زرع تقويم العظام للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في الفئران يلخص سرطان القولون والمستقيم المتقدم

Summary

يصف هذا البروتوكول الزرع التقويمي للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة. يلخص النموذج المرض النقيلي المتقدم لسرطان القولون والمستقيم ويسمح بتقييم الأدوية العلاجية الجديدة في سيناريو ذي صلة سريريا لنقائل الرئة والكبد.

Abstract

على مدى العقد الماضي ، تم إنشاء نماذج أكثر تطورا لسرطان القولون والمستقيم قبل السريري (CRC) باستخدام الخلايا السرطانية المشتقة من المريض والأورام 3D. نظرا لأن عضويات الورم المشتقة من المريض يمكن أن تحتفظ بخصائص الورم الأصلي ، فإن هذه النماذج قبل السريرية الموثوقة تمكن من فحص أدوية السرطان ودراسة آليات مقاومة الأدوية. ومع ذلك ، يرتبط الموت المرتبط ب CRC في المرضى في الغالب بوجود مرض نقيلي. لذلك من الضروري تقييم فعالية العلاجات المضادة للسرطان في النماذج ذات الصلة في الجسم الحي التي تلخص حقا السمات الجزيئية الرئيسية لورم خبيث للسرطان البشري. لقد أنشأنا نموذجا تقويميا يعتمد على حقن الخلايا السرطانية المشتقة من مريض CRC مباشرة في جدار الأعور للفئران. تطور هذه الخلايا السرطانية أوراما أولية في الأعور تنتقل إلى الكبد والرئتين ، والتي يتم ملاحظتها بشكل متكرر في المرضى الذين يعانون من CRC المتقدم. يمكن استخدام نموذج الماوس CRC هذا لتقييم استجابات الأدوية التي تتم مراقبتها بواسطة التصوير المقطعي المحوسب (μCT) ، وهي طريقة تصوير صغيرة النطاق ذات صلة سريريا يمكنها بسهولة تحديد الأورام الأولية أو النقائل في المرضى. هنا ، نصف الإجراء الجراحي والمنهجية المطلوبة لزرع الخلايا السرطانية المشتقة من المريض في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة.

Introduction

سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي الثاني للوفاة بالسرطان في جميع أنحاء العالم¹. إن القدرة على توليد نماذج الورم في المختبر أو في الجسم الحي المشتقة من الخلايا السرطانية الفردية للمريض لديها طب دقيق متقدم في علم الأورام. على مدى العقد الماضي ، تم استخدام المواد العضوية المشتقة من المرضى (PDOs) أو الطعوم الخارجية (PDXs) من قبل العديد من المجموعات البحثية حول^{العالم 2}. PDOs هي هياكل متعددة الخلايا في المختبر تشبه ميزات أنسجة الورم الأصلية ويمكنها التنظيم الذاتي والتجديد الذاتي³. يمكن استخدام هذه النماذج الواعدة في المختبر بنجاح لفحص الأدوية وتسهيل البحث الانتقالي. على الجانب الآخر ، تلخص نماذج PDX بأمانة اتفاقية حقوق الطفل الأصلية على جميع المستويات ذات الصلة ، من الأنسجة إلى السمات الجزيئية والاستجابة للأدوية ^2,4.

في الجسم الحي تزرع نماذج PDX في الغالب كأورام تحت الجلد في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. باستخدام هذا النهج ، أصبحت PDXs المعيار الذهبي في أبحاث السرطان ، خاصة لدراسة حساسية الأدوية أو مقاومتها. ومع ذلك ، ترتبط الوفيات المرتبطة ب CRC في الغالب بوجود آفات نقيلية في الكبد أو الرئة أو التجويف البريتوني ، ولا يمكن لأي من النهجين (PDO أو PDX) تلخيص الإعداد السريري المتقدم. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن الموقع المحدد لنمو الورم يحدد الخصائص البيولوجية المهمة التي لها تأثير على فعالية الدواء وتشخيص المرض². لذلك ، هناك حاجة ملحة لإنشاء نماذج ما قبل السريرية التي يمكن استخدامها لتقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان في بيئة النقيلي ذات الصلة^{سريريا 6}.

يمكن أن تعمل ماسحات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT) كماسحات ضوئية مقطعية سريرية مصغرة ، مما يوفر تصويرا أوليا للورم وورم خبيث في الفئران بدقة صورة متدرجة تتناسب مع صور التصوير المقطعي المحوسب لمرضى السرطان⁷. لمواجهة تباين الأنسجة الرخوة الضعيف لتقنية μCT ، يمكن استخدام عوامل التباين المعالجة باليود الإشعاعي لتحسين التباين وتقييم عبء الورم. باستخدام نهج التباين المزدوج ، يتم إعطاء اليود الفموي وداخل الصفاق في أوقات مختلفة. يساعد التباين الذي يتم إعطاؤه عن طريق الفم على تحديد الحدود بين أنسجة الورم ومحتوى الأعور داخل الأمعاء.  على الجانب الآخر ، يسمح التباين الذي يتم إعطاؤه داخل الصفاق بتحديد الحدود الخارجية لكتلة الورم ، والتي تنمو بشكل متكرر وتغزو الصفاق⁸.

تصف المخطوطة بروتوكولا لإجراء زرع تقويم العظام للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة ، ومنهجية مراقبة نمو الورم المعوي باستخدام التصوير المقطعي المحوسب. تظهر المخطوطة الحالية أن النموذج يلخص السيناريو السريري لأورام الأمعاء المتقدمة والأمراض النقيلي في مرضى CRC التي لا يمكن دراستها باستخدام نماذج PDO أو PDXO. نظرا لأن نماذج PDX التقويمية ل CRC تلخص السيناريو السريري لمرضى CRC ، فإننا نستنتج أنها الأفضل حتى الآن لاختبار فعالية الأدوية المضادة للأورام في أورام الأمعاء المتقدمة والأمراض النقيلية.

Protocol

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى. تمت الموافقة على المشروع من قبل لجنة أخلاقيات البحث في مستشفى جامعة فال ديبرون ، برشلونة ، إسبانيا (معرف الموافقة: PR (IR) 79/2009 PR (AG) 114/2014 ، PR (AG) 18/2018). تألفت عينات أنسجة القولون البشري من خزعات من مناطق غير نخرية من الأورام الغدية الأولية أو نقائل الكبد ، المقابلة للمرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم الذين خضعوا لاستئصال الورم. أجريت التجارب وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي لرعاية (86/609 / EEC) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على التابعة لمعهد VHIR-the Vall d'Hebron للبحوث (ID: 40/08 CEEA و 47/08/10 CEEA و 12/18 CEEA).

ملاحظة: أنثى NOD-SCID (إيماءة. تم شراء الفئران CB17-Prkdcscid / NcrCrl) من عمر 8 أسابيع من مختبرات نهر تشارلز.

1. اشتقاق خلايا المريض

1. قلع الورم
   ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراء التالي في خزانة بيولوجية في درجة حرارة الغرفة (RT) في منشأة.
   1. الحصول على عينات الورم من العمليات الجراحية للمرضى أو الخزعات ومن PDXs التي تنمو تحت الجلد في الفئران.
   2. بالنسبة للحقن التقويمي ، قم بإعداد الخلايا السرطانية من نماذج ورم PDX تحت الجلد بدلا من الأنسجة التي تم الحصول عليها مباشرة من المرضى⁹.
   3. توليد أورام PDX عن طريق تلقيح معلق من 1 × 10⁵ خلايا سرطانية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (50 ميكرولتر) ممزوج بمصفوفة Matrigel (50 ميكرولتر) تحت الجلد في جناح الفئران NOD-SCID².
      1. قياس نمو الورم باستخدام الفرجار كل يوم.
         ملاحظة: الأهم من ذلك ، أن مختبرنا قد أنشأ بنكا حيويا لأكثر من 350 نموذجا PDX. تم إنشاء نماذج الورم CRC-PDX المستخدمة في البروتوكول نماذج PDX في المختبر والتي تم تضخيمها أكثر من ثلاثة مقاطع في الفئران ، واجتازت معايير التضمين / الاستبعاد بنتيجة إيجابية (الجدول 1).
   4. القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم عندما تصل الأورام تحت الجلد إلى الحد الأقصى للحجم الذي حددته CEEA (قطره 1 سم) ، أو عندما تصل إلى معايير نقطة النهاية.
   5. استخراج الورم وإزالته بعناية من الجلد والأنسجة المحيطة غير الورم باستخدام المقص والملقط.
   6. قم بتخزين الأورام المحصودة في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية.
      ملاحظة: فصل الأورام في تعليق الخلية في أقرب وقت ممكن بعد إزالتها من موقعها الأصلي في آفات المرضى أو الطعوم الخارجية تحت الجلد في الفئران. يتم تقليل صلاحية الخلية بشكل كبير بعد 24 ساعة من إزالة الأنسجة ، مما يؤدي إلى زرع غير فعال في الفئران المتلقية.
2. إعداد الخلية
   ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراء التالي في خزانة بيولوجية في درجة حرارة الغرفة (RT) في غرفة زراعة الأنسجة.
   1. افصل الأورام باستخدام شفرة في صفيحة استزراع 10 سم مع 1 مل من وسط CoCSCM 6Ab الكامل (الجدول 2) (لتسهيل الفرم). ضع العينة المتجانسة المنفصلة في أنبوب مخروطي حجمه 15 mL.
   2. أضف وسط CoCSCM 6Ab الكامل إلى الحجم النهائي البالغ 5 مل (لا تستخدم أكثر من 3 مل من العينة المنفصلة في نفس الأنبوب).
      ملاحظة: CRC الأولية التي تم استئصالها من المرضى ملوثة بشكل طبيعي بالبكتيريا والفطريات. من الضروري إزالة مسببات الأمراض الموجودة في عينة المريض الأصلية باستخدام مزيج من ستة مضادات حيوية (البنسلين ، الستربتومايسين ، فطريات زون ، كاناميسين ، جنتاميسين ، ونيستاتين). قد يؤدي حقن الخلايا السرطانية الملوثة بالبكتيريا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة إلى موت.
   3. احتضان مع 50 ميكرولتر من DNase I (0.08 كيلو وحدة / مل) و 50 ميكرولتر من كولاجيناز (1.5 ملغ / مل) (وسط الهضم ؛ الجدول 2) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا ، في وضع 45 درجة. امزج المحلول جيدا كل 15 دقيقة مع ماصة سعة 5 مل قبل الحضانة.
      ملاحظة: فصل أنسجة الورم وهضمها عن طريق سحب عدة مرات للحصول على محلول خلية واحدة. هذا ضروري لحساب الخلايا قبل الحقن في الفئران المتلقية وبالتالي تحقيق زرع متجانس للخلايا السرطانية.
   4. أضف 5 مل من وسط CoCSCM 6Ab الكامل واخلطه جيدا مع ماصة 5 مل.
   5. قم بفرز المحلول باستخدام مصفاة خلية 100 ميكرومتر باستخدام أنبوب معقم جديد سعة 50 مل.
   6. قم بتدوير الخلايا التي تم فرزها عند 500 × جم لمدة 8 دقائق في RT.
   7. نضح الطاف.
   8. أعد تعليق الحبيبات في 3 مل من محلول عازلة تحلل RBC 1x.
   9. احتضان لمدة 10 دقائق في RT.
   10. أضف 3 مل من وسط CoCSCM 6Ab الكامل ، وماصة العينة ، وقم بتدويرها عند 500 × جم لمدة 10 دقائق في RT. نضح الطاف.
   11. أعد تعليق الحبيبات ب 5-10 مل من وسط CoCSCM 6Ab الكامل ، واستخدم عداد الخلايا لحساب العدد الإجمالي للخلايا.
   12. قم بتدوير الخلايا عند 500 × جم لمدة 10 دقائق في RT ، وأعد تعليقها في 10 مل من PBS.
   13. أعد تعليق الحبيبات للحصول على تركيز 20 × 10⁶ خلايا / مل ، واخلطها جيدا للحصول على تعليق خلية متجانس.
   14. تحضير محاقن 29 جم (0.5 مل U 100 إبرة ، 0.33 مم [29 جم] × 12.7 مم) لحقن الأعور في زراعة الأنسجة (حقنة / فأر واحد). قم بتحميل 50 ميكرولتر من معلق الخلايا السرطانية (1 × 10⁶ خلايا / حقن) في المحقنة واحتفظ بها على الجليد. تأكد من إزالة فقاعات الهواء من تعليق الخلية.
       ملاحظة: يعد التخلص من فقاعات الهواء عند تحميل الخلايا السرطانية في المحقنة أمرا ضروريا لتجنب حقن حجم زائد في جدار الأعور ، مما قد يؤدي إلى تمزق الأنسجة وفقدان العينة. من الضروري خلط تعليق الخلية جيدا عند تحميل المحقنة لتجنب حجم الورم غير المتكافئ بين الفئران في نفس التجربة.

2. حقن تقويم العظام في الأعور

ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراء التالي على مقعد في غرفة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في منشأة. يتم تنظيف المعدات المستخدمة وتعقيمها مسبقا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تعقيمها مرة أخرى في معقم محمول بين الأفراد أو المناطق في منشأة.

1. نظف موقع الجراحة عن طريق الرش بمنظف مطهر ومسح.
2. إزالة الشعر من بطن الفئران باستخدام آلة إزالة شعر الفأر.
3. ضع الماوس في وضع ضعيف. استخدم 2٪ إيزوفلوران لتخدير. تأكيد تأثير التخدير عن طريق معسر الطرف بلطف ومراقبة عدم وجود التحفيز.
4. ضع قطرة 50-100 ميكرولتر من المرهم البيطري (3 ملغ / غرام Lacryvisc) في العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
5. تطهير بطن الفأر عن طريق التنظيف بالكلورهيكسيدين أو البوفيدون اليود عدة مرات في حركة دائرية.
6. قم بعمل شق طولي 1 سم على أسفل البطن باستخدام مقص الجراحة. افصل الجلد بعناية عن كل موقع لتقديم الصفاق الموجود تحت الجلد.
7. قم بعمل شق 0.5-1 سم في غشاء الصفاق ، كبير بما يكفي لإضفاء الطابع الخارجي على الأعور.
   ملاحظة: إضفاء الطابع الخارجي على الأعور دون التلاعب المفرط بالأعضاء الداخلية ، مما قد يزيد بشكل كبير من فتك الإجراء.
8. اعزل الأعور بعناية عن الماوس باستخدام شاش معقم مقطوع مسبقا.
9. بلل الأعور بمحلول ملحي طوال العملية.
10. شل حركة الأعور عن طريق الإمساك بها بعناية بالملقط ، وإدخال الإبرة بشكل سطحي في جدار الأعور. تجنب الشعيرات الدموية والأوعية في موقع الحقن. إزالة الفقاعات من تعليق الخلية.
11. حقن 50 ميكرولتر كاملة من تعليق الخلايا السرطانية ببطء. عادة ما يستغرق حوالي 10 ثوان للإدارة. تجنب ثقب تجويف الأعور بالإبرة ، لأن هذا يؤدي إلى القضاء على تعليق الخلايا السرطانية من الجسم من خلال التمعج المعوي.
    ملاحظة: حقن تعليق الخلايا السرطانية في الأعور من الفئران هو الخطوة الأكثر تحديا في الإجراء بأكمله. يجب استخدام ضوء ساطع يركز على موقع الحقن والعدسة المكبرة في هذا الجزء من البروتوكول. أدخل الإبرة الموازية لسطح الأعور. الأعور هو نسيج هش للغاية. لذلك ، يجب إجراء تثبيت الأعور باستخدام ملقط جراحي وعن طريق الضغط اللطيف لتجنب تمزق الأنسجة مما يؤدي إلى نزيف. ينتج عن الزرع الناجح فقاعة بيضاء (حبيبات من الخلايا) في جدار الأعور. إذا تعذر تصور الفقاعة ، فقد يشير ذلك إلى أن الأعور قد تم ثقبه وأن الخلايا قد انتهت في تجويف الأعور ، مما أدى إلى إزالتها من الأمعاء.
12. بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة ببطء من الأعور واضغط برفق على موقع الحقن باستخدام قضيب ذو رأس قطني ، لتجنب هروب الخلايا السرطانية وتقليل النزيف الخفيف.
13. نظف الأعور بمحلول ملحي لإزالة أي حطام.
14. أعد الأعور مرة أخرى إلى بطن.
15. أغلق الصفاق باستخدام 5/0 غرز.
16. أغلق جلد البطن باستخدام 5/0 غرز.
17. تطبيق المضادات الحيوية اللاحقة للعمليات الجراحية (100 ملغ/ كغ أموكسيسيلين أو 20 ملغ/كغ من إينروفلوكساسين) والمسكنات (5 ملغ/مل ميتاكام/ميلوكسيكام) عن طريق الحقن تحت الجلد. ضع الفئران على وسادة تدفئة واحتفظ بها هناك حتى تتعافى تماما. ثم أعدهم إلى القفص مع الأخرى.

3. تقييم نمو الورم التقويمي باستخدام التصوير المقطعي المحوسب

ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراء التالي في منصة التصوير قبل السريري (PIP) من منشأة.

1. تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للوائح اللجنة الأخلاقية المؤسسية.
2. البدء في مراقبة حجم الورم عن طريق μCT 2 أسابيع بعد حقن الخلايا ، وكل أسبوع بعد ذلك.
3. قم بتخفيف عامل التباين iopamiro (300 مجم / مل) حديثا في محلول ملحي ، بنسبة 3: 1 لكلتا الجرعتين. تطبيق 300 مل من الإيوباميرو عن طريق التزويج الفموي.
   ملاحظة: نظرا لضعف تباين الأنسجة الرخوة في μCT ، يوصى باستخدام عامل تباين لتحسين حساسية التقنية. يتضمن البروتوكول إعطاء فموي لعامل قائم على اليود (iopamiro) لتحديد عبء الورم داخل اللمعة ، وإدارة ثانوية داخل الصفاق لنفس العامل لتحديد عبء الورم في الوجه الحشوي للأمعاء. تم إجراء تجارب تجريبية سابقا لتحديد الوقت الدقيق الذي يحتاجه عامل التباين للوصول إلى الأعور للفئران قبل القضاء عليه. في حالة iopamiro ، فهو يقع في حوالي 2 ساعة.
4. بعد 2 ساعة، يتم تطبيق حقنة داخل الصفاق بقيمة 300 مل من الإيوباميرو المخفف سابقا. تساعد الإدارة على تحديد حدود الورم في الوجه الجداري.
5. تخدير باستخدام 2 ٪ إيزوفلوران.
6. بعد التأكد من تخدير بشكل صحيح عن طريق الضغط على قدم الماوس ، ضع في سرير المسح في μCT. أفضل وضع هو ضعيف (الوجه لأعلى).
7. في برنامج التحكم ، ابدأ الوضع المباشر (وضع التنظير الفلوري) لوضع منطقة البطن في مجال الرؤية (FOV) للماسح الضوئي. للقيام بذلك ، حرك السرير للأمام والخلف وبشكل جانبي حتى يتم تحقيق الموضع المطلوب. قم بتدوير أنبوب الأشعة السينية والكاشف 90 درجة ، وحرك سرير المسح في المحور ص لتوسيط تماما.
8. استخدم المعلمات التالية لصور المسح الضوئي μCT: 30 مم FOV ، 26 ثانية من وقت الاستحواذ ، 90 كيلو فولت من الجهد الحالي ، و 200 μA من التيار الحالي ، باستخدام نظام تصوير FX μCT.
9. أعد إلى أقفاصها للتعافي عند الانتهاء من الفحص. توفير الدعم الحراري ومراقبة حتى تتعافى من التخدير قبل العودة إلى السكن.
10. ينتج عن اكتساب μCT ملف بحجم 250 ميجا بايت لكل فحص. تحتوي ملفات البيانات التي تم إنشاؤها على تنسيق VOX. من أجل جعلها في متناول أي برنامج تحليل التصوير ، قم بتحويل الملفات إلى تنسيق DICOM باستخدام برنامج إدارة قاعدة البيانات الخاص ب μCT. قم بتخزين مجموعة الملفات التي تم إنشاؤها في قرص ثابت محمول لتحليلها باستخدام أي جهاز كمبيوتر به برنامج تصوير متاح.
    ملاحظة: أثناء تحليل الصور ، يتم تحديد الأعور كأمعاء متوسعة ذات محتوى إشعاعي كثيف (iopamiro) ، غالبا في الجانب الأيسر من البطن الذيلي. في الانثناء الحشوي للأعور ، لوحظ سماكة الجدار ، مقارنة بالمناطق المعوية المجاورة. سماكة يتوافق مع نمو الورم.
11. بمجرد تحديد موقع الورم ، ابحث عن أعلى قطر في طرق العرض المختلفة (محوري ، إكليلي ، وسهمي). قم بقياس هذه المحاور الثلاثة واحسب حجم الورم باتباع الصيغة الإهليلجية: الحجم = 4/3π x (نصف المحور x نصف المحور y × z-semiaxis) ¹⁰.

4. التدخل العلاجي في الفئران التي تحمل أورام تقويم العظام

1. مراقبة الفئران التي تحمل أورام تقويم العظام أسبوعيا.
2. عندما يتم الكشف عن إشارة فحص μCT للورم في معظم الفئران ، قم بإجراء فحص μCT آخر في الأسبوع التالي لتأكيد وجود الورم.
   ملاحظة: يعتمد وقت بدء العلاج على نموذج PDX المستخدم ، ويختلف من 3-12 أسبوعا بعد تلقيح الخلايا السرطانية في الأعور.
3. التوزيع العشوائي للفئران في أربع مجموعات: مجموعة مركبة (ن = 10-15 فئران) ، ومجموعة أدوية اختبار (ن = 10-15 فئران) ، ومجموعة علاج كيميائي قياسية للرعاية (ن = 10-15 فئران) ، ومجموعة علاج مركب (ن = 10-15 فئران).
4. عالج الفئران داخل الصفاق بمحلول ملحي (مجموعة مركبات) ، أو دواء الاختبار (20 مجم / كجم) (مجموعة أدوية الاختبار) ، أو إرينوتيكان (50 مجم / كجم) (مجموعة الرعاية القياسية) ، أو دواء الاختبار (20 مجم / كجم) باستخدام إرينوتيكان (50 مجم / كجم) (مجموعة العلاج المركب). أداء الإدارة مرة واحدة في الأسبوع حتى نهاية التجربة.
5. راقب نمو الورم أسبوعيا عن طريق التصوير المقطعي المحوسب طوال فترة التجربة.
6. في نهاية التجربة ، القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم وجمع الكبد والرئتين وأي آفات أخرى محتملة في الأعضاء الأخرى.
7. قم بتضمين عينات الأنسجة في أشرطة واحتضانها في 4٪ فورمالين بين عشية وضحاها. استخدام أنسجة الأمعاء من الفأر دون ورم في الأعور كعنصر تحكم.
8. إزالة الكاسيتات من الفورمالين واحتضان مع 70 ٪ من الإيثانول لمدة 3 ساعات على الأقل.
9. قم بتضمين الكاسيت مع البارافين ، باستخدام البروتوكولات القياسية لمرفق التشريح المرضي.
10. أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) من الأعور والكبد والرئة ، باستخدام البروتوكولات القياسية لمرفق التشريح المرضي.

النتائج

تمت مراقبة الفئران المزروعة بشكل متعامد مع الخلايا السرطانية المشتقة من المريض أسبوعيا عن طريق التصوير المقطعي المحوسب. في نهاية التجربة ، تم القتل الرحيم للحيوانات. تم جمع الأمعاء ، ceca (الشكل 1A ، B) ، الكبد ، الرئتين ، وأي آفة أخرى محتملة ، وإدراجها في شريط كاسيت ، ...

Discussion

على مدى العقود القليلة الماضية ، تم تطوير العديد من العلاجات الجديدة المضادة للسرطان واختبارها في المرضى الذين يعانون من أنواع مختلفة من الأورام ، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم (CRC). على الرغم من أن النتائج الواعدة في النماذج قبل السريرية قد لوحظت في كثير من الحالات ، إلا أن الفعالية ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
Apo-Transferrin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	T1147-500MG
B27 Supplement	Life Technologies S.A (Spain)	17504044
Chlorhexidine Aqueous Solution 2%	DH MATERIAL MÉDICO, S.L.	1111696250
Collagenase	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	C0130-500MG
D-(+)-Glucose	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	G6152
DMEM /F12	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	21331-020
DNase I	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	D4263-5VL
EGF	PEPRO TECH EC LTD.	AF-100-15-500 µg
FGF basic	PEPRO TECH EC LTD.	100-18B
Fungizone	Life Technologies S.A (Spain)	15290026
Gentamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15750037
Heparin Sodium Salt	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	H4784-250MG
Insulin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	I9278-5ML
Iopamiro
Isoflurane	-	-
Kanamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15160047
L-Glutamine	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	25030032
Matrigel Matrix	CULTEK, S.L.U.	356235/356234/354234
Metacam, 5 mg/mL	-	-
Non-essential amino acids	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11140035
Nystatin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	N4014-50MG
Pen/Strep	Life Technologies S.A (Spain)	15140122
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile	Labclinics S.A	L0615-500
Progesterone	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P0130-25G
Putrescine	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P5780-5G
RBC Lysis Buffer	Labclinics S.A	00-4333-57
Sodium Pyruvate	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11360039
Sodium Selenite	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	S5261-25G
ESSENTIAL SUPPLIES
8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice	-	-
BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm	BECTON DICKINSON, S.A.U.	320926
Blade #24	-	-
Cell Strainer 100 µm	Cultek, SLU	45352360
Forceps and Surgical scissors	-	-
Heating pad	-	-
Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel	-	-
Surfasafe	-	-
Suture PROLENE 5-0	JOHNSON&JOHNSON S, A.	8720H
EQUIPMENT/SOFTWARE
Quantum FX µCT Imaging system	Perkin Elmer	Perkin Elmer	http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083