Ортотопическая имплантация раковых клеток, полученных от пациентов, у мышей повторяет прогрессирующий колоректальный рак

Резюме

Этот протокол описывает ортотопическую имплантацию раковых клеток пациента в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом. Модель повторяет прогрессирующее метастатическое заболевание колоректального рака и позволяет оценивать новые терапевтические препараты в клинически значимом сценарии метастазов в легких и печени.

Аннотация

За последнее десятилетие были созданы более сложные доклинические модели колоректального рака (КРР) с использованием раковых клеток, полученных от пациентов, и 3D-опухолей. Поскольку органоиды опухоли, полученные от пациента, могут сохранять характеристики исходной опухоли, эти надежные доклинические модели позволяют проводить скрининг лекарств от рака и изучать механизмы лекарственной устойчивости. Тем не менее, смерть, связанная с КРР, у пациентов в основном связана с наличием метастатического заболевания. Поэтому важно оценить эффективность противораковой терапии в соответствующих моделях in vivo , которые действительно повторяют ключевые молекулярные особенности метастазирования рака у человека. Мы создали ортотопическую модель, основанную на инъекции раковых клеток, полученных от пациентов с КРР, непосредственно в стенку слепой кишки мышей. Эти опухолевые клетки развивают первичные опухоли в слепой кишке, которые метастазируют в печень и легкие, что часто наблюдается у пациентов с прогрессирующим КРР. Эта мышиная модель КРР может быть использована для оценки реакции на лекарственные препараты, контролируемые с помощью микрокомпьютерной томографии (мкКТ), клинически значимого метода мелкомасштабной визуализации, который может легко идентифицировать первичные опухоли или метастазы у пациентов. В этой статье мы опишем хирургическую процедуру и необходимую методологию для имплантации раковых клеток, полученных от пациентов, в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом.

Введение

Колоректальный рак (КРР) является второй по значимости причиной смерти от^{рака во всем} мире1. Способность генерировать модели опухолей in vitro или in vivo, полученные из отдельных опухолевых клеток пациента, позволила продвинуть прецизионную медицину в онкологии. За последнее десятилетие органоиды, полученные от пациентов (PDO) или ксенотрансплантаты (PDX), использовались многими исследовательскими группами по всему миру². ЗОП представляют собой многоклеточные структуры in vitro, которые напоминают особенности исходной опухолевой ткани и могут самоорганизовываться и самообновляться³. Эти многообещающие модели in vitro могут быть успешно использованы для скрининга лекарственных препаратов и содействия трансляционным исследованиям. С другой стороны, модели PDX точно повторяют исходный CRC на всех соответствующих уровнях, от гистологии до молекулярных признаков и реакции на лекарственное средство ^2,4.

In vivo Модели PDX в основном выращиваются в виде подкожных опухолей у мышей с иммунодефицитом. Используя этот подход, PDX стали золотым стандартом в исследованиях рака, особенно для изучения чувствительности или резистентности к лекарственным препаратам. Тем не менее, смертельные случаи, связанные с КРР, в основном связаны с наличием метастатических поражений в печени, легких или брюшной полости, и ни один из двух подходов (PDO или PDX) не может повторить продвинутую клиническую ситуацию. Кроме того, было показано, что конкретный очаг роста опухоли определяет важные биологические характеристики, влияющие на эффективность препарата и прогноз заболевания². В связи с этим существует острая необходимость в создании доклинических моделей, которые могут быть использованы для оценки эффективности противоопухолевых препаратов в клинически значимых метастатических условиях⁶.

Сканеры микрокомпьютерной томографии (мкКТ) могут функционировать как уменьшенные клинические компьютерные томографы, обеспечивая первичную визуализацию опухолей и метастазов у мышей с масштабированным разрешением изображения, пропорциональным разрешению КТ онкологических больных⁷. Для противодействия плохому контрастированию мягких тканей при методе μКТ можно использовать рентгенологические йодсодержащие контрастные вещества для улучшения контраста и оценки опухолевой нагрузки. Используя метод двойного контрастирования, йод вводится перорально и внутрибрюшинно в разное время. Контрастное вещество, вводимое перорально, помогает определить границы между опухолевой тканью и содержимым слепой кишки внутри кишечника.  С другой стороны, контрастное вещество, вводимое внутрибрюшинно, позволяет определить внешние границы опухолевой массы, которая часто растет и прорастает в брюшину⁸.

В статье описан протокол выполнения ортотопической имплантации раковых клеток пациента в стенку слепой кишки мышей с иммунодефицитом, а также методика мониторинга роста опухоли кишечника с помощью μКТ-сканирования. В настоящей статье показано, что модель повторяет клинический сценарий распространенных опухолей кишечника и метастатических заболеваний у пациентов с КРР, которые не могут быть изучены с помощью моделей PDO или PDXO. Поскольку ортотопические PDX-модели КРР повторяют клинический сценарий пациентов с КРР, мы пришли к выводу, что они являются лучшими на сегодняшний день для тестирования эффективности противоопухолевых препаратов при распространенных опухолях кишечника и метастатических заболеваниях.

протокол

От всех пациентов было получено письменное информированное согласие. Проект был одобрен Комитетом по этике исследований Университетской больницы Валь д'Эброн, Барселона, Испания (идентификатор одобрения: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Образцы тканей толстой кишки человека состояли из биоптатов из некротических участков первичных аденокарцином или метастазов в печени, соответствующих пациентам с раком толстой и прямой кишки, перенесшим резекцию опухоли. Эксперименты проводились в соответствии с директивой Европейского Союза по уходу за животными (86/609/EEC) и были одобрены Этическим комитетом по экспериментам на животных VHIR - Научно-исследовательского института Валь д'Эброн (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA и 12/18 CEEA).

ПРИМЕЧАНИЕ: Самка NOD-SCID (NOD. Мыши CB17-Prkdcscid/NcrCrl) в возрасте 8 недель были приобретены в Charles River Laboratories.

1. Получение клеток пациента

1. Удаление опухоли
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура проводится в биологическом шкафу при комнатной температуре (RT) в животноводческом помещении.
   1. Получение образцов опухолей из операций или биопсии пациентов, а также из PDX, растущих подкожно у мышей.
   2. Для ортотопической инъекции готовят опухолевые клетки из установленных подкожных моделей опухолей PDX вместо ткани, полученной непосредственно от пациентов⁹.
   3. Генерация опухолей PDX путем посева суспензии из 1 x 10,5 опухолевых клеток в фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) (50 мкл) в смеси с матриксом Matrigel (50 мкл) подкожно в боку мышей NOD-SCID².
      1. Измеряйте рост опухоли с помощью штангенциркуля через день.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что наша лаборатория создала биобанк из более чем 350 моделей PDX. Модели опухолей CRC-PDX, используемые в протоколе, представляют собой установленные в лаборатории PDX-модели, которые были амплифицированы более трех пассажей у мышей и прошли критерии включения/исключения с положительным результатом (табл. 1).
   4. Усыпляют мышей путем вывиха шейки матки, когда подкожные опухоли достигают максимального размера, установленного CEEA (1 см в диаметре), или когда животные достигают критериев конечной точки.
   5. Извлеките опухоль и осторожно удалите ее с кожи и окружающих неопухолевых тканей с помощью ножниц и щипцов.
   6. Собранные опухоли хранят в PBS при температуре 4 °C до следующего этапа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциировать опухоли в клеточной суспензии как можно скорее после удаления с их первоначального места в поражениях пациентов или подкожных ксенотрансплантатах у мышей. Жизнеспособность клеток значительно снижается через 24 ч после удаления ткани, что приводит к неэффективной имплантации у мышей-реципиентов.
2. Подготовка клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура проводится в биологическом кабинете при комнатной температуре (RT) в помещении для культивирования тканей.
   1. Диссоциируют опухоли с помощью лезвия в 10-сантиметровой культуральной пробирке с 1 мл полной среды CoCSCM 6Ab (табл. 2) (для облегчения измельчения). Поместите однородный диссоциированный образец в коническую пробирку объемом 15 мл.
   2. Добавьте полную среду CoCSCM 6Ab до конечного объема 5 мл (используйте не более 3 мл диссоциированного образца в той же пробирке).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичный КРР, резецированный у пациентов, естественным образом заражен бактериями и грибком. Необходимо удалить патогены, присутствующие в исходном образце пациента, с помощью коктейля из шести антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, фунгизон, канамицин, гентамицин и нистатин). Введение опухолевых клеток, зараженных бактериями, мышам с иммунодефицитом может привести к гибели животного.
   3. Инкубируют с 50 мкл ДНКазы I (0,08 кЕд/мл) и 50 мкл коллагеназы (1,5 мг/мл) (среда для разложения; Таблица 2) в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе клеточных культур при 45°. Хорошо перемешивайте раствор каждые 15 минут пипеткой объемом 5 мл перед инкубацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциируйте опухолевую ткань и переварите ее, пипетируя несколько раз, чтобы получить одноклеточный раствор. Это необходимо для подсчета клеток перед инъекцией мышам-реципиентам и, следовательно, для достижения гомогенной имплантации опухолевых клеток.
   4. Добавьте 5 мл полной среды CoCSCM 6Ab и хорошо перемешайте пипеткой объемом 5 мл.
   5. Отсортируйте раствор с помощью ситечка для клеток 100 мкм, используя новую стерильную пробирку объемом 50 мл.
   6. Отжмите отсортированные клетки при 500 x g в течение 8 мин при RT.
   7. Аспирировать надосадочную жидкость.
   8. Повторно суспендируйте гранулу в 3 мл буферного раствора для лизиса 1x эритроцитов.
   9. Инкубировать в течение 10 мин при RT.
   10. Добавьте 3 мл полной среды CoCSCM 6Ab, пипетку для образца и отжим при 500 x g в течение 10 мин при RT. Отсасывайте надосадочную жидкость.
   11. Ресуспендируйте гранулу с 5-10 мл полной среды CoCSCM 6Ab и используйте счетчик клеток для расчета общего количества клеток.
   12. Вращайте клетки при 500 x g в течение 10 мин при RT и ресуспендируйте в 10 мл PBS.
   13. Ресуспендируйте гранулу до получения концентрации 20 x 10⁶ клеток/мл и хорошо перемешайте до получения однородной клеточной суспензии.
   14. Подготовьте шприцы по 29 г (игла 0,5 мл U 100, 0,33 мм [29 г] x 12,7 мм) для инъекции слепой кишки в культуру тканей (один шприц/мышь). Загрузите в шприц 50 мкл суспензии опухолевых клеток (1 x 10,⁶ клеток/инъекция) и держите его на льду. Следите за тем, чтобы пузырьки воздуха были удалены из клеточной суспензии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление пузырьков воздуха при загрузке опухолевых клеток в шприц необходимо для того, чтобы избежать введения чрезмерного объема в стенку слепой кишки, что может привести к разрыву ткани и потере образца. Крайне важно хорошо перемешать клеточную суспензию при загрузке шприца, чтобы избежать неравномерного размера опухоли у мышей в одном и том же эксперименте.

2. Ортотопическая инъекция в слепую кишку

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется на скамейке в специальной комнате, свободной от патогенов (SPF) на животноводческом объекте. Используемое оборудование предварительно очищается и стерилизуется. Кроме того, он снова стерилизуется в переносном стерилизаторе между отдельными лицами или зонами в животноводческом помещении.

1. Очистите место операции, распылив дезинфицирующее моющее средство и протерев.
2. Депилируйте живот мыши с помощью аппарата для удаления волос мышей.
3. Поместите мышь в положение лежа на спине. Используйте 2% изофлуран для обезболивания животного. Подтвердите эффект анестезии, аккуратно ущипнув конечность и наблюдая за отсутствием стимуляции.
4. Капните 50-100 мкл ветеринарной мази (3 мг/г Lacryvisc) в глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
5. Продезинфицируйте брюшко мыши, протерев хлоргексидином или повидон-йодом несколько раз круговыми движениями.
6. Сделайте продольный разрез 1 см над нижней частью живота с помощью хирургических ножниц. Осторожно отделите кожу от каждого участка, чтобы представить брюшину, которая находится под кожей.
7. Сделайте разрез 0,5-1 см в мембране брюшины, достаточно большой, чтобы экстериоризировать слепую кишку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экстериоризация слепой кишки без чрезмерных манипуляций с внутренними органами, что может резко увеличить летальность процедуры.
8. Осторожно изолируйте слепую кишку от мыши с помощью предварительно вырезанной стерильной марли.
9. Смачивайте слепую кишку солевым раствором на протяжении всей процедуры.
10. Иммобилизуйте слепую кишку, осторожно захватив ее щипцами, и введите иглу поверхностно в стенку слепой кишки. Избегайте капилляров и сосудов в месте инъекции. Удалите пузырьки из клеточной суспензии.
11. Медленно вводят все 50 мкл суспензии опухолевых клеток. Обычно введение занимает около 10 секунд. Избегайте перфорации просвета слепой кишки иглой, так как это приводит к выведению суспензии опухолевых клеток из организма через перистальтику кишечника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Введение суспензии опухолевых клеток в слепую кишку мышей является самым сложным этапом всей процедуры. В этой части протокола следует использовать яркий свет, сфокусированный на месте инъекции, и увеличительную лупу. Вводят иглу параллельно поверхности слепой кишки. Слепая кишка – очень хрупкая ткань; Поэтому иммобилизацию слепой кишки следует проводить с помощью хирургических щипцов и с легким надавливанием, чтобы избежать разрыва тканей, приводящего к кровоизлиянию. В результате успешной имплантации в стенке слепой кишки образуется белый пузырь (гранула клеток). Если пузырь не может быть визуализирован, это может указывать на то, что слепая кишка была перфорирована, и клетки закончились в просвете слепой кишки, что привело к их очищению кишечным трактом.
12. После инъекции медленно извлеките иглу из слепой кишки и слегка надавите на место инъекции аппликатором с ватным наконечником, чтобы избежать выхода опухолевых клеток и уменьшить небольшое кровотечение.
13. Очистите слепую кишку солевым раствором, чтобы удалить мусор.
14. Верните слепую кишку обратно в брюшную полость животного.
15. Закройте брюшину швами 5/0.
16. Закройте кожу живота швами 5/0.
17. Назначают послеоперационные антибиотики (100 мг/кг амоксициллина или 20 мг/кг энрофлоксацина) и анальгетики (5 мг/мл метакам/мелоксикам) путем подкожной инъекции. Положите мышей на грелку и держите их там до полного выздоровления. Затем верните их в клетку с другими животными.

3. Оценка ортотопического роста опухоли с помощью μКТ-сканирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется на платформе доклинической визуализации (PIP) в животноводческом комплексе.

1. Выполняйте все процедуры с животными в соответствии с правилами этического комитета.
2. Начинайте контролировать объем опухоли с помощью μCT через 2 недели после введения клеток, а затем каждую неделю.
3. Свежеразвести контрастное вещество иопамиро (300 мг/мл) в физиологическом растворе в соотношении 3:1 для обеих доз. Ввести 300 мл иопамиро через пероральный зонд.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за плохого контраста мягких тканей микроКТ рекомендуется контрастное вещество для повышения чувствительности методики. Протокол включает пероральное введение йодсодержащего препарата (иопамиро) для определения внутрипросветной опухолевой нагрузки и вторичное внутрибрюшинное введение того же препарата для определения опухолевой нагрузки в висцеральной части кишечника. Ранее были проведены пилотные эксперименты по определению точного времени, за которое контрастное вещество должно прибыть в слепую кишку мышей до его элиминации. В случае иопамиро это около 2 ч.
4. Через 2 ч вводят внутрибрюшинную инъекцию 300 мл предварительно разведенного иопамиро. Введение помогает определить границы опухоли в теменной области лица.
5. Обезболивайте животных, используя 2% изофлуран.
6. Убедившись, что животное правильно обезболино, зажав лапку мыши, поместите животное в сканирующую кровать μCT. Лучшее положение – лежа на спине (лицом вверх).
7. В управляющем программном обеспечении запустите режим реального времени (режим рентгеноскопии), чтобы поместить область живота в поле зрения (FOV) сканера. Для этого перемещайте кровать вперед, назад и вбок, пока не будет достигнуто желаемое положение. Поверните рентгеновскую трубку и детектор на 90° и переместите сканирующий стол по оси Y, чтобы полностью центрировать животное.
8. Используйте следующие параметры для изображений микроКТ-сканирования: угол обзора 30 мм, время сбора 26 с, напряжение тока 90 кВ и сила тока 200 мкА при использовании системы визуализации FX μCT.
9. Верните животных в клетки для восстановления после завершения сканирования. Обеспечьте тепловую поддержку и наблюдайте за животными до тех пор, пока они не оправятся от анестезии, прежде чем вернуться в жилье.
10. При съемке микроКТ для каждого сканирования получается файл размером 250 Мб. Созданные файлы данных имеют формат VOX. Для того, чтобы сделать их доступными для любого программного обеспечения для анализа изображений, преобразуйте файлы в формат DICOM с помощью программного обеспечения для управления базами данных μCT. Сохраните пакет созданных файлов на портативном жестком диске, чтобы проанализировать их с помощью любого компьютера с доступным программным обеспечением для работы с изображениями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время анализа изображений слепая кишка локализуется как расширенная кишка с радиоплотным содержимым (иопамиро), часто в левой части хвостовой части живота. При висцеральном изгибе слепой кишки наблюдается утолщение стенки, по сравнению с прилегающими отделами кишечника. Утолщение соответствует росту опухоли.
11. После того, как опухоль локализована, найдите наибольший диаметр в различных проекциях (аксиальной, корональной и сагиттальной). Измерьте эти три оси и рассчитайте объем опухоли по формуле эллипсоида: объем = 4/3π x (x-полуось x y-полуось x z-полуось)¹⁰.

4. Терапевтическое вмешательство у мышей с ортотопическими опухолями

1. Еженедельно наблюдайте за мышами с ортотопическими опухолями.
2. Когда у большинства мышей обнаружен сигнал μКТ-сканирования опухоли, проведите еще одно μКТ-сканирование на следующей неделе, чтобы подтвердить наличие опухоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время начала лечения зависит от используемой модели PDX и варьируется от 3 до 12 недель после инокуляции опухолевых клеток в слепую кишку.
3. Рандомизируйте мышей в четыре группы: группа транспортных средств (n = 10-15 мышей), группа тестирования лекарств (n = 10-15 мышей), группа стандартной химиотерапии (n = 10-15 мышей) и группа комбинированного лечения (n = 10-15 мышей).
4. Обработать мышей внутрибрюшинно физиологическим раствором (транспортная группа), испытуемым препаратом (20 мг/кг) (испытуемая группа), иринотеканом (50 мг/кг) (стандартная группа лечения) или испытуемым препаратом (20 мг/кг) с иринотеканом (50 мг/кг) (комбинированная группа лечения). Выполняйте введение один раз в неделю до окончания эксперимента.
5. Еженедельно контролируйте рост опухоли с помощью μКТ-сканирования на протяжении всего эксперимента.
6. В конце эксперимента усыпите мышей путем вывиха шейки матки и соберите печень, легкие и любые другие возможные поражения в других органах.
7. Поместите образцы тканей в кассеты и инкубируйте их в 4% формалине в течение ночи. В качестве контроля используют ткань кишечника мыши без опухоли в слепой кишке.
8. Извлеките кассеты из формалина и инкубируйте с 70%-ным этиловым спиртом не менее 3 ч.
9. Встраивают кассеты с парафином, используя стандартные протоколы гистопатологического аппарата.
10. Выполняйте окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) слепой кишки, печени и легких, используя стандартные протоколы гистопатологического учреждения.

Результаты

Мышей, которым ортотопически имплантировали раковые клетки пациента, еженедельно проводили мониторинг с помощью μКТ-сканирования. По окончании эксперимента животных усыпили. Кишечник, слепую кишку (рис. 1А, Б), печень, легкие и любые другие возможные поражения ?...

Обсуждение

За последние несколько десятилетий было разработано и опробовано множество новых противоопухолевых методов лечения у пациентов с различными типами опухолей, включая колоректальный рак (КРР). Несмотря на то, что во многих случаях наблюдались многообещающие результаты на доклинически?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
Apo-Transferrin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	T1147-500MG
B27 Supplement	Life Technologies S.A (Spain)	17504044
Chlorhexidine Aqueous Solution 2%	DH MATERIAL MÉDICO, S.L.	1111696250
Collagenase	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	C0130-500MG
D-(+)-Glucose	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	G6152
DMEM /F12	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	21331-020
DNase I	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	D4263-5VL
EGF	PEPRO TECH EC LTD.	AF-100-15-500 µg
FGF basic	PEPRO TECH EC LTD.	100-18B
Fungizone	Life Technologies S.A (Spain)	15290026
Gentamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15750037
Heparin Sodium Salt	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	H4784-250MG
Insulin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	I9278-5ML
Iopamiro
Isoflurane	-	-
Kanamycin	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	15160047
L-Glutamine	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	25030032
Matrigel Matrix	CULTEK, S.L.U.	356235/356234/354234
Metacam, 5 mg/mL	-	-
Non-essential amino acids	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11140035
Nystatin	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	N4014-50MG
Pen/Strep	Life Technologies S.A (Spain)	15140122
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile	Labclinics S.A	L0615-500
Progesterone	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P0130-25G
Putrescine	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	P5780-5G
RBC Lysis Buffer	Labclinics S.A	00-4333-57
Sodium Pyruvate	LIFE TECHNOLOGIES S.A.	11360039
Sodium Selenite	MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.	S5261-25G
ESSENTIAL SUPPLIES
8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice	-	-
BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm	BECTON DICKINSON, S.A.U.	320926
Blade #24	-	-
Cell Strainer 100 µm	Cultek, SLU	45352360
Forceps and Surgical scissors	-	-
Heating pad	-	-
Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel	-	-
Surfasafe	-	-
Suture PROLENE 5-0	JOHNSON&JOHNSON S, A.	8720H
EQUIPMENT/SOFTWARE
Quantum FX µCT Imaging system	Perkin Elmer	Perkin Elmer	http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083