L’implantation orthotopique de cellules cancéreuses dérivées de patients chez la souris récapitule le cancer colorectal avancé

Résumé

Ce protocole décrit l’implantation orthotopique de cellules cancéreuses dérivées de patients dans la paroi du caecum de souris immunodéficientes. Le modèle récapitule la maladie métastatique du cancer colorectal avancé et permet l’évaluation de nouveaux médicaments thérapeutiques dans un scénario cliniquement pertinent de métastases pulmonaires et hépatiques.

Résumé

Au cours de la dernière décennie, des modèles précliniques plus sophistiqués de cancer colorectal (CCR) ont été établis à l’aide de cellules cancéreuses dérivées de patients et de tumoroïdes 3D. Étant donné que les organoïdes tumoraux dérivés du patient peuvent conserver les caractéristiques de la tumeur d’origine, ces modèles précliniques fiables permettent le dépistage des médicaments anticancéreux et l’étude des mécanismes de résistance aux médicaments. Cependant, la mortalité liée au CCR chez les patients est principalement associée à la présence d’une maladie métastatique. Il est donc essentiel d’évaluer l’efficacité des thérapies anticancéreuses dans des modèles in vivo pertinents qui récapitulent véritablement les principales caractéristiques moléculaires des métastases cancéreuses humaines. Nous avons établi un modèle orthotopique basé sur l’injection de cellules cancéreuses dérivées de patients atteints de CCR directement dans la paroi du caecum de souris. Ces cellules tumorales développent des tumeurs primaires dans le caecum qui métastasent dans le foie et les poumons, ce qui est fréquemment observé chez les patients atteints d’un CCR avancé. Ce modèle murin de CCR peut être utilisé pour évaluer les réponses aux médicaments surveillées par microtomodensitométrie (μCT), une méthode d’imagerie à petite échelle cliniquement pertinente qui permet d’identifier facilement les tumeurs primaires ou les métastases chez les patients. Nous décrivons ici l’intervention chirurgicale et la méthodologie requise pour implanter des cellules cancéreuses dérivées du patient dans la paroi du caecum de souris immunodéficientes.

Introduction

Le cancer colorectal (CCR) est la deuxième cause de décès par cancer dans le monde¹. La capacité de générer des modèles tumoraux in vitro ou in vivo dérivés de cellules tumorales individuelles de patients a fait progresser la médecine de précision en oncologie. Au cours de la dernière décennie, les organoïdes dérivés de patients (PDO) ou les xénogreffes (PDX) ont été utilisés par de nombreux groupes de recherche à travers le monde². Les AOP sont des structures multicellulaires in vitro qui ressemblent aux caractéristiques du tissu tumoral d’origine et peuvent s’auto-organiser et s’auto-renouveler³. Ces modèles in vitro prometteurs peuvent être utilisés avec succès pour le criblage de médicaments et faciliter la recherche translationnelle. D’autre part, les modèles PDX récapitulent fidèlement le CCR original à tous les niveaux pertinents, de l’histologie aux traits moléculaires et à la réponse aux médicaments ^2,4.

In vivo Les modèles PDX sont principalement cultivés sous forme de tumeurs sous-cutanées chez les souris immunodéficientes. Grâce à cette approche, les PDX sont devenus l’étalon-or de la recherche sur le cancer, en particulier pour l’étude de la sensibilité ou de la résistance aux médicaments. Cependant, les décès liés au CCR sont principalement associés à la présence de lésions métastatiques dans le foie, le poumon ou la cavité péritonéale, et aucune des deux approches (PDO ou PDX) ne peut récapituler le cadre clinique avancé. De plus, il a été démontré que le site spécifique de la croissance tumorale détermine des caractéristiques biologiques importantes qui ont un impact sur l’efficacité des médicaments et le pronostic de la maladie². Par conséquent, il est urgent d’établir des modèles précliniques qui peuvent être utilisés pour évaluer l’efficacité des médicaments anticancéreux dans un contexte métastatique cliniquement pertinent⁶.

Les tomodensitomètres (μCT) peuvent fonctionner comme des tomodensitomètres cliniques réduits, fournissant une imagerie des tumeurs primaires et des métastases chez la souris à une résolution d’image à l’échelle proportionnelle à celle des images CT des patients atteints de cancer⁷. Pour contrer le faible contraste des tissus mous de la technique μCT, des agents de contraste iodés radiologiques peuvent être utilisés pour améliorer le contraste et évaluer la charge tumorale. À l’aide d’une approche à double contraste, l’iode par voie orale et intrapéritonéale est administré à des moments différents. Le produit de contraste administré par voie orale aide à définir les limites entre le tissu tumoral et le contenu en caecum à l’intérieur de l’intestin.  D’autre part, le produit de contraste administré par voie intrapéritonéale permet d’identifier les limites externes de la masse tumorale, qui se développe fréquemment et envahit le péritoine⁸.

Le manuscrit décrit un protocole pour effectuer l’implantation orthotopique de cellules cancéreuses dérivées de patients dans la paroi du caecum de souris immunodéficientes, et la méthodologie pour surveiller la croissance tumorale intestinale à l’aide de la tomodensitométrie. Le présent manuscrit montre que le modèle récapitule le scénario clinique des tumeurs intestinales avancées et des maladies métastatiques chez les patients atteints de CCR qui ne peuvent pas être étudiés à l’aide de modèles PDO ou PDXO. Étant donné que les modèles PDX orthotopiques du CCR récapitulent le scénario clinique des patients atteints de CCR, nous concluons qu’ils sont les meilleurs à ce jour pour tester l’efficacité des médicaments antitumoraux dans les tumeurs intestinales avancées et les maladies métastatiques.

Protocole

Le consentement éclairé écrit de tous les patients a été obtenu. Le projet a été approuvé par le Comité d’éthique de la recherche de l’hôpital universitaire Vall d’Hebron, Barcelone, Espagne (approbation ID : PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Les échantillons de tissus du côlon humain étaient des biopsies provenant de zones non nécrotiques d’adénocarcinomes primitifs ou de métastases hépatiques, correspondant à des patients atteints de cancer du côlon et du rectum ayant subi une résection tumorale. Les expériences ont été menées conformément à la directive de l’Union européenne sur les soins des animaux (86/609/CEE) et ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Institut de recherche VHIR-la Vall d’Hébron (ID : 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA et 12/18 CEEA).

REMARQUE : Femelle NOD-SCID (NOD. Des souris CB17-Prkdcscid/NcrCrl) âgées de 8 semaines ont été achetées aux laboratoires Charles River.

1. Dérivation des cellules du patient

1. Extraction de tumeurs
   REMARQUE : La procédure suivante est effectuée dans une armoire biologique à température ambiante (RT) dans l’animalerie.
   1. Obtenir des échantillons de tumeurs à partir de chirurgies ou de biopsies des patients et de PDX se développant par voie sous-cutanée chez la souris.
   2. Pour l’injection orthotopique, préparer les cellules tumorales à partir de modèles tumoraux PDX sous-cutanés établis au lieu de tissus obtenus directement chez les patients⁹.
   3. Générer des tumeurs PDX en inoculant une suspension de 1 x 10⁵ cellules tumorales dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (50 μL) mélangée à une matrice Matrigel (50 μL) par voie sous-cutanée dans le flanc de souris NOD-SCID².
      1. Mesurez la croissance tumorale à l’aide d’un pied à coulisse tous les deux jours.
         NOTE : Il est important de noter que notre laboratoire a généré une biobanque de plus de 350 modèles PDX. Les modèles de tumeurs CRC-PDX utilisés dans le protocole sont des modèles PDX établis en laboratoire qui ont été amplifiés plus de trois fois chez la souris et qui ont passé les critères d’inclusion/exclusion avec un résultat positif (tableau 1).
   4. Euthanasier les souris par luxation cervicale lorsque les tumeurs sous-cutanées atteignent la taille maximale établie par la CEEA (1 cm de diamètre), ou lorsque les animaux atteignent les critères finaux.
   5. Extrayez la tumeur et retirez-la soigneusement de la peau et des tissus non tumoraux environnants à l’aide de ciseaux et de pinces.
   6. Conservez les tumeurs prélevées dans du PBS à 4 °C jusqu’à l’étape suivante.
      REMARQUE : Dissocier les tumeurs en suspension cellulaire dès que possible après leur retrait de leur emplacement d’origine dans les lésions des patients ou les xénogreffes sous-cutanées chez la souris. La viabilité cellulaire est considérablement réduite 24 h après l’ablation des tissus, ce qui entraîne une implantation inefficace chez les souris receveuses.
2. Préparation des cellules
   REMARQUE : La procédure suivante est effectuée dans une armoire biologique à température ambiante (RT) dans la salle de culture tissulaire.
   1. Dissocier les tumeurs à l’aide d’une lame dans une plaque de culture de 10 cm avec 1 mL de milieu CoCSCM 6Ab complet (tableau 2) (pour faciliter le hachage). Placer l’échantillon dissocié homogène dans un tube conique de 15 ml.
   2. Ajouter le milieu CoCSCM 6Ab complet jusqu’à l’obtention d’un volume final de 5 mL (ne pas utiliser plus de 3 mL d’échantillon dissocié dans le même tube).
      REMARQUE : Le CCR primaire réséqué chez les patients est naturellement contaminé par des bactéries et des champignons. Il est essentiel d’éliminer les agents pathogènes présents dans l’échantillon d’origine du patient à l’aide d’un cocktail de six antibiotiques (pénicilline, streptomycine, fongizone, kanamycine, gentamycine et nystatine). L’injection de cellules tumorales contaminées par des bactéries chez des souris immunodéficientes peut entraîner la mort de l’animal.
   3. Incuber avec 50 μL de DNase I (0,08 kU/mL) et 50 μL de collagénase (1,5 mg/mL) (milieu de digestion ; Tableau 2) pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire, à 45°. Bien mélanger la solution toutes les 15 min à l’aide d’une pipette de 5 mL avant l’incubation.
      REMARQUE : Dissocier le tissu tumoral et le digérer en pipetant plusieurs fois pour obtenir une solution unicellulaire. Ceci est essentiel pour compter les cellules avant l’injection chez les souris receveuses et ainsi obtenir une implantation homogène des cellules tumorales.
   4. Ajouter 5 mL de milieu CoCSCM 6Ab complet et bien mélanger avec une pipette de 5 mL.
   5. Trier la solution à l’aide d’un tamis cellulaire de 100 μm à l’aide d’un nouveau tube stérile de 50 ml.
   6. Faites tourner les cellules triées à 500 x g pendant 8 min à RT.
   7. Aspirer le surnageant.
   8. Remettre la pastille en suspension dans 3 mL de solution tampon de lyse des globules rouges 1x.
   9. Incuber pendant 10 min à RT.
   10. Ajouter 3 mL de milieu CoCSCM 6Ab complet, pipeter l’échantillon et essorer à 500 x g pendant 10 min à RT. Aspirer le surnageant.
   11. Remettre la pastille en suspension avec 5 à 10 mL de milieu CoCSCM 6Ab complet et utiliser un compteur de cellules pour calculer le nombre total de cellules.
   12. Faire tourner les cellules à 500 x g pendant 10 min à RT et les remettre en suspension dans 10 mL de PBS.
   13. Remettre la pastille en suspension pour obtenir une concentration de 20 x 10⁶ cellules/mL, et bien mélanger pour obtenir une suspension cellulaire homogène.
   14. Préparer des seringues de 29 G (aiguille U 100 de 0,5 mL, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) pour l’injection de caecum dans la culture tissulaire (une seringue/souris). Chargez 50 μL de la suspension de cellules tumorales (1 x 10⁶ cellules/injection) dans la seringue et maintenez-la sur glace. Assurez-vous que les bulles d’air sont éliminées de la suspension de la cellule.
       REMARQUE : L’élimination des bulles d’air lorsque les cellules tumorales sont chargées dans la seringue est essentielle pour éviter l’injection d’un volume excessif dans la paroi du caecum, ce qui pourrait entraîner une rupture des tissus et une perte d’échantillon. Il est impératif de bien mélanger la suspension cellulaire lors du chargement de la seringue pour éviter une taille tumorale inégale chez les souris d’une même expérience.

2. Injection orthotopique dans le caecum

REMARQUE : La procédure suivante est effectuée sur une paillasse dans une salle exempte d’agents pathogènes spécifiques (SPF) à l’animalerie. Le matériel utilisé est préalablement nettoyé et stérilisé. De plus, il est stérilisé à nouveau dans un stérilisateur portatif entre les individus ou les zones de l’animalerie.

1. Nettoyez le site chirurgical en vaporisant un détergent désinfectant et en essuyant.
2. Épilez l’abdomen de la souris à l’aide d’une machine d’épilation de souris.
3. Placez la souris en position couchée. Utilisez de l’isoflurane à 2 % pour anesthésier l’animal. Confirmez l’effet de l’anesthésie en pinçant doucement l’extrémité et en observant l’absence de stimulation.
4. Placez une goutte de 50 à 100 μL de pommade vétérinaire (3 mg/g de Lacryvisc) dans les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie.
5. Désinfectez l’abdomen de la souris en frottant plusieurs fois avec de la chlorhexidine ou de la povidone iodée dans un mouvement circulaire.
6. Faites une incision longitudinale de 1 cm sur le bas-ventre à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Séparez soigneusement la peau de chaque site pour présenter le péritoine qui se trouve sous la peau.
7. Faites une incision de 0,5 à 1 cm dans la membrane du péritoine, assez grande pour extérioriser le caecum.
   REMARQUE : Extérioriser le caecum sans manipuler excessivement les organes internes, ce qui pourrait augmenter considérablement la létalité de la procédure.
8. Isolez soigneusement le caecum de la souris à l’aide d’une gaze stérile prédécoupée.
9. Humidifiez le caecum avec une solution saline tout au long de la procédure.
10. Immobiliser le caecum en le saisissant soigneusement avec une pince et introduire l’aiguille superficiellement dans la paroi du caecum. Évitez les capillaires et les vaisseaux au site d’injection. Retirez les bulles de la suspension cellulaire.
11. Injectez lentement la totalité des 50 μL de suspension de cellules tumorales. Il faut généralement environ 10 s pour l’administrer. Évitez de perforer la lumière du caecum avec l’aiguille, car cela entraîne l’élimination de la suspension de cellules tumorales du corps par péristaltisme intestinal.
    REMARQUE : L’injection de la suspension de cellules tumorales dans le caecum des souris est l’étape la plus difficile de toute la procédure. Une lumière vive focalisée sur le site d’injection et une loupe grossissante doivent être utilisées dans cette partie du protocole. Introduisez l’aiguille parallèlement à la surface du caecum. Le caecum est un tissu très fragile ; Par conséquent, l’immobilisation du caecum doit être effectuée à l’aide d’une pince chirurgicale et en appliquant une légère pression pour éviter la rupture des tissus entraînant une hémorragie. Une implantation réussie se traduit par une bulle blanche (pastille de cellules) dans la paroi du caecum. Si la bulle ne peut pas être visualisée, cela peut indiquer que le caecum a été perforé et que les cellules se sont terminées dans la lumière du caecum, ce qui entraîne leur élimination par le tractus intestinal.
12. Après l’injection, retirez lentement l’aiguille du caecum et appliquez une légère pression sur le site d’injection avec un applicateur à embout en coton, pour éviter que les cellules tumorales ne s’échappent et réduire les légers saignements.
13. Nettoyez le caecum avec une solution saline pour éliminer tous les débris.
14. Remettez le caecum dans l’abdomen de l’animal.
15. Fermez le péritoine à l’aide de sutures 5/0.
16. Fermez la peau de l’abdomen à l’aide de sutures 5/0.
17. Administrer des antibiotiques postopératoires (100 mg/kg d’amoxicilline ou 20 mg/kg d’enrofloxacine) et des antalgiques (5 mg/mL de métacam/méloxicam) par injection sous-cutanée. Placez les souris sur un coussin chauffant et gardez-les là jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies. Ensuite, remettez-les dans la cage avec d’autres animaux.

3. Évaluation de la croissance tumorale orthotopique à l’aide de la tomodensitométrie μCT

REMARQUE : La procédure suivante est effectuée dans la plate-forme d’imagerie préclinique (PIP) de l’animalerie.

1. Effectuer toutes les procédures relatives aux animaux conformément aux règlements du comité d’éthique de l’établissement.
2. Commencez à surveiller le volume de la tumeur par μCT 2 semaines après l’injection de cellules, et toutes les semaines par la suite.
3. Diluer fraîchement l’agent de contraste iopamiro (300 mg/mL) dans une solution saline, dans un rapport de 3 :1 pour les deux doses. Administrer 300 mL d’iopamiro par gavage oral.
   REMARQUE : En raison du faible contraste des tissus mous du μCT, un agent de contraste est recommandé pour améliorer la sensibilité de la technique. Le protocole comprend l’administration orale d’un agent à base d’iode (iopamiro) pour délimiter la charge tumorale intraluminale, et l’administration intrapéritonéale secondaire du même agent pour définir la charge tumorale dans la face viscérale de l’intestin. Des expériences pilotes ont déjà été réalisées pour déterminer le temps exact dont l’agent de contraste a besoin pour arriver dans le caecum des souris avant son élimination. Dans le cas de iopamiro, c’est environ 2 h.
4. Après 2 h, administrer une injection intrapéritonéale de 300 mL d’iopamiro préalablement dilué. L’administration aide à définir les limites tumorales dans le visage pariétal.
5. Anesthésier les animaux avec de l’isoflurane à 2 %.
6. Après avoir vérifié que l’animal est correctement anesthésié en pinçant le pied de la souris, placez l’animal dans le lit de balayage du μCT. La meilleure position est le décubitus dorsal (face vers le haut).
7. Dans le logiciel de contrôle, démarrez le mode en direct (mode fluoroscopie) pour placer la zone abdominale dans le champ de vision (FOV) du scanner. Pour ce faire, déplacez le lit vers l’avant et vers l’arrière et latéralement jusqu’à ce que la position souhaitée soit atteinte. Faites pivoter le tube à rayons X et le détecteur de 90° et déplacez le lit de balayage sur l’axe des ordonnées pour centrer complètement l’animal.
8. Utilisez les paramètres suivants pour les images de balayage μCT : champ de vision de 30 mm, temps d’acquisition de 26 s, tension de courant de 90 kV et ampérage de courant de 200 μA, à l’aide d’un système d’imagerie μCT FX.
9. Remettez les animaux dans leurs cages pour qu’ils soient récupérés lorsque l’analyse est terminée. Fournir un soutien thermique et surveiller les animaux jusqu’à ce qu’ils se remettent de l’anesthésie avant de retourner au logement.
10. L’acquisition μCT permet d’obtenir un fichier d’une taille de 250 Mo pour chaque balayage. Les fichiers de données créés ont un format VOX. Afin de les rendre accessibles à tout logiciel d’analyse d’imagerie, convertissez les fichiers au format DICOM à l’aide du logiciel de gestion de base de données du μCT. Stockez le lot de fichiers créés sur un disque dur portable afin de les analyser à l’aide de n’importe quel ordinateur disposant d’un logiciel d’imagerie.
    REMARQUE : Lors de l’analyse de l’image, le caecum est localisé sous la forme d’un intestin dilaté avec un contenu radiodense (iopamiro), souvent dans le côté gauche de l’abdomen caudal. Dans la flexion viscérale du caecum, un épaississement de la paroi est observé, par rapport aux régions intestinales adjacentes. L’épaississement correspond à la croissance tumorale.
11. Une fois la tumeur localisée, trouvez le diamètre le plus élevé dans les différentes vues (axiale, coronaire et sagittale). Mesurez ces trois axes et calculez le volume de la tumeur en suivant la formule de l’ellipsoïde : volume = 4/3π x (x-demi-axe x y-demi-axe x z-demi-axe)¹⁰.

4. Intervention thérapeutique chez les souris porteuses de tumeurs orthotopiques

1. Surveillez les souris porteuses de tumeurs orthotopiques chaque semaine.
2. Lorsqu’un signal de scintigraphie μCT tumorale est détecté chez la plupart des souris, effectuez une autre scintigraphie μCT la semaine suivante pour confirmer la présence de la tumeur.
   REMARQUE : Le temps nécessaire pour commencer le traitement dépend du modèle PDX utilisé et varie de 3 à 12 semaines après l’inoculation des cellules tumorales dans le caecum.
3. Randomiser les souris en quatre groupes : un groupe de véhicules (n = 10 à 15 souris), un groupe de tests de médicaments (n = 10 à 15 souris), un groupe de chimiothérapie standard (n = 10 à 15 souris) et un groupe de traitement combiné (n = 10 à 15 souris).
4. Traiter les souris par voie intrapéritonéale avec une solution saline (groupe véhicule), le médicament d’essai (20 mg / kg) (groupe de médicament d’essai), l’irinotécan (50 mg / kg) (groupe de traitement standard) ou le médicament d’essai (20 mg / kg) avec l’irinotécan (50 mg / kg) (groupe de traitement combiné). Effectuez l’administration une fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience.
5. Surveillez la croissance tumorale chaque semaine par μCT tout au long de l’expérience.
6. À la fin de l’expérience, euthanasiez les souris par luxation cervicale et prélevez des foies, des poumons et toute autre lésion possible dans d’autres organes.
7. Inclure les échantillons de tissus dans des cassettes et les incuber dans du formol à 4 % pendant la nuit. Utilisez le tissu intestinal d’une souris sans tumeur dans le caecum comme témoin.
8. Retirer les cassettes du formol et les incuber avec de l’éthanol à 70 % pendant au moins 3 h.
9. Intégrez les cassettes avec de la paraffine, en utilisant les protocoles standard des installations d’histopathologie.
10. Effectuer la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) à partir du caecum, du foie et des poumons, en utilisant les protocoles standard des installations d’histopathologie.

Résultats

Des souris implantées orthotopiquement avec des cellules cancéreuses dérivées de patients ont été surveillées chaque semaine par μCT. À la fin de l’expérience, les animaux ont été euthanasiés. Les intestins, le cèca (Figure 1A,B), le foie, les poumons et toute autre lésion possible ont été recueillis, inclus dans une cassette et fixés avec du formol à 4 % pendant la nuit. Le tissu intestinal d’une souris sans tumeur dans le caecum a été utilisé comm...

Discussion

Au cours des dernières décennies, de nombreuses nouvelles thérapies anticancéreuses ont été développées et testées chez des patients atteints de différents types de tumeurs, y compris le cancer colorectal (CCR). Bien que des résultats prometteurs dans des modèles précliniques aient été observés dans de nombreux cas, l’efficacité thérapeutique chez les patients atteints d’un CCR métastatique avancé a souvent été limitée. Par conséquent, il y a un besoin urgent de modèles précliniques qui perm...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
Apo-Transferrin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	T1147-500MG
B27 Supplement	Life Technologies S.A (Spain)	17504044
Chlorhexidine Aqueous Solution 2%	DH MATERIAL MÉDICO, S.L.	1111696250
Collagenase	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	C0130-500MG
D-(+)-Glucose	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	G6152
DMEM /F12	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	21331-020
DNase I	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	D4263-5VL
EGF	PEPRO TECH EC LTD.	AF-100-15-500 µg
FGF basic	PEPRO TECH EC LTD.	100-18B
Fungizone	Life Technologies S.A (Spain)	15290026
Gentamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15750037
Heparin Sodium Salt	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	H4784-250MG
Insulin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	I9278-5ML
Iopamiro
Isoflurane	-	-
Kanamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15160047
L-Glutamine	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	25030032
Matrigel Matrix	CULTEK, S.L.U.	356235/356234/354234
Metacam, 5 mg/mL	-	-
Non-essential amino acids	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11140035
Nystatin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	N4014-50MG
Pen/Strep	Life Technologies S.A (Spain)	15140122
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile	Labclinics S.A	L0615-500
Progesterone	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P0130-25G
Putrescine	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P5780-5G
RBC Lysis Buffer	Labclinics S.A	00-4333-57
Sodium Pyruvate	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11360039
Sodium Selenite	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	S5261-25G
ESSENTIAL SUPPLIES
8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice	-	-
BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm	BECTON DICKINSON, S.A.U.	320926
Blade #24	-	-
Cell Strainer 100 µm	Cultek, SLU	45352360
Forceps and Surgical scissors	-	-
Heating pad	-	-
Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel	-	-
Surfasafe	-	-
Suture PROLENE 5-0	JOHNSON&JOHNSON S, A.	8720H
EQUIPMENT/SOFTWARE
Quantum FX µCT Imaging system	Perkin Elmer	Perkin Elmer	http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083