Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Özet

Bu protokol, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu açıklar. Model, ilerlemiş kolorektal kanser metastatik hastalığını özetler ve klinik olarak anlamlı bir akciğer ve karaciğer metastazı senaryosunda yeni terapötik ilaçların değerlendirilmesine izin verir.

Özet

Son on yılda, hasta kaynaklı kanser hücreleri ve 3D tümöroidler kullanılarak daha karmaşık klinik öncesi kolorektal kanser (KRK) modelleri oluşturulmuştur. Hasta kaynaklı tümör organoidleri orijinal tümörün özelliklerini koruyabildiğinden, bu güvenilir preklinik modeller kanser ilacı taramasını ve ilaç direnç mekanizmalarının incelenmesini sağlar. Bununla birlikte, hastalarda KRK'ye bağlı ölüm çoğunlukla metastatik hastalık varlığı ile ilişkilidir. Bu nedenle, anti-kanser tedavilerinin etkinliğini, insan kanseri metastazının temel moleküler özelliklerini gerçekten özetleyen ilgili in vivo modellerde değerlendirmek önemlidir. CRC hastadan türetilen kanser hücrelerinin doğrudan farelerin çekum duvarına enjekte edilmesine dayanan bir ortotopik model oluşturduk. Bu tümör hücreleri, çekumda karaciğer ve akciğerlere metastaz yapan primer tümörler geliştirir ve bu durum ilerlemiş KRK'li hastalarda sıklıkla görülür. Bu CRC fare modeli, hastalarda primer tümörleri veya metastazları kolayca tanımlayabilen, klinik olarak anlamlı küçük ölçekli bir görüntüleme yöntemi olan mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) ile izlenen ilaç yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerini implante etmek için cerrahi prosedürü ve gerekli metodolojiyi açıklıyoruz.

Giriş

Kolorektal kanser (KRK), dünya çapında kanser ölümlerinin ikinci önde gelen nedenidir¹. Bireysel hasta tümör hücrelerinden türetilen in vitro veya in vivo tümör modelleri üretme yeteneği, onkolojide gelişmiş hassas tıbba sahiptir. Son on yılda, hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) veya ksenogreftler (PDX'ler) dünya çapında birçok araştırma grubu tarafından kullanılmıştır². PDO'lar, orijinal tümör dokusunun özelliklerine benzeyen, kendi kendini organize edebilen ve yenileyebilen çok hücreli in vitro yapılardır³. Bu umut verici in vitro modeller, ilaç taraması ve translasyonel araştırmaları kolaylaştırmak için başarıyla kullanılabilir. Öte yandan, PDX modelleri, orijinal CRC'yi histolojiden moleküler özelliklere ve ilaç yanıtına^{kadar ilgili} tüm seviyelerde aslına uygun olarak özetlemektedir ^2,4.

İn vivo PDX modelleri çoğunlukla immün yetmezliği olan farelerde deri altı tümörler olarak büyütülür. Bu yaklaşımı kullanarak, PDX'ler, özellikle ilaç duyarlılığını veya direncini incelemek için kanser araştırmalarında altın standart haline gelmiştir. Bununla birlikte, KRK ile ilişkili ölümler çoğunlukla karaciğer, akciğer veya periton boşluğunda metastatik lezyonların varlığı ile ilişkilidir ve iki yaklaşımın hiçbiri (PDO veya PDX) ileri klinik ortamı özetleyemez. Ek olarak, spesifik tümör büyüme bölgesinin, ilaç etkinliği ve hastalık prognozu üzerinde etkisi olan önemli biyolojik özellikleri belirlediği gösterilmiştir². Bu nedenle, klinik olarak anlamlı bir metastatik ortamda antikanser ilaçların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilecek klinik öncesi modellerin oluşturulmasına acil bir ihtiyaç vardır⁶.

Mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) tarayıcıları, kanser hastalarının BT görüntüleriyle orantılı ölçekli bir görüntü çözünürlüğünde farelerde primer tümör ve metastaz görüntülemesi sağlayan küçültülmüş klinik BT tarayıcıları olarak işlev görebilir⁷. μCT tekniğinin zayıf yumuşak doku kontrastına karşı koymak için, kontrastı iyileştirmek ve tümör yükünü değerlendirmek için radyolojik iyotlu kontrast ajanlar kullanılabilir. İkili kontrast yaklaşımı kullanılarak, oral ve intraperitoneal iyot farklı zamanlamalarda uygulanır. Ağızdan uygulanan kontrast, bağırsak içindeki tümör dokusu ve çekum içeriği arasındaki sınırları tanımlamaya yardımcı olur.  Öte yandan, intraperitoneal olarak uygulanan kontrast, sıklıkla büyüyen ve peritonu invaze eden tümör kitlesinin dış sınırlarının belirlenmesine olanak tanır⁸.

Makale, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu gerçekleştirmek için bir protokolü ve μCT taraması kullanarak bağırsak tümörü büyümesini izleme metodolojisini açıklamaktadır. Bu makale, modelin PDO veya PDXO modelleri kullanılarak çalışılamayan KRK hastalarında ileri intestinal tümörler ve metastatik hastalıkların klinik senaryosunu özetlediğini göstermektedir. KRK'nin ortotopik PDX modelleri, KRK hastalarının klinik senaryosunu özetlediğinden, ileri intestinal tümörlerde ve metastatik hastalıkta anti-tümöral ilaçların etkinliğini test etmek için bugüne kadarki en iyi modeller oldukları sonucuna vardık.

Protokol

Tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Proje, Barselona, İspanya'daki Vall d'Hebron Üniversite Hastanesi Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (onay kimliği: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). İnsan kolon dokusu örnekleri, tümör rezeksiyonu yapılan kolon ve rektum kanserli hastalara karşılık gelen primer adenokarsinomların veya karaciğer metastazlarının nekrotik olmayan alanlarından alınan biyopsilerden oluşuyordu. Deneyler, Avrupa Birliği'nin hayvan bakımı direktifine (86/609/EEC) uygun olarak gerçekleştirilmiş ve VHIR-Vall d'Hebron Araştırma Enstitüsü Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA ve 12/18 CEEA) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Dişi NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid / NcrCrl) 8 haftalık fareler Charles River Laboratuvarlarından satın alındı.

1. Hasta hücrelerinin türetilmesi

1. Tümör ekstraksiyonu
   NOT: Aşağıdaki prosedür, hayvan tesisinde oda sıcaklığında (RT) biyolojik bir kabinde gerçekleştirilir.
   1. Hastaların ameliyatlarından veya biyopsilerinden ve farelerde deri altından büyüyen PDX'lerden tümör örnekleri alın.
   2. Ortotopik enjeksiyon için, doğrudan hastalardan elde edilen doku yerine yerleşik deri altı PDX tümör modellerinden tümör hücrelerini hazırlayın⁹.
   3. NOD-SCID^farelerinin 2 yan tarafında deri altından Matrigel matrisi (50 μL) ile karıştırılmış fosfat tamponlu salin (PBS) (50 μL) içinde 1 x 10⁵ tümör hücresinin bir süspansiyonunu aşılayarak PDX tümörleri oluşturun.
      1. Her gün bir kumpas kullanarak tümör büyümesini ölçün.
         NOT: Daha da önemlisi, laboratuvarımız 350'den fazla PDX modelinden oluşan bir biyobanka oluşturmuştur. Protokolde kullanılan CRC-PDX tümör modelleri, farelerde üçten fazla pasajdan daha fazla amplifiye edilmiş ve dahil etme/dışlama kriterlerini pozitif sonuçla geçmiş laboratuvarda yerleşik PDX modelleridir (Tablo 1).
   4. Deri altı tümörler CEEA tarafından belirlenen maksimum boyuta (1 cm çap) ulaştığında veya hayvanlar son nokta kriterlerine ulaştığında fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın.
   5. Tümörü çıkarın ve makas ve forseps kullanarak deriden ve çevresindeki tümör olmayan dokudan dikkatlice çıkarın.
   6. Hasat edilen tümörleri bir sonraki adıma kadar PBS'de 4 °C'de saklayın.
      NOT: Hücre süspansiyonundaki tümörleri, farelerde hastaların lezyonlarında veya deri altı ksenogreftlerinde orijinal konumlarından çıkarıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede ayırın. Doku çıkarıldıktan 24 saat sonra hücre canlılığı önemli ölçüde azalır ve bu da alıcı farelerde verimsiz bir implantasyona neden olur.
2. Hücre hazırlığı
   NOT: Aşağıdaki prosedür, doku kültürü odasında oda sıcaklığında (RT) biyolojik bir kabinde gerçekleştirilir.
   1. 10 cm'lik bir kültür plakasında 1 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı (Tablo 2) içeren bir bıçak kullanarak tümörleri ayırın (kıymayı kolaylaştırmak için). Homojen ayrışmış numuneyi 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
   2. 5 mL'lik bir son hacme tam CoCSCM 6Ab ortamı ekleyin (aynı tüpte 3 mL'den fazla ayrışmış numune kullanmayın).
      NOT: Hastalardan alınan primer KRK'ler doğal olarak bakteri ve mantar ile kontamine olur. Orijinal hasta örneğinde bulunan patojenlerin altı antibiyotikten (penisilin, streptomisin, mantar zonu, kanamisin, gentamisin ve nistatin) oluşan bir kokteyl kullanılarak uzaklaştırılması esastır. İmmün yetmezliği olan farelerde bakterilerle kontamine olmuş tümör hücrelerinin enjeksiyonu hayvan ölümüne neden olabilir.
   3. 50 μL DNaz I (0.08 kU/mL) ve 50 μL kollajenaz (1.5 mg/mL) (sindirim ortamı; Tablo 2) bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat boyunca, 45 ° pozisyonda. İnkübasyondan önce çözeltiyi her 15 dakikada bir 5 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın.
      NOT: Tümör dokusunu ayırın ve tek bir hücre çözeltisi elde etmek için birkaç kez pipetleyerek sindirin. Bu, alıcı farelere enjekte edilmeden önce hücrelerin sayılması ve dolayısıyla tümör hücrelerinin homojen bir implantasyonunun elde edilmesi için gereklidir.
   4. 5 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı ekleyin ve 5 mL'lik bir pipetle iyice karıştırın.
   5. Çözeltiyi 100 μm'lik bir hücre süzgeci ile yeni bir steril 50 mL tüp kullanarak sıralayın.
   6. Sıralanan hücreleri RT'de 8 dakika boyunca 500 x g'de döndürün.
   7. Süpernatanı aspire edin.
   8. Peletin 3 mL 1x RBC lizis tampon çözeltisi içinde yeniden süspanse edilmesi.
   9. RT'de 10 dakika inkübe edin.
   10. 3 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı ekleyin, numuneyi pipetleyin ve RT'de 10 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
   11. Peletleri 5-10 mL tam CoCSCM 6Ab ortamı ile yeniden süspanse edin ve toplam hücre sayısını hesaplamak için bir hücre sayacı kullanın.
   12. Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün ve 10 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
   13. 20 x 10⁶ hücre/mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için peleti yeniden süspanse edin ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için iyice karıştırın.
   14. Doku kültüründe çekum enjeksiyonu için 29 G şırınga (0,5 mL U 100 iğne, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) hazırlayın (bir şırınga/fare). Şırıngaya 50 μL tümör hücresi süspansiyonu (1 x 10⁶ hücre/enjeksiyon) yükleyin ve buz üzerinde tutun. Hücre süspansiyonundan hava kabarcıklarının çıkarıldığından emin olun.
       NOT: Tümör hücreleri şırıngaya yüklendiğinde hava kabarcıklarının ortadan kaldırılması, çekum duvarına doku yırtılmasına ve numune kaybına neden olabilecek aşırı hacim enjeksiyonunu önlemek için önemlidir. Aynı deneyde fareler arasında eşit olmayan tümör boyutundan kaçınmak için şırıngayı yüklerken hücre süspansiyonunu iyice karıştırmak zorunludur.

2. Çekumda ortotopik enjeksiyon

NOT: Aşağıdaki prosedür, hayvan tesisindeki belirli bir patojen içermeyen (SPF) odada bir tezgah üzerinde gerçekleştirilir. Kullanılan ekipman önceden temizlenir ve sterilize edilir. Ek olarak, hayvan tesisindeki bireyler veya bölgeler arasında portatif bir sterilizatörde tekrar sterilize edilir.

1. Ameliyat bölgesini dezenfekte edici deterjan püskürterek ve silerek temizleyin.
2. Bir fare epilasyon makinesi kullanarak farelerin karnını epilasyon yapın.
3. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Hayvanı uyuşturmak için% 2 izofluran kullanın. Ekstremiteyi hafifçe sıkıştırarak ve stimülasyon yokluğunu gözlemleyerek anestezinin etkisini onaylayın.
4. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için gözlere 50-100 μL damla veteriner merhemi (3 mg/g Lacryvisc) damlatın.
5. Dairesel hareketlerle birkaç kez klorheksidin veya povidon-iyot ile ovalayarak fare karnını dezenfekte edin.
6. Ameliyat makası kullanarak alt karın üzerinde 1 cm uzunlamasına bir kesi yapın. Derinin altındaki peritonu sunmak için cildi her bölgeye dikkatlice ayırın.
7. Periton zarında çekumu dışlayacak kadar büyük 0,5-1 cm'lik bir kesi yapın.
   NOT: İç organları aşırı derecede manipüle etmeden çekumu dıştan çıkarın, bu da prosedürün ölümcüllüğünü önemli ölçüde artırabilir.
8. Önceden kesilmiş, steril bir gazlı bez kullanarak çekumu fareden dikkatlice izole edin.
9. Tüm prosedür boyunca çekumu tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin.
10. Cecumu forseps ile dikkatlice tutarak hareketsiz hale getirin ve iğneyi yüzeysel olarak çekum duvarına sokun. Enjeksiyon bölgesindeki kılcal damarlardan ve damarlardan kaçının. Hücre süspansiyonundaki kabarcıkları çıkarın.
11. 50μL tümör hücresi süspansiyonunun tamamını yavaşça enjekte edin. Genellikle uygulanması yaklaşık 10 saniye sürer. Çekum lümenini iğne ile delmekten kaçının, çünkü bu, tümör hücresi süspansiyonunun bağırsak peristaltizmi yoluyla vücuttan atılmasıyla sonuçlanır.
    NOT: Tümör hücresi süspansiyonunun farelerin çekumuna enjekte edilmesi, tüm prosedürün en zorlu adımıdır. Protokolün bu bölümünde enjeksiyon bölgesine odaklanmış parlak bir ışık ve büyüteç kullanılmalıdır. İğneyi çekum yüzeyine paralel olarak yerleştirin. Çekum çok kırılgan bir dokudur; Bu nedenle, çekumun immobilizasyonu cerrahi forseps kullanılarak ve kanama ile sonuçlanan doku yırtılmasını önlemek için hafif basınç uygulanarak yapılmalıdır. Başarılı implantasyon, çekum duvarında beyaz bir kabarcık (hücre peleti) ile sonuçlanır. Kabarcık görselleştirilemiyorsa, çekumun delindiğini ve hücrelerin çekum lümeninde sona erdiğini ve bağırsak yolu tarafından temizlenmelerine neden olduğunu gösterebilir.
12. Enjeksiyondan sonra, tümör hücrelerinin kaçmasını önlemek ve hafif kanamayı azaltmak için iğneyi çekumdan yavaşça çıkarın ve enjeksiyon bölgesine pamuk uçlu bir aplikatör ile hafif bir baskı uygulayın.
13. Kalıntıları gidermek için çekumu tuzlu su çözeltisiyle temizleyin.
14. Çekumu hayvanın karnına geri koyun.
15. 5/0 sütür kullanarak peritonu kapatın.
16. Karın derisini 5/0 dikişlerle kapatın.
17. Ameliyat sonrası antibiyotikler (100 mg/kg amoksisilin veya 20 mg/kg enrofloksasin) ve analjezikler (5 mg/mL metacam/meloksikam) subkutan enjeksiyonla uygulanır. Fareleri bir ısıtma yastığına yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar orada tutun. Ardından, onları diğer hayvanlarla birlikte kafese geri koyun.

3. μCT taraması kullanılarak ortotopik tümör büyümesinin değerlendirilmesi

NOT: Aşağıdaki prosedür, hayvan tesisinden klinik öncesi görüntüleme platformunda (PIP) gerçekleştirilir.

1. Tüm hayvan işlemlerini kurumsal etik kurul düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirir.
2. Hücre enjeksiyonundan 2 hafta sonra ve daha sonra her hafta μCT ile tümör hacmini izlemeye başlayın.
3. Kontrast madde iopamiro'yu (300 mg / mL) salin çözeltisi içinde, her iki doz için de 3: 1 oranında taze olarak seyreltin. Oral gavaj ile 300 mL iopamiro uygulayın.
   NOT: μCT'nin zayıf yumuşak doku kontrastı nedeniyle, tekniğin hassasiyetini artırmak için bir kontrast madde önerilir. Protokol, intraluminal tümör yükünü sınırlamak için iyot bazlı bir ajanın (iopamiro) oral uygulamasını ve bağırsağın viseral yüzündeki tümör yükünü tanımlamak için aynı ajanın ikincil intraperitoneal uygulamasını içerir. Kontrast maddenin eliminasyonundan önce farelerin çekumuna ulaşması gereken tam zamanı belirlemek için daha önce pilot deneyler yapılmıştır. Iopamiro durumunda, yaklaşık 2 saattir.
4. 2 saat sonra, 300 mL önceden seyreltilmiş iopamiro intraperitoneal enjeksiyonu uygulayın. Uygulama, parietal yüzdeki tümör sınırlarını tanımlamaya yardımcı olur.
5. % 2 izofluran kullanarak hayvanları uyuşturun.
6. Farenin ayağını sıkıştırarak hayvanın doğru şekilde uyuşturulduğunu onayladıktan sonra, hayvanı μCT'nin tarama yatağına yerleştirin. En iyi pozisyon sırtüstüdür (yüzü yukarı).
7. Kontrol yazılımında, karın bölgesini tarayıcının görüş alanına (FOV) yerleştirmek için canlı modu (floroskopi modu) başlatın. Bunu yapmak için, istenen pozisyon elde edilene kadar yatağı ileri, geri ve yanal olarak hareket ettirin. X-ışını tüpünü ve dedektörü 90° döndürün ve hayvanı tamamen ortalamak için tarama yatağını y ekseninde hareket ettirin.
8. Bir FX μCT görüntüleme sistemi kullanarak μCT tarama görüntüleri için aşağıdaki parametreleri kullanın: 30 mm FOV, 26 sn çekim süresi, 90 kV akım voltajı ve 200 μA akım amperajı.
9. Tarama bittiğinde hayvanları iyileşmek için kafeslerine geri koyun. Termal destek sağlayın ve barınağa dönmeden önce anesteziden kurtulana kadar hayvanları izleyin.
10. μCT alımı, her tarama için 250 Mb boyutunda bir dosya verir. Oluşturulan veri dosyaları bir VOX formatına sahiptir. Herhangi bir görüntüleme analiz yazılımı için erişilebilir hale getirmek için, μCT'nin veritabanı yönetim yazılımını kullanarak dosyaları DICOM formatına dönüştürün. Oluşturulan dosya grubunu, mevcut görüntüleme yazılımına sahip herhangi bir bilgisayarı kullanarak analiz etmek için taşınabilir bir sabit diskte saklayın.
    NOT: Görüntü analizi sırasında çekum, sıklıkla kaudal karnın sol tarafında, radyoyoğun içeriğe (iopamiro) sahip genişlemiş bir bağırsak olarak lokalizedir. Çekumun visseral fleksurunda, komşu bağırsak bölgelerine göre bir duvar kalınlaşması gözlenir. Kalınlaşma, tümör büyümesine karşılık gelir.
11. Tümör lokalize olduktan sonra, farklı görünümlerde (aksiyal, koronal ve sagital) en yüksek çapı bulun. Bu üç ekseni ölçün ve elipsoid formülünü izleyerek tümör hacmini hesaplayın: hacim = 4/3π x (x-yarı eksenli x y-yarı eksenli x z-yarı eksen)¹⁰.

4. Ortotopik tümör taşıyan farelerde terapötik müdahale

1. Ortotopik tümörleri taşıyan fareleri haftalık olarak izleyin.
2. Farelerin çoğunda bir tümör μCT tarama sinyali tespit edildiğinde, tümörün varlığını doğrulamak için ertesi hafta başka bir μCT taraması yapın.
   NOT: Tedaviye başlama süresi kullanılan PDX modeline bağlıdır ve çekumda tümör hücresi inokülasyonundan 3-12 hafta sonra değişir.
3. Fareleri dört gruba randomize edin: bir araç grubu (n = 10-15 fare), bir test ilaç grubu (n = 10-15 fare), standart bir bakım kemoterapi grubu (n = 10-15 fare) ve bir kombinasyon tedavi grubu (n = 10-15 fare).
4. Fareleri intraperitoneal olarak salin (araç grubu), test ilacı (20 mg / kg) (test ilaç grubu), irinotekan (50 mg / kg) (standart bakım grubu) veya test ilacı (20 mg / kg) irinotekan (50 mg / kg) (kombinasyon tedavi grubu). Deneyin sonuna kadar uygulamayı haftada bir kez gerçekleştirin.
5. Deney boyunca μCT taraması ile tümör büyümesini haftalık olarak izleyin.
6. Deneyin sonunda, fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın ve karaciğerleri, akciğerleri ve diğer organlardaki diğer olası lezyonları toplayın.
7. Doku örneklerini kasetlere dahil edin ve gece boyunca% 4 formalin içinde inkübe edin. Kontrol olarak çekumda tümör olmayan bir fareden alınan bağırsak dokusunu kullanın.
8. Kasetleri formalinden çıkarın ve en az 3 saat% 70 etanol ile inkübe edin.
9. Histopatoloji tesisi standart protokollerini kullanarak kasetleri parafin ile gömün.
10. Histopatoloji tesisi standart protokollerini kullanarak çekum, karaciğer ve akciğerden hematoksilen ve eozin (H & E) boyaması gerçekleştirin.

Sonuçlar

Hastadan türetilen kanser hücreleri ile ortotopik olarak implante edilen fareler, μCT taraması ile haftalık olarak izlendi. Deneyin sonunda hayvanlara ötenazi uygulandı. Bağırsaklar, çeka (Şekil 1A,B), karaciğerler, akciğerler ve diğer olası lezyonlar toplandı, bir kasete dahil edildi ve gece boyunca %4 formalin ile tespit edildi. Çekumda tümör saptanmayan bir fareden alınan bağırsak dokusu kontrol olarak kullanıldı (Şekil 1C

Tartışmalar

Son birkaç on yılda, kolorektal kanser (KRK) dahil olmak üzere farklı tümör tiplerine sahip hastalarda birçok yeni anti-kanser tedavisi geliştirilmiş ve test edilmiştir. Birçok vakada klinik öncesi modellerde umut verici sonuçlar gözlenmesine rağmen, ileri metastatik KRK'li hastalarda terapötik etkinlik sıklıkla sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, klinik olarak anlamlı bir metastatik senaryoda yeni terapötik ilaçların etkinliğinin test edilmesine izin veren klinik öncesi modellere acil bir ihtiya...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
Apo-Transferrin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	T1147-500MG
B27 Supplement	Life Technologies S.A (Spain)	17504044
Chlorhexidine Aqueous Solution 2%	DH MATERIAL MÉDICO, S.L.	1111696250
Collagenase	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	C0130-500MG
D-(+)-Glucose	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	G6152
DMEM /F12	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	21331-020
DNase I	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	D4263-5VL
EGF	PEPRO TECH EC LTD.	AF-100-15-500 µg
FGF basic	PEPRO TECH EC LTD.	100-18B
Fungizone	Life Technologies S.A (Spain)	15290026
Gentamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15750037
Heparin Sodium Salt	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	H4784-250MG
Insulin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	I9278-5ML
Iopamiro
Isoflurane	-	-
Kanamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15160047
L-Glutamine	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	25030032
Matrigel Matrix	CULTEK, S.L.U.	356235/356234/354234
Metacam, 5 mg/mL	-	-
Non-essential amino acids	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11140035
Nystatin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	N4014-50MG
Pen/Strep	Life Technologies S.A (Spain)	15140122
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile	Labclinics S.A	L0615-500
Progesterone	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P0130-25G
Putrescine	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P5780-5G
RBC Lysis Buffer	Labclinics S.A	00-4333-57
Sodium Pyruvate	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11360039
Sodium Selenite	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	S5261-25G
ESSENTIAL SUPPLIES
8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice	-	-
BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm	BECTON DICKINSON, S.A.U.	320926
Blade #24	-	-
Cell Strainer 100 µm	Cultek, SLU	45352360
Forceps and Surgical scissors	-	-
Heating pad	-	-
Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel	-	-
Surfasafe	-	-
Suture PROLENE 5-0	JOHNSON&JOHNSON S, A.	8720H
EQUIPMENT/SOFTWARE
Quantum FX µCT Imaging system	Perkin Elmer	Perkin Elmer	http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083