小鼠患者来源的癌细胞原位植入概括了晚期结直肠癌

摘要

该方案描述了在免疫缺陷小鼠盲肠壁中将患者来源的癌细胞原位植入。该模型概括了晚期结直肠癌转移性疾病，并允许在肺和肝转移的临床相关情况下评估新的治疗药物。

摘要

在过去的十年中，已经使用患者来源的癌细胞和 3D 类肿瘤建立了更复杂的临床前结直肠癌 （CRC） 模型。由于患者来源的肿瘤类器官可以保留原始肿瘤的特征，因此这些可靠的临床前模型能够进行癌症药物筛选和耐药机制研究。然而，患者中与结直肠癌相关的死亡主要与转移性疾病的存在有关。因此，在相关 体内 模型中评估抗癌疗法的疗效至关重要，这些模型真正概括了人类癌症转移的关键分子特征。我们建立了一个基于将CRC患者来源的癌细胞直接注射到小鼠盲肠壁中的原位模型。这些肿瘤细胞在盲肠中形成原发性肿瘤，并转移到肝脏和肺部，这在晚期结直肠癌患者中很常见。该CRC小鼠模型可用于评估显微计算机断层扫描（μCT）监测的药物反应，这是一种临床相关的小规模成像方法，可以轻松识别患者的原发性肿瘤或转移。在这里，我们描述了将患者来源的癌细胞植入免疫缺陷小鼠盲肠壁的外科手术和所需方法。

引言

结直肠癌 （CRC） 是全球癌症死亡的第二大原因¹.从个体患者肿瘤细胞中生成体外或体内肿瘤模型的能力推动了肿瘤学的精准医学发展。在过去的十年中，患者来源的类器官 （PDO） 或异种移植物 （PDX） 已被世界各地的许多研究小组使用²。PDO是多细胞体外结构，类似于原始肿瘤组织的特征，可以自组织和自我更新³。这些有前途的体外模型可以成功地用于药物筛选和促进转化研究。另一方面，PDX 模型忠实地概括了所有相关水平的原始 CRC，从组织学到分子性状和药物反应 ^2,4。

体内研究 PDX模型主要在免疫缺陷小鼠中作为皮下肿瘤生长。使用这种方法，PDX已成为癌症研究的金标准，特别是用于研究药物敏感性或耐药性。然而，结直肠癌相关死亡主要与肝脏、肺或腹膜腔中存在转移性病变有关，两种方法（PDO或PDX）都不能概括晚期临床情况。此外，肿瘤生长的特定部位已被证明可以确定对药物疗效和疾病预后有影响的重要生物学特征².因此，迫切需要建立临床前模型，用于评估抗癌药物....

研究方案

获得所有患者的书面知情同意书。该项目已获得西班牙巴塞罗那Vall d'Hebron大学医院研究伦理委员会的批准（批准编号：PR（IR）79/2009 PR（AG）114/2014，PR（AG）18/2018）。人类结肠组织样本包括来自原发性腺癌或肝转移的非坏死区域的活检，对应于接受肿瘤切除的结肠癌和直肠癌患者。实验按照欧盟的动物护理指令（86/609/EEC）进行，并得到了VHIR-Vall d'Hebron研究所动物实验伦理委员会的批准（ID：40/08 CEEA，47/08/10 CEEA和12/18 CEEA）。

注：女性 NOD-SCID （NOD.从Charles River Laboratories购买来自8周龄的CB17-Prkdcscid / NcrCrl）小鼠。

1. 患者细胞的衍生

1. 肿瘤提取
   注意：以下程序在动物设施的室温（RT）生物柜中进行。
   1. 从患者的手术或活检以及小鼠皮下生长的PDX中获取肿瘤样本。
   2. 对于原位注射，从已建立的皮下PDX肿瘤模型制备肿瘤细胞，而不是直接从患者⁹获得的组织。
   3. 通过将 1 x 10⁵ 个肿瘤细胞的悬浮液接种在与基质胶基质 （50 μL） 混合的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （50 μL） ....

结果

每周通过μCT扫描监测原位植入患者来源的癌细胞的小鼠。在实验结束时，动物被安乐死。收集肠、盲肠（图1A，B）、肝脏、肺和任何其他可能的病变，包括在盒中，并用4%福尔马林固定过夜。使用盲肠中没有肿瘤的小鼠的肠道组织作为对照（图1C）。最后，将盒更换为70%乙醇至少3小时并包埋石蜡。使用组织病理学设施标准方案对盲肠、肝?.......

讨论

在过去的几十年里，许多新的抗癌疗法已经在不同肿瘤类型的患者中开发和测试，包括结直肠癌（CRC）。尽管在许多病例中已经观察到临床前模型的有希望的结果，但晚期转移性结直肠癌患者的治疗效果经常受到限制。因此，迫切需要临床前模型，以测试新治疗药物在临床相关转移情况下的疗效。

该手稿详细描述了一种先进的CRC原位PDX模型，该模型基于将患者肿瘤细胞植入?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
Apo-Transferrin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	T1147-500MG
B27 Supplement	Life Technologies S.A (Spain)	17504044
Chlorhexidine Aqueous Solution 2%	DH MATERIAL MÉDICO, S.L.	1111696250
Collagenase	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	C0130-500MG
D-(+)-Glucose	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	G6152
DMEM /F12	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	21331-020
DNase I	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	D4263-5VL
EGF	PEPRO TECH EC LTD.	AF-100-15-500 µg
FGF basic	PEPRO TECH EC LTD.	100-18B
Fungizone	Life Technologies S.A (Spain)	15290026
Gentamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15750037
Heparin Sodium Salt	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	H4784-250MG
Insulin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	I9278-5ML
Iopamiro
Isoflurane	-	-
Kanamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15160047
L-Glutamine	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	25030032
Matrigel Matrix	CULTEK, S.L.U.	356235/356234/354234
Metacam, 5 mg/mL	-	-
Non-essential amino acids	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11140035
Nystatin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	N4014-50MG
Pen/Strep	Life Technologies S.A (Spain)	15140122
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile	Labclinics S.A	L0615-500
Progesterone	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P0130-25G
Putrescine	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P5780-5G
RBC Lysis Buffer	Labclinics S.A	00-4333-57
Sodium Pyruvate	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11360039
Sodium Selenite	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	S5261-25G
ESSENTIAL SUPPLIES
8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice	-	-
BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm	BECTON DICKINSON, S.A.U.	320926
Blade #24	-	-
Cell Strainer 100 µm	Cultek, SLU	45352360
Forceps and Surgical scissors	-	-
Heating pad	-	-
Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel	-	-
Surfasafe	-	-
Suture PROLENE 5-0	JOHNSON&JOHNSON S, A.	8720H
EQUIPMENT/SOFTWARE
Quantum FX µCT Imaging system	Perkin Elmer	Perkin Elmer	http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083