet wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 50 × 10⁶ Zellen/ml in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen resuspendiert und auf Eis gelegt.
   4. Das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit den Zielzellen mit dem Finger vortexen, bis die Zellen vollständig homogenisiert sind.
   5. Füllen Sie die Spritze mit einer 1-ml-Insulinspritze langsam und vorsichtig mit genau 100 μl der vorbereiteten Zielzellen und schnippen Sie die Spritze, um Blasen zu entfernen.
      HINWEIS: Das Volumen von 100 μl reicht für die Verabreichung von 5 × 10⁶ Zellen an jede Maus.
   6. Legen Sie die Mäuse für 5-10 Minuten unter warmes Licht. Sobald die Schwanzvene angeschwollen und mit bloßem Auge besser sichtbar ist, setzen Sie die Mäuse in eine geeignete Einsperr-/Fixierungskammer.
   7. Wischen Sie den Schwanz der Maus mit einem Alkoholtupfer ab. Injizieren Sie die Zielzellen direkt in die Schwanzvene (i.v.) und setzen Sie die Maus zurück in den Käfig. Nach der Inokulation der Zielzellen sind die Mäuse täglich oder wie von der örtlichen Tierethikkommission empfohlen zu überwachen.

3. Beurteilung des Tumortransplantats

1. Beurteilen Sie ab 6 Wochen nach der Injektion der Zielzelle das Tumortransplantat, indem Sie die Expression von CD19⁺ -Zellen im peripheren Blut mittels Durchflusszytometrie messen.
2. Peripherer Bluttest zur Beurteilung der CD19⁺ -Expansion
   1. Entnehmen Sie den Mäusen 6-8 Wochen nach der Injektion der CART19-Zellen Blut.
      HINWEIS: Es gibt verschiedene Methoden, um Blut zu entnehmen. Für dieses Protokoll ist die submandibuläre Blutentnahme die bevorzugte Methode der Wahl.
   2. Die Maus wird mit Isofluran in einer Induktionskammer mit 5% Isofluran anästhesiert. Sobald die Anästhesie erreicht ist, wird das durch einen Nasenkegel eingeatmete Isofluran bei 1-3% gehalten.
      HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, Augensalbe aufzutragen, um Augentrockenheit zu verhindern.
   3. Nehmen Sie die Maus aus der Kammer und halten Sie die Maus mit der nicht-dominanten Hand fest, indem Sie die lose Haut über dem Hals greifen. Punktieren Sie die Vene mit einer Lanzette etwas hinter dem Unterkiefer.
      HINWEIS: Nur die Spitze der Nadel (1-2 mm) ist erforderlich, um in die Vene einzudringen.
   4. Wenn das Blut tropft, sammeln Sie mindestens 50 μl in einem mit Heparin beschichteten Röhrchen und mischen Sie es gut, indem Sie das Röhrchen mehrmals auf und ab drehen. 30 μl Blut in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden überführen.
      HINWEIS: Für das verbleibende Blut das Röhrchen bei 17.000 × g 10 Minuten bei 4 °C nach unten schleudern. Das Serum (überstehende Schicht) wird in ein sauberes und beschriftetes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei −80 °C gelagert (zur Verwendung im Zytokin-Assay).
   5. 2 ml Lysepuffer (10-facher Lysepuffer auf Ammoniumchlorid-Basis, mit nukleasefreiem Wasser auf 1x verdünnt) in das 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden geben, das das Blut enthält. Sehr gut mischen, indem man das Röhrchen verwirbelt. Inkubieren Sie das Röhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, um eine ordnungsgemäße Lyse der roten Blutkörperchen zu gewährleisten.
   6. 2 ml Flusspuffer (PBS, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 0,2 g/l einbasisches Kaliumphosphat, 8 g/l Natriumchlorid und 1,15 g/l dibasisches Natriumphosphat mit 2 % fötalem Rinderserum und 1 % Natriumazid) hinzufügen.
   7. Das Röhrchen wird bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Dekantieren Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml Durchflusspuffer hinzu. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 2x.
   8. Den Inhalt der Tube vorsichtig umfüllen. Beobachten Sie die geringe Menge an Flüssigkeit mit einem Pellet, das im Röhrchen verbleibt. Fügen Sie 100 μl Flusspuffer hinzu und resuspendieren Sie ihn sehr gut.
   9. Die gesamte verbleibende Flüssigkeit im 5-ml-Durchflussrohr wird in eine 96-Well-Platte überführt. Stellen Sie sicher, dass jede Probe ordnungsgemäß beschriftet ist. Geben Sie 100 μl Durchflusspuffer in die entsprechenden Vertiefungen und zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 650 × g für 3 Minuten bei 4 °C.
3. Beurteilung der Expansion der CD19⁺ -Zielzellen mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 2).
   1. Bereiten Sie eine Mastermischung vor, die 0,3 μl Lebend-/Totfärbung, 0,13 μg (2,5 μl) Anti-Human-CD19-Antikörper, 0,06 μg (2,5 μl) Anti-Human-CD45-Antikörper, 5 μg (2,5 μl) Anti-Maus-CD45 und 42,2 μl Flusspuffer für insgesamt 50 μl pro Probe enthält. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.
   2. Mit 150 μl Fließpuffer waschen und anschließend bei 650 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 195 μl Flusspuffer und 5 μl Zählperlen.
   3. Erfassen Sie auf einem Durchflusszytometer, um das Niveau der CD19⁺ -Zellexpression zu bestimmen. Zu Gating- und Analysezwecken wird zuerst die interessierende Population (CD19⁺) basierend auf den Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften gegatet, gefolgt von einer einzelnen Gating-Population und dann lebenden Zellen. Sobald die lebenden Zellen mit Gates versehen sind, beurteilen Sie die CD45-Population des Menschen im Vergleich zur CD45-Population der Maus und gleiten Sie aus der menschlichen Population die CD19⁺ -Zielpopulation aus.
4. Quantifizieren, um die in 70 μl vorhandene Menge zu bestimmen, und dann in Zellen/μl unter Verwendung von Gleichung (1) ausdrücken:
   Absolute CD19+-Zellzahl = ([CD19⁺-Zellen/Zählkügelchen] × Anzahl der Zählkügelchen innerhalb von 5 μl)/70
   HINWEIS: Wiederholen Sie den peripheren Bluttest alle 5 Tage, um die CD19⁺ -Zellexpansion zu beurteilen. Sammeln Sie nicht mehr als 200 μl Blut kumulativ alle 2 Wochen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der örtlichen Tierethikkommission. Sobald die Mäuse eine Krankheitslast von ≥10 Zellen/μl erreicht haben, randomisieren sie sie in CART19-Zell- oder Kontrollgruppen (Abschnitt 4).

4. Verabreichung von CART19-Zellen in vivo

1. Präparation der CART19-Zellen (~Tag 80):
   HINWEIS: Die Generierung von CART19-Zellen wurde zuvor veröffentlicht 27,30,31. Dieses Verfahren muss in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe 2+ mit aseptischer Technik und persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
   1. Die CART19-Zellen in einem Wasserbadbehälter (37 °C) auftauen. Waschen Sie dann die Zellen in warmem T-Zell-Medium (TCM), um das Dimethylsulfoxid zu entfernen.
      HINWEIS: TCM besteht aus 10% humanem AB-Serum (v/v), 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin (v/v) und serumfreiem hämatopoetischem Zellmedium^27,30.
   2. Die CART19-Zellen werden bei 300 × g 8 min bei 4 °C zentrifugiert und in warmer TCM auf eine Endkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Lassen Sie die CART-Zellen über Nacht, jedoch nicht länger als 16 Stunden, in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) ruhen.
2. Verabreichung von CART19-Zellen per i.v. Injektion (Tag ~80)
   1. Zählen Sie die CART19-Zellen und schleudern Sie sie bei 300 × g für 8 Minuten bei 4 °C.
   2. Die CART19-Zellen werden mit 10 ml PBS resuspendiert und bei 300 × g für 8 Minuten bei 4 °C heruntergeschleudert.
   3. Resuspendieren Sie die CART19-Zellen mit PBS auf eine Endkonzentration von 40 × 10⁶ Zellen/ml, überführen Sie die Zellen in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie auf Eis.
   4. Führen Sie CART19-Zellschwanzveneninjektionen (wie oben beschrieben) durch, indem Sie 100 μl resuspendierte Zellen i.v. injizieren.
      HINWEIS: Ein Volumen von 100 μl reicht für die Verabreichung von 4 × 10⁶ Zellen an jede Maus. Schließen Sie eine Gruppe unbehandelter Mäuse als Negativkontrolle ein.

5. Bewertung der zellassoziierten Toxizität von CART19

1. Überwachen Sie die Mäuse nach der Verabreichung von CART19-Zellen 2x täglich, um Veränderungen ihres Wohlbefindens zu beurteilen, wie z. B. motorische Schwäche, gekrümmter Körper und Gewichtsverlust.
   HINWEIS: Alle diese körperlichen Veränderungen korrelieren mit CRS-Symptomen in diesem Modell²⁸.
2. Sobald die Mäuse beginnen, eine motorische Schwäche und eine Gewichtsreduktion zu entwickeln (10-20 % Reduktion gegenüber dem Ausgangswert), wird peripheres Blut entnommen, um die Tumorlast zu analysieren, und eine Serumisolierung auf Zytokine gemäß der in Abschnitt 3 beschriebenen Methodik durchgeführt (Abbildung 3).
3. Lagern Sie die Serum-Mikrozentrifugenröhrchen bei −80 °C und verwenden Sie die Seren, um die Chemokine und Zytokine mit einem Multiplex-Assay zu analysieren (Abbildung 4).
   HINWEIS: Wenn die Mäuse Anzeichen einer Lähmung der Hintergliedmaßen zeigen, moribund oder lethargisch erscheinen und der Gewichtsverlust > 20% ihres Körpergewichts beträgt, bis zu dem Punkt, der ihre Fähigkeit einschränkt, Nahrung und/oder Wasser zu erreichen, dann werden sie der Euthanasie unterzogen.

6. MRT-Bildgebung

ANMERKUNG: Ein präklinischer (für Kleintiere) MRT-Scanner mit einem Magneten mit vertikaler Bohrung wurde für die in vivo Magnetresonanz und Bildaufnahme verwendet^32,33.

1. Mischen Sie 120 μl Gadolinium + 880 μl Kochsalzlösung und geben Sie sie in eine 1-ml-Insulinspritze. Injizieren Sie 100 μl in jede Maus (i.p.).
   HINWEIS: Gadolinium sollte 15-20 Minuten vor Beginn des Experiments injiziert werden.
2. Die Maus wird mit Isofluran (2-3%) in einer Induktionskammer für 10-15 Minuten anästhesiert.
   HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, Augensalbe aufzutragen, um Augentrockenheit zu verhindern.
3. Legen Sie die Mauswirbelsäule auf die Nagetier-kompatible Cradle-Sonde. Positionieren Sie dann die Maus, indem Sie ihre Zähne in die Beißleiste einhaken.
4. Ziehen Sie den Kopf der Maus in die 25-mm-Volumenspule und stellen Sie den Nasenkonus ein, der mit dem Isofluran-Anästhesiesystem verbunden ist. Ziehen Sie den Knopf der Beißleiste fest, um die Position für die Dauer des Scans beizubehalten.
   HINWEIS: Wenn Sie eine kontrastmittelverstärkte MRT-Untersuchung durchführen, stellen Sie sicher, dass das Gadolinium (in diesem Fall) oder das Kontrastmittel mindestens 10 Minuten vor dem Einsetzen des Geräts in den Bohrungsmagneten injiziert wird. Während der gesamten Zeit der Bildgebung werden die Mäuse durch die Inhalation von 2-3% Isofluran in der Luft über den Nasenkonus betäubt und gleichzeitig ihre Atemfrequenz überwacht.
5. Verwenden Sie zur Beurteilung der Atmung ein Atem-/Atemüberwachungsgerät.
   HINWEIS: Es ist wichtig, auch die Körpertemperatur zu bestimmen, um eine mögliche Unterkühlung aufgrund einer längeren Anästhesieexposition zu verhindern. Es wird empfohlen, Wärmekissen zu verwenden, um die Körpertemperatur zu kontrollieren.
   1. Befestigen Sie die Atemmonitorsonde in der Nähe des Zwerchfells und befestigen Sie sie mit chirurgischem Klebeband. Halten Sie die Atemfrequenz zwischen 20 und 60 Atemzügen pro Minute, damit der Zustand der Maus stabil ist.
      HINWEIS: Diese Rate sorgt für stabilere MRT-Bilder und verhindert Bewegungsartefakte im aufgenommenen Bild. Wenn die Atemfrequenz höher als der Bereich von 20-60 Atemzügen pro Minute ist, erhöhen Sie die Konzentration von Isofluran. Wenn die Atemfrequenz weniger als 20 Atemzüge pro Minute beträgt, ist die Anästhesie zu tief; Daher muss die Konzentration verringert werden.
6. Führen Sie die Tiersonde in die kleine Bohrung innerhalb des Kleintier-MRT-Systems mit vertikaler Bohrung ein. Stellen Sie den Kopf des Tieres in der Mitte der Spule ein. Sichern Sie das Gerät mit dem Schloss, damit es aufrecht stehen kann, und schließen Sie das Gerät an den Computer an.
7. Öffnen und verwenden Sie die Software (z. B. Paravision), um die Scanpositionen und Scantypen einzurichten. Bestimmen Sie die optimalen axialen und sagittalen Positionen, während Sie sie für alle Versuchsgruppen konsistent halten.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die Aufnahme eines Probescans als Referenz vor den eigentlichen MRT-Scans in voller Länge zu verwenden.
8. Fahren Sie mit der MRT-Datenerfassung fort (wie zuvor beschrieben^32,34,35,36). Erhalten Sie sowohl T1-gewichtete als auch T2-gewichtete MRT-Bilder mit dem unten empfohlenen Aufbau.
   1. Verwenden Sie für T1-gewichtete MRT-Bilder die T1-gewichtete Multislice-Multiecho-Sequenz (MSME) mit einer Wiederholungszeit (TR) von 300 ms, einer Echozeit (TE) von 9,5 ms, einem Sichtfeld (FOV) von 4 cm x 2 cm x 2 cm und einer Matrix von 192 x 96 x 96.
   2. Für T2-gewichtete MRT-Bilder wurde eine Multislice-Multiecho-Sequenz (MSME) mit einer TR von 300 ms, einer TE von 9,5 ms, einem FOV von 4 cm x 2 cm x 2 cm und einer Matrix von 192 x 96 x 96 verwendet.
9. Sobald die Scans abgeschlossen sind, entfernen Sie die Sonde aus der Bohrung. Entferne die Maus vorsichtig, indem du die Zähne von der Beißstange entfernst. Überwachen Sie das Tier in einem separaten Käfig, bis es wieder bei vollem Bewusstsein ist und eine ausreichende motorische Funktion wiedererlangt hat.
10. Verwenden Sie nach der Extraktion der Daten aus der Software eine Analysesoftware für die Quantifizierung und das 3D-Volumen-Rendering (Abbildung 4) der Hyperintensitätsregionen.
    HINWEIS: Wenn möglich, wird dringend empfohlen, zwei separate verblindete Beobachter für die Datenanalyse zu haben.

Ergebnisse

Das Ziel dieses Protokolls ist es, CART-Zell-assoziierte Toxizitäten anhand eines PDX-Mausmodells aus Tumorzellen von Patienten mit ALL zu bewerten (Abbildung 1). Zunächst erhielten NSG-Mäuse i.p. Injektionen von Busulfan (30 mg/kg) mit dem Ziel, sie immunsupprimieren und die Transplantation von CART-Zellen zu erleichtern²⁸. Am nächsten Tag erhielten sie ~5 × 10⁶ PBMCs (i.v.), die von ALLEN Patienten stammten. Die Mäuse wurden ~13 Wochen lang mit<...

Diskussion

In diesem Bericht wurde eine Methodik zur Bewertung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten unter Verwendung eines ALL-PDX-Modells beschrieben. Genauer gesagt versucht dieses Modell, zwei lebensbedrohliche Toxizitäten, CRS und NI, nachzuahmen, die Patienten häufig nach der Infusion von CART-Zellen erleben. Es rekapituliert viele Kennzeichen von CART-Toxizitäten, die in der Klinik beobachtet wurden: Gewichtsverlust, motorische Dysfunktion, Neuroinflammation, entzündliche Zytokin- und Chemokinproduktion und die Infiltr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q