Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in die Blinddarmwand von immundefizienten Mäusen. Das Modell rekapituliert fortgeschrittene metastasierende Darmkrebserkrankungen und ermöglicht die Evaluierung neuer therapeutischer Medikamente in einem klinisch relevanten Szenario von Lungen- und Lebermetastasen.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren wurden ausgefeiltere präklinische Darmkrebsmodelle (CRC) mit patienteneigenen Krebszellen und 3D-Tumoroiden etabliert. Da patienteneigene Tumororganoide die Eigenschaften des ursprünglichen Tumors beibehalten können, ermöglichen diese zuverlässigen präklinischen Modelle das Screening von Krebsmedikamenten und die Untersuchung von Arzneimittelresistenzmechanismen. Darmkrebsbedingte Todesfälle bei Patienten sind jedoch meist mit dem Vorhandensein einer metastasierten Erkrankung verbunden. Es ist daher wichtig, die Wirksamkeit von Krebstherapien in relevanten In-vivo-Modellen zu bewerten, die die wichtigsten molekularen Merkmale der menschlichen Krebsmetastasierung wirklich rekapitulieren. Wir haben ein orthotopes Modell etabliert, das auf der Injektion von Darmkrebszellen von Patienten direkt in die Blinddarmwand von Mäusen basiert. Diese Tumorzellen entwickeln Primärtumoren im Blinddarm, die in Leber und Lunge metastasieren, was häufig bei Patienten mit fortgeschrittenem Darmkrebs beobachtet wird. Dieses Darmkrebs-Mausmodell kann verwendet werden, um das Ansprechen von Medikamenten zu untersuchen, das durch Mikrocomputertomographie (μCT) überwacht wird, ein klinisch relevantes bildgebendes Verfahren im kleinen Maßstab, mit dem Primärtumoren oder Metastasen bei Patienten leicht identifiziert werden können. Hier beschreiben wir das chirurgische Vorgehen und die erforderliche Methodik, um patienteneigene Krebszellen in die Blinddarmwand von immundefizienten Mäusen zu implantieren.

Einleitung

Darmkrebs (CRC) ist weltweit die zweithäufigste Krebstodesursache¹. Die Fähigkeit, In-vitro- oder In-vivo-Tumormodelle zu generieren, die aus einzelnen Tumorzellen von Patienten abgeleitet werden, hat die Präzisionsmedizin in der Onkologie vorangetrieben. In den letzten zehn Jahren wurden von vielen Forschungsgruppen auf der^{ganzen Welt von} Patienten abgeleitete Organoide (PDOs) oder Xenotransplantate (PDXs) verwendet 2. PDOs sind multizelluläre In-vitro-Strukturen, die den Merkmalen des ursprünglichen Tumorgewebes ähneln und sich selbst organisieren und erneuern können³. Diese vielversprechenden In-vitro-Modelle können erfolgreich für das Wirkstoff-Screening und die translationale Forschung eingesetzt werden. Auf der anderen Seite rekapitulieren PDX-Modelle den ursprünglichen Darmkrebs auf allen relevanten Ebenen, von der Histologie über molekulare Merkmale bis hin zum Ansprechen auf Arzneimittel ^2,4.

Im lebenden Organismus PDX-Modelle werden meist als subkutane Tumoren in immundefizienten Mäusen gezüchtet. Mit diesem Ansatz sind PDXs zum Goldstandard in der Krebsforschung geworden, insbesondere zur Untersuchung von Arzneimittelempfindlichkeit oder -resistenz. Todesfälle im Zusammenhang mit Darmkrebs sind jedoch meist mit dem Vorhandensein von metastasierten Läsionen in der Leber, der Lunge oder der Bauchhöhle verbunden, und keiner der beiden Ansätze (PDO oder PDX) kann das fortgeschrittene klinische Umfeld rekapitulieren. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass der spezifische Ort des Tumorwachstums wichtige biologische Merkmale bestimmt, die einen Einfluss auf die Wirksamkeit von Medikamenten und die Krankheitsprognose haben². Daher besteht ein dringender Bedarf an der Etablierung präklinischer Modelle, mit denen die Wirksamkeit von Krebsmedikamenten in einem klinisch relevanten metastasierten Setting beurteilt werden^{kann 6}.

Mikrocomputertomographen (μCT) können als verkleinerte klinische CT-Scanner fungieren und die Bildgebung von Primärtumoren und Metastasen bei Mäusen mit einer skalierten Bildauflösung ermöglichen, die proportional zu der von CT-Bildern von Krebspatienten ist⁷. Um dem schlechten Weichteilkontrast der μCT-Technik entgegenzuwirken, können radiologische jodhaltige Kontrastmittel eingesetzt werden, um den Kontrast zu verbessern und die Tumorlast zu beurteilen. Unter Verwendung eines dualen Kontrastansatzes wird orales und intraperitoneales Jod zu unterschiedlichen Zeitpunkten verabreicht. Das oral verabreichte Kontrastmittel hilft, die Grenzen zwischen Tumorgewebe und Blinddarmgehalt im Darm zu definieren.  Auf der anderen Seite ermöglicht das intraperitoneal verabreichte Kontrastmittel die Identifizierung der äußeren Grenzen der Tumormasse, die häufig wächst und in das Peritoneum eindringt⁸.

Das Manuskript beschreibt ein Protokoll zur orthotopen Implantation von patienteneigenen Krebszellen in die Blinddarmwand immundefizienter Mäuse und die Methodik zur Überwachung des Darmtumorwachstums mittels μCT-Scans. Das vorliegende Manuskript zeigt, dass das Modell das klinische Szenario von fortgeschrittenen Darmtumoren und metastasierenden Erkrankungen bei Darmkrebspatienten rekapituliert, die nicht mit PDO- oder PDXO-Modellen untersucht werden können. Da orthotope PDX-Modelle des Darmkrebses das klinische Szenario von Darmkrebspatienten rekapitulieren, kommen wir zu dem Schluss, dass sie bisher die besten sind, um die Wirksamkeit von Antitumormedikamenten bei fortgeschrittenen Darmtumoren und metastasierenden Erkrankungen zu testen.

Protokoll

Von allen Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Das Projekt wurde von der Ethikkommission für Forschung des Universitätsklinikums Vall d'Hebron, Barcelona, Spanien, genehmigt (Genehmigung ID: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Menschliche Dickdarmgewebeproben bestanden aus Biopsien aus nicht-nekrotischen Bereichen von primären Adenokarzinomen oder Lebermetastasen, die Patienten mit Dickdarm- und Enddarmkrebs entsprachen, die sich einer Tumorresektion unterzogen hatten. Die Versuche wurden gemäß der Tierpflegerichtlinie der Europäischen Union (86/609/EWG) durchgeführt und von der Ethikkommission für Tierversuche des VHIR - des Forschungsinstituts Vall d'Hebron genehmigt (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA und 12/18 CEEA).

HINWEIS: Weibliches NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl) Mäuse im Alter von 8 Wochen wurden von Charles River Laboratories gekauft.

1. Ableitung von Patientenzellen

1. Tumor-Extraktion
   HINWEIS: Das folgende Verfahren wird in einem biologischen Schrank bei Raumtemperatur (RT) in der Tierhaltung durchgeführt.
   1. Gewinnung von Tumorproben aus den Operationen oder Biopsien der Patienten und aus subkutan wachsenden PDXs bei Mäusen.
   2. Für die orthotope Injektion werden die Tumorzellen aus etablierten subkutanen PDX-Tumormodellen anstelle von Gewebe, das direkt von Patienten gewonnen wurde, präpariert⁹.
   3. Erzeugung von PDX-Tumoren durch Inokulation einer Suspension von 1 x 10⁵ Tumorzellen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (50 μl), gemischt mit Matrigel-Matrix (50 μl), subkutan in der Flanke von NOD-SCID-Mäusen².
      1. Messen Sie das Tumorwachstum jeden zweiten Tag mit einem Messschieber.
         HINWEIS: Wichtig ist, dass unser Labor eine Biobank mit mehr als 350 PDX-Modellen erstellt hat. Bei den im Protokoll verwendeten CRC-PDX-Tumormodellen handelt es sich um etablierte PDX-Modelle im Labor, die mehr als drei Passagen in Mäusen amplifiziert wurden und die Ein-/Ausschlusskriterien mit einem positiven Ergebnis bestanden haben (Tabelle 1).
   4. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixluxation, wenn die subkutanen Tumoren die von der CEEA festgelegte maximale Größe (1 cm Durchmesser) erreichen oder wenn die Tiere die Endpunktkriterien erreichen.
   5. Entnehmen Sie den Tumor und entfernen Sie ihn vorsichtig mit Schere und Pinzette von der Haut und dem umgebenden Nicht-Tumorgewebe.
   6. Lagern Sie die entnommenen Tumore bis zum nächsten Schritt in PBS bei 4 °C.
      HINWEIS: Dissoziieren Sie die Tumoren in der Zellsuspension so schnell wie möglich nach der Entfernung von ihrer ursprünglichen Position in den Läsionen der Patienten oder subkutanen Xenotransplantaten bei Mäusen. Die Zellviabilität ist 24 Stunden nach der Gewebeentnahme signifikant reduziert, was zu einer ineffizienten Implantation bei Empfängermäusen führt.
2. Vorbereitung der Zellen
   HINWEIS: Das folgende Verfahren wird in einem biologischen Schrank bei Raumtemperatur (RT) im Gewebekulturraum durchgeführt.
   1. Dissoziation der Tumore mit einer Klinge in einer 10 cm langen Kulturplatte mit 1 ml vollständigem CoCSCM 6Ab-Medium (Tabelle 2) (zur Erleichterung des Zerkleinerns). Geben Sie die homogene dissoziierte Probe in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
   2. Geben Sie das vollständige CoCSCM 6Ab-Medium zu einem Endvolumen von 5 ml hinzu (verwenden Sie nicht mehr als 3 ml dissoziierte Probe im selben Röhrchen).
      HINWEIS: Primärer Darmkrebs, der von Patienten reseziert wird, ist von Natur aus mit Bakterien und Pilzen kontaminiert. Es ist wichtig, die in der ursprünglichen Patientenprobe vorhandenen Krankheitserreger mit einem Cocktail aus sechs Antibiotika (Penicillin, Streptomycin, Fungizon, Kanamycin, Gentamycin und Nystatin) zu entfernen. Die Injektion von Tumorzellen, die mit Bakterien kontaminiert sind, in immundefiziente Mäuse kann zum Tod von Tieren führen.
   3. Inkubieren mit 50 μl DNase I (0,08 kU/ml) und 50 μl Kollagenase (1,5 mg/ml) (Aufschlussmedium; Tabelle 2) 1 h bei 37 °C in einem Zellkultur-Inkubator in einer 45°-Position. Mischen Sie die Lösung vor der Inkubation alle 15 Minuten gut mit einer 5-ml-Pipette.
      HINWEIS: Dissoziieren Sie das Tumorgewebe und verdauen Sie es durch mehrmaliges Pipettieren, um eine Einzelzelllösung zu erhalten. Dies ist wichtig, um die Zellen vor der Injektion in Empfängermäuse zu zählen und so eine homogene Implantation von Tumorzellen zu erreichen.
   4. Fügen Sie 5 ml des vollständigen CoCSCM 6Ab-Mediums hinzu und mischen Sie es gut mit einer 5-ml-Pipette.
   5. Sortieren Sie die Lösung mit einem 100-μm-Zellsieb unter Verwendung eines neuen sterilen 50-ml-Röhrchens.
   6. Die sortierten Zellen werden bei 500 x g für 8 min bei RT geschleudert.
   7. Saugen Sie den Überstand ab.
   8. Resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml 1x Erythrozyten-Lysepufferlösung.
   9. 10 Minuten bei RT inkubieren.
   10. Fügen Sie 3 ml des vollständigen CoCSCM 6Ab-Mediums hinzu, pipettieren Sie die Probe und schleudern Sie bei 500 x g für 10 Minuten bei RT. Saugen Sie den Überstand ab.
   11. Resuspendieren Sie das Pellet mit 5-10 ml vollständigem CoCSCM 6Ab-Medium und verwenden Sie einen Zellzähler, um die Gesamtzahl der Zellen zu berechnen.
   12. Schleudern Sie die Zellen bei 500 x g für 10 Minuten bei RT und resuspendieren Sie sie in 10 ml PBS.
   13. Das Pellet wird resuspendiert, um eine Konzentration von 20 x 10⁶ Zellen/ml zu erhalten, und gut mischen, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.
   14. Bereiten Sie 29-G-Spritzen (0,5 ml U 100-Nadel, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) für die Blinddarminjektion in die Gewebekultur (eine Spritze/Maus) vor. Geben Sie 50 μl der Tumorzellsuspension (1 x 10⁶ Zellen/Injektion) in die Spritze und lassen Sie sie auf Eis. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen aus der Zellsuspension entfernt werden.
       HINWEIS: Die Beseitigung von Luftblasen, wenn die Tumorzellen in die Spritze geladen werden, ist wichtig, um die Injektion eines übermäßigen Volumens in die Blinddarmwand zu vermeiden, was zu Geweberissen und Probenverlust führen kann. Es ist zwingend erforderlich, die Zellsuspension beim Laden der Spritze gut zu mischen, um eine ungleichmäßige Tumorgröße bei Mäusen im selben Experiment zu vermeiden.

2. Orthotope Injektion in den Blinddarm

HINWEIS: Das folgende Verfahren wird auf einem Tisch in einem speziellen pathogenfreien Raum (SPF) in der Tiereinrichtung durchgeführt. Die verwendeten Geräte werden zuvor gereinigt und sterilisiert. Zusätzlich wird es in einem tragbaren Sterilisator zwischen Personen oder Zonen in der Tieranlage wieder sterilisiert.

1. Reinigen Sie die Operationsstelle, indem Sie sie mit einem desinfizierenden Reinigungsmittel besprühen und abwischen.
2. Enthaaren Sie den Bauch der Mäuse mit einem Maushaarentfernungsgerät.
3. Bringen Sie die Maus in Rückenlage. Verwenden Sie 2% Isofluran, um das Tier zu betäuben. Bestätigen Sie die Wirkung der Anästhesie, indem Sie die Extremität sanft kneifen und das Fehlen einer Stimulation beobachten.
4. Geben Sie einen 50-100 μl Tropfen Veterinärsalbe (3 mg/g Lacryvisc) in die Augen, um Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern.
5. Desinfizieren Sie den Bauch der Maus, indem Sie ihn mehrmals in kreisenden Bewegungen mit Chlorhexidin oder Povidon-Jod schrubben.
6. Machen Sie einen 1 cm langen Schnitt über dem Unterbauch mit einer chirurgischen Schere. Trennen Sie die Haut vorsichtig von jeder Stelle, um das Bauchfell unter der Haut zu präsentieren.
7. Machen Sie einen 0,5-1 cm langen Schnitt in der Bauchfellmembran, der groß genug ist, um den Blinddarm zu exteriorisieren.
   HINWEIS: Äußere den Blinddarm, ohne die inneren Organe übermäßig zu manipulieren, was die Letalität des Eingriffs dramatisch erhöhen könnte.
8. Isolieren Sie den Blinddarm vorsichtig von der Maus mit einer vorgeschnittenen, sterilen Gaze.
9. Befeuchten Sie den Blinddarm während des gesamten Eingriffs mit Kochsalzlösung.
10. Immobilisieren Sie den Blinddarm, indem Sie ihn vorsichtig mit einer Zange fassen, und führen Sie die Nadel oberflächlich in die Blinddarmwand ein. Vermeiden Sie Kapillaren und Gefäße an der Injektionsstelle. Entfernen Sie Blasen aus der Zellsuspension.
11. Injizieren Sie die gesamten 50 μl Tumorzellsuspension langsam. Die Verabreichung dauert in der Regel etwa 10 Sekunden. Vermeiden Sie es, das Blinddarmlumen mit der Nadel zu perforieren, da dies zur Ausscheidung der Tumorzellsuspension aus dem Körper durch Darmperistaltik führt.
    HINWEIS: Die Injektion der Tumorzellsuspension in den Blinddarm der Mäuse ist der schwierigste Schritt des gesamten Verfahrens. In diesem Teil des Protokolls sollte ein helles Licht, das auf die Injektionsstelle gerichtet ist, und eine Lupe verwendet werden. Führen Sie die Nadel parallel zur Blinddarmoberfläche ein. Der Blinddarm ist ein sehr zerbrechliches Gewebe; Daher sollte die Ruhigstellung des Blinddarms mit einer chirurgischen Zange und durch sanften Druck durchgeführt werden, um einen Geweberiss zu vermeiden, der zu Blutungen führt. Eine erfolgreiche Implantation führt zu einer weißen Blase (Zellpellet) in der Blinddarmwand. Wenn die Blase nicht sichtbar gemacht werden kann, kann dies darauf hindeuten, dass der Blinddarm perforiert wurde und die Zellen im Blinddarmlumen geendet haben, was dazu führt, dass sie vom Darmtrakt abgebaut werden.
12. Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel langsam aus dem Blinddarm und üben Sie mit einem Applikator mit Wattespitze sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, um das Austreten von Tumorzellen zu vermeiden und leichte Blutungen zu reduzieren.
13. Reinigen Sie den Blinddarm mit Kochsalzlösung, um alle Ablagerungen zu entfernen.
14. Führe den Blinddarm zurück in den Bauch des Tieres.
15. Verschließen Sie das Bauchfell mit 5/0-Nähten.
16. Verschließen Sie die Haut des Bauches mit 5/0-Nähten.
17. Postoperative Verabreichung von Antibiotika (100 mg/kg Amoxicillin oder 20 mg/kg Enrofloxacin) und Analgetika (5 mg/ml Metacam/Meloxicam) durch subkutane Injektion. Legen Sie die Mäuse auf ein Heizkissen und halten Sie sie dort, bis sie sich vollständig erholt haben. Setze sie dann mit anderen Tieren in den Käfig zurück.

3. Beurteilung des orthotopen Tumorwachstums mittels μCT-Scanning

HINWEIS: Das folgende Verfahren wird in der präklinischen Bildgebungsplattform (PIP) der Tiereinrichtung durchgeführt.

1. Führen Sie alle Tierbehandlungen gemäß den Vorschriften der institutionellen Ethikkommission durch.
2. Beginnen Sie mit der Überwachung des Tumorvolumens durch μCT 2 Wochen nach der Zellinjektion und danach jede Woche.
3. Das Kontrastmittel Iopamiro (300 mg/ml) wird in Kochsalzlösung im Verhältnis 3:1 für beide Dosen frisch verdünnt. Verabreichen Sie 300 ml Iopamiro über eine orale Sonde.
   HINWEIS: Aufgrund des schlechten Weichteilkontrasts des μCT wird ein Kontrastmittel empfohlen, um die Empfindlichkeit der Technik zu verbessern. Das Protokoll umfasst eine orale Verabreichung eines Wirkstoffs auf Jodbasis (Iopamiro) zur Abgrenzung der intraluminalen Tumorlast und eine sekundäre intraperitoneale Verabreichung desselben Wirkstoffs, um die Tumorlast in der viszeralen Seite des Darms zu definieren. In der Vergangenheit wurden Pilotversuche durchgeführt, um die genaue Zeit zu bestimmen, die das Kontrastmittel benötigt, um im Blinddarm von Mäusen anzukommen, bevor es ausgeschieden wird. Bei Iopamiro sind es etwa 2 Stunden.
4. Nach 2 h ist eine intraperitoneale Injektion von 300 ml zuvor verdünntem Iopamiro zu verabreichen. Die Verabreichung hilft, die Tumorgrenzen im Scheitelgesicht zu definieren.
5. Betäuben Sie die Tiere mit 2% Isofluran.
6. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass das Tier korrekt betäubt ist, indem Sie den Fuß der Maus einklemmen, legen Sie das Tier in das Scanbett des μCT. Die beste Position ist Rückenlage (mit dem Gesicht nach oben).
7. Starten Sie in der Steuerungssoftware den Live-Modus (Durchleuchtungsmodus), um den Bauchbereich in das Sichtfeld (FOV) des Scanners zu platzieren. Bewegen Sie dazu das Bett nach vorne, hinten und seitlich, bis die gewünschte Position erreicht ist. Drehen Sie die Röntgenröhre und den Detektor um 90° und bewegen Sie das Scanbett in der y-Achse, um das Tier vollständig zu zentrieren.
8. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die μCT-Scanbilder: 30 mm Sichtfeld, 26 s Aufnahmezeit, 90 kV Stromspannung und 200 μA Stromstärke unter Verwendung eines FX μCT-Bildgebungssystems.
9. Bringen Sie die Tiere zur Erholung in ihre Käfige zurück, wenn der Scan abgeschlossen ist. Bieten Sie thermische Unterstützung und überwachen Sie die Tiere, bis sie sich von der Narkose erholt haben, bevor sie in den Stall zurückkehren.
10. Die μCT-Erfassung ergibt für jeden Scan eine Datei mit einer Größe von 250 MB. Die erstellten Datendateien haben ein VOX-Format. Um sie für jede Bildanalysesoftware zugänglich zu machen, konvertieren Sie die Dateien mit der Datenbankverwaltungssoftware des μCT in das DICOM-Format. Speichern Sie den Stapel der erstellten Dateien auf einer tragbaren Festplatte, um sie mit jedem Computer mit verfügbarer Bildverarbeitungssoftware zu analysieren.
    HINWEIS: Bei der Bildanalyse wird der Blinddarm als erweiterter Darm mit radiodichtem Inhalt (Iopamiro) lokalisiert, häufig in der linken Seite des kaudalen Abdomens. Bei der viszeralen Beugung des Blinddarms ist eine Wandverdickung im Vergleich zu den angrenzenden Darmregionen zu beobachten. Die Verdickung entspricht dem Tumorwachstum.
11. Sobald der Tumor lokalisiert ist, finden Sie den höchsten Durchmesser in den verschiedenen Ansichten (axial, koronal und sagittal). Messen Sie diese drei Achsen und berechnen Sie das Tumorvolumen nach der Ellipsoidformel: Volumen = 4/3π x (x-Halbachse x y-Halbachse x z-Halbachse)¹⁰.

4. Therapeutische Intervention bei Mäusen mit orthotopen Tumoren

1. Überwachen Sie die Mäuse mit orthotopen Tumoren wöchentlich.
2. Wenn bei den meisten Mäusen ein μCT-Scansignal des Tumors festgestellt wird, führen Sie in der folgenden Woche einen weiteren μCT-Scan durch, um das Vorhandensein des Tumors zu bestätigen.
   HINWEIS: Die Zeit bis zum Beginn der Behandlung hängt vom verwendeten PDX-Modell ab und variiert zwischen 3 und 12 Wochen nach der Inokulation der Tumorzellen im Blinddarm.
3. Die Mäuse werden nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen eingeteilt: eine Vehikelgruppe (n = 10-15 Mäuse), eine Gruppe mit Testmedikamenten (n = 10-15 Mäuse), eine Gruppe mit Standard-Chemotherapie (n = 10-15 Mäuse) und eine Kombinationsbehandlungsgruppe (n = 10-15 Mäuse).
4. Behandeln Sie die Mäuse intraperitoneal mit Kochsalzlösung (Vehikelgruppe), dem Testmedikament (20 mg/kg) (Testmedikamentengruppe), Irinotecan (50 mg/kg) (Standardbehandlungsgruppe) oder dem Testmedikament (20 mg/kg) mit Irinotecan (50 mg/kg) (Kombinationsbehandlungsgruppe). Führen Sie die Verabreichung einmal pro Woche bis zum Ende des Experiments durch.
5. Überwachen Sie das Tumorwachstum wöchentlich durch μCT-Scans während des gesamten Experiments.
6. Am Ende des Experiments werden die Mäuse durch Gebärmutterhalsverrenkung eingeschläfert und Lebern, Lungen und andere mögliche Läsionen in anderen Organen entnommen.
7. Die Gewebeproben werden in Kassetten abgefüllt und über Nacht in 4% Formalin inkubiert. Verwenden Sie Darmgewebe von einer Maus ohne Tumor im Blinddarm als Kontrolle.
8. Nehmen Sie die Kassetten von Formalin und inkubieren Sie mit 70%igem Ethanol für mindestens 3 Stunden.
9. Betten Sie die Kassetten mit Paraffin ein, indem Sie die Standardprotokolle der histopathologischen Einrichtung verwenden.
10. Führen Sie Hämatoxylin- und Eosinfärbungen (H&E) aus dem Blinddarm, der Leber und der Lunge unter Verwendung der Standardprotokolle der histopathologischen Einrichtung durch.

Ergebnisse

Mäuse, denen orthotopische Krebszellen implantiert wurden, wurden wöchentlich durch μCT-Scans überwacht. Am Ende des Experiments wurden die Tiere eingeschläfert. Darm, Blinddarm (Abbildung 1A, B), Leber, Lunge und alle anderen möglichen Läsionen wurden gesammelt, in eine Kassette gegeben und über Nacht mit 4% Formalin fixiert. Als Kontrolle wurde Darmgewebe einer Maus ohne Tumor im Blinddarm verwendet (Abbildung 1C). Schließlich wurden ...

Diskussion

In den letzten Jahrzehnten wurden viele neue Krebstherapien entwickelt und an Patienten mit verschiedenen Tumorarten, einschließlich Darmkrebs (CRC), getestet. Obwohl in präklinischen Modellen in vielen Fällen vielversprechende Ergebnisse beobachtet wurden, war die therapeutische Wirksamkeit bei Patienten mit fortgeschrittenem metastasiertem Darmkrebs häufig eingeschränkt. Daher besteht ein dringender Bedarf an präklinischen Modellen, die es ermöglichen, die Wirksamkeit neuer therapeutischer Medikamente in einem k...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
Apo-Transferrin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	T1147-500MG
B27 Supplement	Life Technologies S.A (Spain)	17504044
Chlorhexidine Aqueous Solution 2%	DH MATERIAL MÉDICO, S.L.	1111696250
Collagenase	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	C0130-500MG
D-(+)-Glucose	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	G6152
DMEM /F12	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	21331-020
DNase I	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	D4263-5VL
EGF	PEPRO TECH EC LTD.	AF-100-15-500 µg
FGF basic	PEPRO TECH EC LTD.	100-18B
Fungizone	Life Technologies S.A (Spain)	15290026
Gentamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15750037
Heparin Sodium Salt	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	H4784-250MG
Insulin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	I9278-5ML
Iopamiro
Isoflurane	-	-
Kanamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15160047
L-Glutamine	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	25030032
Matrigel Matrix	CULTEK, S.L.U.	356235/356234/354234
Metacam, 5 mg/mL	-	-
Non-essential amino acids	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11140035
Nystatin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	N4014-50MG
Pen/Strep	Life Technologies S.A (Spain)	15140122
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile	Labclinics S.A	L0615-500
Progesterone	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P0130-25G
Putrescine	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P5780-5G
RBC Lysis Buffer	Labclinics S.A	00-4333-57
Sodium Pyruvate	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11360039
Sodium Selenite	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	S5261-25G
ESSENTIAL SUPPLIES
8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice	-	-
BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm	BECTON DICKINSON, S.A.U.	320926
Blade #24	-	-
Cell Strainer 100 µm	Cultek, SLU	45352360
Forceps and Surgical scissors	-	-
Heating pad	-	-
Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel	-	-
Surfasafe	-	-
Suture PROLENE 5-0	JOHNSON&JOHNSON S, A.	8720H
EQUIPMENT/SOFTWARE
Quantum FX µCT Imaging system	Perkin Elmer	Perkin Elmer	http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083