급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식식 마우스 모델을 이용한 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성 평가

요약

여기에서 우리는 급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식 모델이 CD19 표적 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성을 평가하고 모니터링하기 위한 전략으로 사용되는 프로토콜을 설명합니다.

초록

키메라 항원 수용체 T(CART) 세포 요법은 여러 유형의 CD19⁺ 악성 종양 치료를 위한 강력한 도구로 부상했으며, 이로 인해 최근 여러 CD19 표적 CART(CART19) 세포 요법에 대한 FDA 승인이 이루어졌습니다. 그러나 CART 세포 요법은 자체 이환율 및 사망률을 수반하는 고유한 독성 세트와 관련이 있습니다. 여기에는 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 신경염증(NI)이 포함됩니다. 전임상 마우스 모델의 사용은 CART 효능과 CART 독성을 모두 평가하기 위한 CART 기술의 연구 및 개발에 매우 중요했습니다. 이 입양 세포 면역 요법을 테스트하기 위해 사용 가능한 전임상 모델에는 동계, 이종 이식편, 형질전환 및 인간화 마우스 모델이 포함됩니다. 인간의 면역 체계를 매끄럽게 반영하는 단일 모델은 없으며 각 모델에는 강점과 약점이 있습니다. 이 방법 논문은 CART19 관련 독성, CRS 및 NI를 평가하기 위한 전략으로 급성 림프구성 백혈병 환자의 백혈병 모세포를 사용하여 환자 유래 이종이식 모델을 설명하는 것을 목표로 합니다. 이 모델은 임상에서 볼 수 있는 CART19 관련 독성과 치료 효능을 요약하는 것으로 나타났습니다.

서문

키메라 항원 수용체 T(CART) 세포 요법은 암 면역 요법 분야에 혁명을 일으켰습니다. 재발성/불응성 급성 림프구성 백혈병(ALL), 거대 B 세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종 및 다발성 골수종 1,2,3,4,5,6,7 치료에 성공적인 것으로 입증되어 최근 FDA 승인을 받았습니다. 임상 시험의 초기 성공에도 불구하고 CART 세포 요법으로 치료하면 종종 심각하고 때로는 치명적인 독성이 발생합니다. CART 세포 치료 후 가장 흔한 독성에는 면역 이펙터 세포 관련 신경독성 증후군(ICANS)이라고도 하는 CRS 및 NI의 발생이 포함됩니다^8,9. CRS는 생체 내에서 CART 세포의 과잉 활성화 및 대규모 확장으로 인해 발생하며, 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-α, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨-6(IL-6)을 포함한 여러 염증성 사이토카인의 후속 분비를 유발합니다. 이로 인해 저혈압, 고열, 모세 혈관 누출 증후군, 호흡 부전, 다기관 부전 및 경우에 따라 사망이 발생합니다^10,11. CRS는 CART19 세포 요법 후 사례의 50-100%에서 발생합니다^11,12,13. ICANS는 CART 세포 치료와 관련된 또 다른 독특한 부작용이며 전신 뇌부종, 착란, 폐쇄, 실어증, 운동 약화 및 때때로 발작을 특징으로 합니다 ^9,14. 모든 등급의 ICANS는 환자의 최대 70%에서 발생하며 3-4등급은 환자의 20-30%에서 보고됩니다 5,10,15,16. 전반적으로 CRS와 ICANS는 일반적이며 치명적일 수 있습니다.

CART 세포 치료 후 ICANS의 관리는 어렵습니다. 대부분의 ICANS 환자는 또한 CRS¹⁷을 경험하며, 이는 종종 IL-6 수용체 길항제 토실리주맙 또는 스테로이드¹⁸로 치료할 수 있습니다. 이전 보고서에서는 토실리주맙을 사용한 조기 개입이 중증 CRS의 비율을 감소시켰지만 ICANS의 발생률이나 중증도에는 영향을 미치지 않았다^{고 밝혔습니다 19}. 현재 ICANS에 대한 효과적인 치료법이나 예방약은 없으며, 예방 전략을 조사하는 것이 중요하다²⁰.

골수 세포 및 관련 사이토카인/케모카인은 CRS 및 ICANS²¹ 발달의 주요 동인으로 생각됩니다. CRS는 사이토카인 및 T 세포 확장의 극단적인 상승과 직접적인 관련이 있지만 ICANS의 병태생리학은 거의 알려지지 않았습니다^22,23. 따라서 CART 세포 치료 후 이러한 독성을 요약하는 마우스 모델을 구축하여 메커니즘을 연구하고 예방 전략을 개발하는 것이 필수적입니다.

현재 CART 세포의 효능을 연구, 최적화 및 검증하고 관련 독성을 모니터링하는 데 사용되는 여러 전임상 동물 모델이 있습니다. 여기에는 영장류 모델 외에도 동계, 이종 이식편, 면역 적격 형질 전환, 인간화 형질 전환 및 환자 유래 이종 이식 마우스가 포함됩니다. 그러나, 이들 모델들 각각은 단점을 가지며, 일부는 CART 세포의 진정한 효능 또는 안전성 우려를 반영하지 않는다^24,25. 따라서 연구의 의도 된 목표에 가장 적합한 모델을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다.

이 기사에서는 ALL 환자 유래 이종이식(PDX) 생체 내 모델을 사용하여 CART 세포 관련 독성, CRS 및 NI를 평가하는 데 사용되는 방법론을 설명하고자 합니다(그림 1). 구체적으로, 여기에 기술된 방법에서, 저자의 실험실에서 생성된 CART19 세포는 이전에 기술된 프로토콜에 따라 사용된다. 간단히 말해서, 인간 T 세포는 밀도 구배 기술을 통해 건강한 기증자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리되고, 0일에 CD3/CD28 비드로 자극되고, 4-1BB 및 CD3ζ 신호 전달 도메인에 융합된 CD19 표적 단일 사슬 가변 단편으로 구성된 CAR로 1일째에 렌티바이러스로 형질도입됩니다. 이어서, 이들 CART 세포는 확장되고, 6일째에 비드화되고, 8일째 26,27,28,29,30일에 냉동보존된다. 앞서 설명한 바와 같이, 마우스는 림프구 고갈 치료를 받은 후 환자 유래 백혈병 모세포(ALL)를 투여합니다²⁸. 첫째, 종양 생착은 턱밑 혈액 수집을 통해 확인됩니다. 적절한 종양 부담의 확립 후, CART19 세포를 마우스에 투여한다. 그런 다음 웰빙을 평가하기 위해 매일 생쥐의 체중을 측정합니다. 소동물 자기공명영상(MRI)은 NI를 평가하기 위해 수행되며, T 세포 확장 및 사이토카인/케모카인 생성을 평가하기 위해 꼬리 출혈과 함께 수행됩니다. 아래에 설명된 기술은 PDX 모델에서 CART 세포 관련 독성을 연구하기 위한 모델로 사용하는 것이 좋습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Mayo Clinic의 IRB(Institutional Review Board), IACUC A00001767(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 IBC(Institutional Biosafety Committee)의 지침을 따릅니다.

알림: 마우스와 함께 작업하는 데 사용되는 모든 재료는 멸균 상태여야 합니다.

1. NSG 마우스에 busulfan 주사

1. 8-12주령의 수컷 면역저하 NOD-SCID IL2rγnull(NSG) 마우스를 채취하여 주사 전에 체중을 측정합니다.
   참고: 통계적 유의성을 위해 그룹당 최소 5마리의 마우스를 사용하고 암컷 마우스로 이 실험을 한 번 이상 반복하는 것이 좋습니다.
2. 복강 내 (ip) 주사를 위해 busulfan을 준비하십시오. 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 주사기에 정확히 30mg/kg의 부설판을 천천히 조심스럽게 채운 다음 마우스에 i.p 주사를 하고 케이지에 다시 넣습니다.

2. NSG 마우스에 모든 환자 유래 모세포(CD19⁺) 주입

참고: 이 프로토콜은 Mayo Clinic의 기관 생물 안전 위원회(IBC, Bios00000006.04)의 지침을 따릅니다.

1. 재발성 및 불응성 ALL 환자의 말초 혈액에서 원발성 백혈병 모세포를 수집합니다.
2. 정맥 주사(i.v.) 주입을 위해 표적 세포를 준비합니다.
   1. 혈구계를 사용하여 CD19⁺ 표적 세포를 계수하고 세포의 최종 부피와 농도를 기록합니다.
      참고: 세포 생존율을 결정하려면 세포 수를 세는 동안 트립판 블루를 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 4°C에서 5분 동안 300 × g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다.
   3. 세포 펠릿을 인산염 완충 식염수(PBS)에 50 × 10^{6 cells/} mL의 최종 농도로 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 재현탁하고 얼음 위에 놓습니다.
   4. 표적 세포가 완전히 균질화될 때까지 표적 세포가 들어있는 1.5 mL 미세원심분리 튜브를 손가락으로 vortex합니다.
   5. 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 준비된 표적 세포 정확히 100μL를 주사기에 천천히 조심스럽게 채우고 주사기를 튕겨 기포를 제거합니다.
      참고: 100μL의 부피는 각 마우스에 5개 × 10개⁶ 개의 세포를 투여합니다.
   6. 마우스를 따뜻한 빛 아래에 5-10 분 동안 두십시오. 꼬리 정맥이 충혈되어 육안으로 더 잘 보이게되면 마우스를 적절한 감금 / 구속 챔버에 넣으십시오.
   7. 알코올 면봉으로 마우스의 꼬리를 닦으십시오. 표적 세포를 꼬리 정맥(i.v.)에 직접 주입하고 마우스를 케이지에 다시 넣습니다. 표적 세포를 접종한 후 매일 또는 지역 동물 윤리 위원회에서 권장하는 대로 마우스를 모니터링합니다.

3. 종양 생착 평가

1. 표적 세포 주입 후 6주부터 유세포 분석을 사용하여 말초 혈액에서 CD19⁺ 세포의 발현을 측정하여 종양 생착을 평가합니다.
2. CD19⁺ 확장을 평가하기 위한 말초 혈액 분석
   1. CART19 세포 주입 후 6-8주 후에 마우스에서 혈액을 채취합니다.
      알림: 혈액을 빼기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 턱밑하 혈액 수집이 선호되는 선택 방법입니다.
   2. 5% isoflurane이 있는 유도 챔버에서 isoflurane으로 마우스를 마취합니다. 일단 마취가 달성되면, 코 콘을 통해 흡입 된 1-3 % 이소 플루 란으로 유지하십시오.
      알림: 안구 건조를 방지하기 위해 안과용 연고를 바르는 것이 좋습니다.
   3. 챔버에서 마우스를 꺼내고 목 위의 느슨한 피부를 잡아 주로 사용하지 않는 손으로 마우스를 잡습니다. 하악 약간 뒤에 란셋으로 정맥을 뚫습니다.
      알림: 바늘 끝(1-2mm)만 정맥에 들어가면 됩니다.
   4. 혈액이 뚝뚝 떨어지면서 헤파린 코팅 튜브에 최소 50μL를 모으고 튜브를 여러 번 위아래로 뒤집어 잘 섞습니다. 30μL의 혈액을 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 옮깁니다.
      알림: 남은 혈액의 경우 17,000× g 에서 10°C에서 4분 동안 튜브를 회전시킵니다. 혈청 (상청액층)을 깨끗하고 표지된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, -80°C에서 보관한다 (사이토카인 분석에 사용하기 위해).
   5. 2mL의 용해 완충액(뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 10배로 희석된 1x 염화암모늄 기반 용해 완충액)을 혈액이 들어 있는 5mL 둥근 바닥 튜브에 넣습니다. 튜브를 vortexing하여 잘 섞습니다. 적혈구의 적절한 용해를 보장하기 위해 실온에서 20분 동안 튜브를 배양합니다.
   6. 2mL의 유동 완충액(PBS, 0.2g/L의 염화칼륨, 0.2g/L의 일염기성 인산칼륨, 8g/L의 염화나트륨, 1.15g/L의 2% 소 태아 혈청 및 1% 아지드화나트륨을 포함하는 이염기성 인산나트륨)을 추가합니다.
   7. 튜브를 300 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 디캔팅하고 2mL의 유동 완충액을 추가합니다. 이 세척 단계를 2회 반복합니다.
   8. 튜브의 내용물을 조심스럽게 디캔팅하십시오. 튜브에 펠릿이 남아있는 소량의 유체를 관찰하십시오. 100 μL의 유동 완충액을 첨가하고 아주 잘 재현탁합니다.
   9. 5mL 플로우 튜브에 남아 있는 모든 액체를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 각 샘플에 올바르게 라벨이 붙어 있는지 확인하십시오. 100μL의 유동 완충액을 해당 웰에 첨가하고 96웰 플레이트를 650× g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다.
3. 유세포 분석을 통해 CD19⁺ 표적 세포의 확장을 평가합니다(그림 2).
   1. 0.3 μL의 살아있는/죽은 염색, 0.13 μg(2.5 μL)의 항-인간 CD19 항체, 0.06 μg(2.5 μL)의 항-인간 CD45 항체, 5 μg(2.5 μL)의 항-마우스 CD45 및 42.2 μL의 유동 완충액을 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다.ample 당 총 50 μL. 실온의 어두운 곳에서 15 분 동안 배양하십시오.
   2. 150 μL의 유동 완충액으로 세척한 후 4°C에서 3분 동안 650 × g 에서 원심분리하였다. 상청액을 경사 처리하고, 195 μL의 유동 완충액과 5 μL의 계수 비드에 펠릿을 재현탁시킨다.
   3. CD19⁺ 세포 발현 수준을 결정하기 위해 유세포 분석기에서 획득합니다. 게이팅 및 분석을 위해 먼저 전방 대 측면 산란 특성을 기반으로 관심 모집단(CD19⁺)을 게이트한 다음 단일 게이팅 모집단을 게이트한 다음 살아있는 세포를 게이트합니다. 살아있는 세포가 게이트되면 인간 CD45 대 마우스 CD45 집단을 평가하고 인간 집단에서 CD19⁺ 표적 집단을 게이트합니다.
4. 정량화하여 70μL에 존재하는 양을 결정한 다음 방정식 (1)을 사용하여 세포/μL에서 발현합니다.
   절대 CD19+ 세포 수 = ([CD19⁺ 세포/계수 비드] × 5μL 이내의 계수 비드 수)/70
   참고: CD19⁺ 세포 확장을 평가하기 위해 5일마다 말초 혈액 분석을 반복합니다. 지역 동물 윤리 위원회 지침에 따라 2주마다 누적 200μL 이하의 혈액을 수집합니다. 마우스가 ≥10 cells/μL의 질병 부담에 도달하면 CART19 세포 또는 대조군으로 무작위 배정합니다(섹션 4).

4. CART19 세포의 생체내 투여

1. CART19 세포의 제조(~80일):
   참고: CART19 세포의 생성은 이전에 공개되었다 ^27,30,31. 이 절차는 무균 기술과 개인 보호 장비를 사용하여 Biosafety Cabinet Level 2+ 내부에서 수행해야 합니다.
   1. CART19 세포를 수조 용기(37°C)에서 해동한다. 이어서, 세포를 따뜻한 T 세포 배지(TCM)로 세척하여 디메틸 술폭시드를 제거하였다.
      참고: TCM은 10% 인간 AB 혈청(v/v), 1% 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(v/v) 및 무혈청 조혈 세포 배지^27,30으로 만들어집니다.
   2. CART19 세포를 4°C에서 8분 동안 300× g 에서 원심분리하고, 따뜻한 TCM에서 2 ×^{10 6} cells/mL의 최종 농도로 재현탁합니다. CART 세포를 하룻밤 동안 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에서 16시간 이상 방치하지 마십시오.
2. i.v. 주사를 통한 CART19 세포 투여(~80일)
   1. CART19 세포를 계수하고, 4°C에서 8분 동안 300 × g 에서 스핀 다운시킨다.
   2. CART19 세포를 10mL의 PBS로 재현탁하고, 4°C에서 8분 동안 300× g 에서 스핀다운시킨다.
   3. CART19 세포를 PBS를 사용하여 40 ×^{10 6} cells/mL의 최종 농도로 재현탁하고 세포를 멸균된 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
   4. 100μL의 부유 세포 i.v.를 주입하여 CART19 세포 꼬리 정맥 주사(위에서 자세히 설명됨)를 수행합니다.
      참고: 100μL의 부피는 각 마우스에 4개 × 10개⁶ 개의 세포를 투여합니다. 치료되지 않은 마우스 그룹을 음성 대조군으로 포함시킵니다.

5. CART19 세포 관련 독성 평가

1. CART19 세포 투여 후 하루에 2회 마우스를 모니터링하여 운동 약화, 구부러진 신체 및 체중 감소와 같은 웰빙의 변화를 평가합니다.
   알림: 이러한 모든 신체적 변화는 이 모델²⁸의 CRS 증상과 관련이 있습니다.
2. 마우스가 운동 약화 및 체중 감소(기준선에서 10-20% 감소)를 일으키기 시작하면 말초 혈액을 수집하여 종양 부담을 분석하고 섹션 3에 설명된 방법론에 따라 사이토카인에 대한 혈청 분리를 수행합니다(그림 3).
3. 혈청 미세원심분리기 튜브를 -80°C에서 보관하고 혈청을 사용하여 멀티플렉스 분석을 통해 케모카인과 사이토카인을 분석합니다(그림 4).
   참고: 생쥐가 뒷다리 마비의 징후를 보이고, 빈사 상태이거나 무기력한 것처럼 보이며, 체중 감소가 체중 감소가 체중 > 20%로 음식 및/또는 물에 도달하는 능력을 제한하는 지점까지 있는 경우, 그런 다음 안락사를 받게 됩니다.

6. MRI 영상

참고: 수직 보어 자석이 있는 전임상(작은 동물용) MRI 스캐너를 생체 내 자기 공명 및 이미지 획득에 사용했습니다^32,33.

1. 가돌리늄 120μL + 식염수 880μL를 혼합하고 1mL 인슐린 주사기에 넣습니다. 각 마우스에 100 μL를 주입합니다(i.p.).
   참고: 가돌리늄은 실험 시작 15-20분 전에 주입해야 합니다.
2. 유도 챔버에서 이소플루란(2-3%)을 사용하여 마우스를 10-15분 동안 마취합니다.
   알림: 안구 건조를 방지하기 위해 안과용 연고를 바르는 것이 좋습니다.
3. 마우스 척추를 설치류 호환 크래들 프로브에 놓습니다. 그런 다음 바이트 바에 이빨을 걸어 마우스의 위치를 지정합니다.
4. 마우스 헤드를 25mm 볼륨 코일로 당기고 이소플루란 마취 시스템에 연결된 노즈 콘을 조정합니다. 바이트 바의 손잡이를 조여 스캔하는 동안 위치를 유지합니다.
   알림: 조영 증강 MRI 스캔을 수행하는 경우 장치를 보어 자석에 넣기 최소 10분 전에 가돌리늄(이 경우) 또는 조영제를 주입해야 합니다. 이미징 시간 동안 마우스는 코 콘을 통해 공기 중 2-3% 이소플루란을 흡입하여 마취되고 호흡수를 동시에 모니터링합니다.
5. 호흡 평가를 위해 호흡/호흡 모니터링 장치를 사용하십시오.
   참고: 마취에 장기간 노출되어 발생할 수 있는 저체온증을 예방하기 위해 체온도 평가하는 것이 중요합니다. 체온을 조절하기 위해 열 패드를 사용하는 것이 좋습니다.
   1. 호흡 모니터 프로브를 다이어프램 가까이에 부착하고 수술용 테이프로 고정합니다. 마우스의 상태가 안정적이도록 분당 20-60 회 호흡 속도를 유지하십시오.
      참고: 이 속도는 보다 안정적인 MRI 이미지를 제공하고 획득한 이미지에서 모션 아티팩트를 방지합니다. 호흡수가 분당 20-60 회 호흡 범위보다 높으면 이소 플루 란의 농도를 높이십시오. 호흡 수가 분당 20 회 미만이면 마취가 너무 깊습니다. 따라서 집중력을 낮춰야 합니다.
6. 수직 구멍 작은 동물 MRI 시스템 내의 작은 구멍에 동물 프로브를 삽입합니다. 코일 중앙에서 동물의 머리를 조정하십시오. 장치를 똑바로 세울 수 있도록 잠금 장치로 고정하고 기기를 컴퓨터에 연결합니다.
7. 소프트웨어(예: Paravision)를 열고 사용하여 스캔 위치와 스캔 유형을 설정합니다. 최적의 축 방향 및 시상 위치를 결정하면서 모든 실험 그룹에 대해 일관성을 유지합니다.
   참고: 실제 전장 MRI 스캔 전에 시험 스캔 획득을 참조로 사용하는 것이 좋습니다.
8. MRI 데이터 수집을 진행합니다(앞서 설명한 32,34,35,36). 아래에 언급된 제안된 설정을 사용하여 T1 강조 및 T2 강조 MRI 이미지를 모두 얻습니다.
   1. T1 강조 MRI 영상의 경우 반복 시간(TR)이 300ms, 에코 시간(TE)이 9.5ms, 시야(FOV)가 4cm x 2cm x 2cm, 행렬이 192 x 96 x 96인 T1 강조 MSME(Multislice Multiecho) 시퀀스를 사용합니다.
   2. T2 강조 MRI 영상의 경우 TR이 300ms, TE가 9.5ms, FOV가 4cm x 2cm x 2cm이고 매트릭스가 192 x 96 x 96인 MSME(Multislice Multiecho) 시퀀스를 사용합니다.
9. 스캔이 완료되면 보어에서 프로브를 제거합니다. 바이트 바에서 치아를 제거하여 마우스를 부드럽게 추출합니다. 동물이 완전히 의식을 잃고 적절한 운동 기능을 회복 할 때까지 별도의 케이지에서 동물을 모니터링하십시오.
10. 소프트웨어에서 데이터를 추출한 후 분석 소프트웨어를 사용하여 고강도 영역의 정량화 및 3D 볼륨 렌더링(그림 4)을 수행합니다.
    참고: 가능하면 데이터 분석을 위해 두 명의 별도 맹검 관찰자를 두는 것이 좋습니다.

결과

이 프로토콜의 목적은 ALL 환자의 종양 세포에서 PDX 마우스 모델을 사용하여 CART 세포 관련 독성을 평가하는 것입니다(그림 1). 첫째, NSG 마우스는 i.p. 면역억제 및 CART 세포 생착 촉진을 목표로 부설판(30mg/kg)^{주사 28}. 다음 날, 그들은 모든 환자로부터 파생된 ~5 ×^{10 6} PBMC(i.v.)를 받았습니다. 마우스는 꼬리 출혈 분석을 통해 ~13주 동안 생착에 대해...

토론

이 보고서에서는 ALL PDX 모델을 사용하여 CART 세포 관련 독성을 평가하는 방법론을 설명했습니다. 보다 구체적으로, 이 모델은 환자가 CART 세포 주입 후 종종 경험하는 두 가지 생명을 위협하는 독성인 CRS와 NI를 모방하려고 합니다. 그것은 클리닉에서 관찰된 CART 독성의 많은 특징을 요약합니다: 체중 감소, 운동 기능 장애, 신경염증, 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성, 중추 신경계로의 상이한 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q