Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لصياغة الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) التي تغلف mRNA الذي يشفر لوسيفيراز اليراعات. تم اختبار هذه LNPs لفعاليتها في المختبر في خلايا HepG2 وفي الجسم الحي في الفئران C57BL / 6.

Abstract

جذبت الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) اهتماما واسع النطاق مؤخرا مع التطوير الناجح للقاحات COVID-19 mRNA بواسطة Moderna و Pfizer / BioNTech. أثبتت هذه اللقاحات فعالية علاجات mRNA-LNP وفتحت الباب أمام التطبيقات السريرية المستقبلية. في أنظمة mRNA-LNP ، تعمل LNPs كمنصات توصيل تحمي شحنة mRNA من التدهور بواسطة النيوكليازات وتتوسط في توصيلها داخل الخلايا. تتكون LNPs عادة من أربعة مكونات: الدهون المؤينة ، والفوسفوليبيد ، والكوليسترول ، واقتران البولي إيثيلين جلايكول (PEG) المرتبط بالدهون (lipid-PEG). هنا ، يتم صياغة LNPs التي تغلف mRNA بتشفير لوسيفيراز اليراع عن طريق خلط الموائع الدقيقة للمرحلة العضوية التي تحتوي على مكونات الدهون LNP والمرحلة المائية التي تحتوي على mRNA. ثم يتم اختبار mRNA-LNPs في المختبر لتقييم كفاءة نقلها في خلايا HepG2 باستخدام مقايسة قائمة على لوحة التوهج الحيوي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييم mRNA-LNPs في الجسم الحي في الفئران C57BL / 6 بعد الحقن في الوريد عبر الوريد الجانبي الذيل. يتم إجراء تصوير التلألؤ الحيوي لكامل الجسم باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي . تم عرض النتائج التمثيلية لخصائص mRNA-LNP ، وكفاءة نقلها في خلايا HepG2 ، والتدفق الكلي للإنارة في الفئران C57BL / 6.

Introduction

أظهرت الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) وعدا كبيرا في السنوات الأخيرة في مجال العلاج الجيني غير الفيروسي. في عام 2018 ، وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على أول علاج على الإطلاق لتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، Onpattro by Alnylam ، لعلاج الداء النشواني الوراثي transthyretin1،2،3،4. كانت هذه خطوة مهمة إلى الأمام للجسيمات النانوية الدهنية والعلاجات القائمة على الحمض النووي الريبي. في الآونة الأخيرة ، حصلت Moderna و Pfizer / BioNTech على موافقات إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على لقاحات mRNA-LNP ضد SARS-CoV-2 4,5. في كل من علاجات الحمض النووي القائمة على LNP ، يعمل LNP على حماية حمولته من التدهور بواسطة النيوكليازات وتسهيل التوصيل القوي داخل الخلايا 6,7. بينما شهدت LNPs نجاحا في علاجات RNAi وتطبيقات اللقاح ، تم أيضا استكشاف mRNA-LNPs لاستخدامها في العلاجات البديلة للبروتين8 وكذلك للتوصيل المشترك ل Cas9 mRNA وتوجيه الحمض النووي الريبي لتسليم نظام CRISPR-Cas9 لتحرير الجينات9. ومع ذلك ، لا توجد تركيبة واحدة محددة مناسبة تماما لجميع التطبيقات ، ويمكن أن تؤثر التغييرات الطفيفة في معلمات صياغة LNP بشكل كبير على الفاعلية والتوزيع الحيوي في الجسم الحي8،10،11. وبالتالي ، يجب تطوير وتقييم mRNA-LNPs الفردية لتحديد الصيغة المثلى لكل علاج قائم على LNP.

عادة ما يتم صياغة LNPs بأربعة مكونات دهنية: الدهون المؤينة ، والفوسفوليبيد ، والكوليسترول ، ومترافق البولي إيثيلين جلايكول (PEG) (PEG) المرتبط بالدهون (Lipid-PEG) 11،12،13. يعتمد التوصيل القوي داخل الخلايا الذي تسهله LNPs ، جزئيا ، على مكون الدهون المؤين12. هذا المكون محايد عند درجة الحموضة الفسيولوجية ولكنه يصبح مشحونا إيجابيا في البيئة الحمضية للإندوسوم11. يعتقد أن هذا التغيير في الشحنة الأيونية هو مساهم رئيسي في الهروب الداخلي12،14،15. بالإضافة إلى الدهون المؤينة ، يعمل مكون الفوسفوليبيد (الدهون المساعدة) على تحسين تغليف الشحنة ويساعد في الهروب الداخلي ، ويوفر الكوليسترول الاستقرار ويعزز اندماج الغشاء ، ويقلل الدهون-PEG من تراكم LNP و opsonization في الدورةالدموية 10،11،14،16. لصياغة LNP ، يتم دمج مكونات الدهون هذه في طور عضوي ، عادة الإيثانول ، ويتم خلطها مع مرحلة مائية تحتوي على شحنة الحمض النووي. عملية صياغة LNP متعددة الاستخدامات للغاية من حيث أنها تسمح باستبدال المكونات المختلفة بسهولة ودمجها بنسب مولية مختلفة من أجل صياغة العديد من تركيبات LNP مع العديد من الخصائص الفيزيائية والكيميائية10,17. ومع ذلك ، عند استكشاف هذا التنوع الكبير من LNPs ، من الأهمية بمكان تقييم كل صيغة باستخدام إجراء موحد لقياس الاختلافات في التوصيف والأداء بدقة.

هنا ، يتم تحديد سير العمل الكامل لصياغة mRNA-LNPs وتقييم أدائها في الخلايا.

Protocol

ملاحظة: حافظ دائما على ظروف خالية من RNase عند صياغة mRNA-LNPs عن طريق مسح الأسطح والمعدات بمطهر سطحي ل RNases و DNA. استخدم فقط النصائح والكواشف الخالية من RNase.

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر في جامعة بنسلفانيا وبروتوكول معتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في جامعة بنسلفانيا.

1. إعداد ما قبل الصياغة

  1. املأ دورقا نظيفا سعة 4 لتر ب 200-300 مل من محلول ملحي طازج 10x مخزن بالفوسفات (PBS).
    1. قم بتخفيف 10x PBS في الدورق 10 أضعاف بالماء عالي النقاء للحصول على دورق من 1x PBS. تأكد من أن الحجم النهائي ل 1x PBS يتراوح بين 2-3 لتر.
    2. ضع أشرطة غسيل الكلى (قطع الوزن الجزيئي 20 كيلو دالتون [MWCO]) للسعة المناسبة لتركيبة LNP في الدورق المملوء لترطيبها.
      ملاحظة: تتطلب أشرطة غسيل الكلى ما لا يقل عن 2 دقيقة للترطيب قبل الاستخدام.
    3. ضع قضيب تقليب في الدورق ، وقم بتغطية الدورق بورق الألمنيوم.
    4. ضع الدورق المغطى على طبق تقليب مغناطيسي. قم بتشغيل لوحة التحريك ، واضبطها على الدوران عند 300-400 دورة في الدقيقة.
  2. قم بتخفيف مخزون حمض الستريك العازل 100 مللي متر (درجة الحموضة 3) 10 أضعاف بالماء عالي النقاء لإنشاء محلول حمض الستريك 10 مللي متر المستخدم لتخفيف mRNA.
  3. اصنع C12-200 من الدهون المؤينة ، والدهون المساعدة ، والكوليسترول ، وحلول مخزون PEG (lipid-PEG) المثبتة بالدهون عن طريق إذابة كل دهون في إيثانول 100٪. تركيزات مكونات الدهون مفصلة في الجدول 1.
    1. سخني وخلط محاليل المرق على حرارة 37 درجة مئوية لضمان ذوبانها بالكامل.

2. تحضير خلطات الدهون والحمض النووي

  1. احسب الكميات المطلوبة من الدهون المؤينة ، والدهون المساعدة ، والكوليسترول ، و LIPID-PEG بناء على النسبة المولية المطلوبة ونسبة وزن الدهون المؤينة إلى mRNA (الجدول 1). تحضير 10٪ حجم إضافي من المرحلة العضوية لحساب الحجم الميت في المحاقن أثناء الصياغة.
    1. اجمع الأحجام المحسوبة لمكونات الليبيدات المختلفة في أنبوب مخروطي.
    2. تمييع الدهون مع 100 ٪ من الإيثانول إلى الحجم النهائي ، V ، والذي يمثل 25 ٪ من الحجم النهائي ل LNP.
  2. احسب كمية mRNA المطلوبة للتكوين بناء على نسبة وزن الدهون المؤينة إلى mRNA والحجم الإجمالي ل mRNA-LNP المطلوب (الجدول 1).
    1. قم بإذابة اليراع الذي يشفر mRNA المشفر لوسيفيراز على الجليد.
    2. تمييع mRNA إلى الحجم النهائي ، 3V ، ثلاثة أضعاف حجم المرحلة العضوية ، في 10 mM حامض الستريك العازلة.
      ملاحظة: يجب أن يحتوي كل حجم دهني ، V ، على ما يكفي من الدهون المؤينة ل mRNA المخفف في 3فولت. هذا يتوافق مع نسبة وزن الدهون المؤينة إلى mRNA المطلوبة.

3. صياغة الموائع الدقيقة من mRNA-LNPs

  1. رش مناديل مهمة دقيقة بمطهر سطحي ل RNases و DNA ، وامسح الجزء الداخلي من أداة الموائع الدقيقة جيدا.
    1. افتح خرطوشة ميكروفلويديك جديدة ، وأدخلها مع توجيه قنوات المدخل لأسفل وبعيدا.
    2. تأكد من أن ذراع الأنبوب المخروطي يحمل أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل وفي الموضع الأبعد إلى اليمين.
    3. قم بتكوين أنبوبين مخروطيين معقمين سعة 15 مل على الحامل مع إزالة الأغطية.
  2. املأ حقنة سعة 5 مل بمحلول mRNA الذي يحتوي على mRNA المخفف في محلول حمض الستريك 10 mM.
    1. املأ حقنة سعة 3 مل بمحلول دهني يحتوي على الليبيدات المخففة في الإيثانول النقي بنسبة 100٪.
    2. اقلب حامل الخرطوشة على جهاز الموائع الدقيقة.
    3. أدخل المحقنة سعة 5 مل ، بدون الإبرة ، التي تحتوي على mRNA في المدخل الأيسر للخرطوشة.
    4. أدخل المحقنة سعة 3 مل ، بدون الإبرة ، التي تحتوي على دهون في المدخل الأيمن للخرطوشة.
    5. اقلب حامل الخرطوشة لأسفل ، وأغلق غطاء أداة الموائع الدقيقة.
  3. قم بتشغيل أداة الموائع الدقيقة باستخدام المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز.
    1. حدد تشغيل سريع.
    2. حدد أنواع المحاقن الصحيحة للمحاقن 5 مل و 3 مل التي تم إدخالها.
    3. إدخال معلمات صياغة mRNA-LNP عند نسبة 3: 1 من معدل التدفق المائي إلى العضوي كما هو موضح في الجدول 2.
    4. اضغط على زر التالي للانتقال إلى الشاشة التالية.
    5. تأكد من إدخال المعلمات الصحيحة.
    6. اضغط على زر البدء لصياغة mRNA-LNPs.

4. المعالجة اللاحقة لتوصيف mRNA-LNPs

  1. قم بتحميل mRNA-LNPs التي تم جمعها في الأنبوب المخروطي الأيمن في أشرطة غسيل الكلى التي تم ترطيبها مسبقا.
    ملاحظة: لا تقم بثقب أو إتلاف غشاء الدرج عند تحميل mRNA-LNPs. في حالة تلف الغشاء ، ستفقد mRNA-LNPs عند التحميل.
    1. ضع أشرطة غسيل الكلى التي تحتوي على mRNA-LNPs مرة أخرى في الدورق الذي يحتوي على 1x PBS ، واتركها لغسيل الكلى لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
    2. بعد غسيل الكلى ، أحضر أشرطة غسيل الكلى التي تحتوي على mRNA-LNPs في خزانة معقمة للسلامة البيولوجية ، وقم بإزالة mRNA-LNPs باستخدام حقنة بإبرة.
    3. قم بتصفية mRNA-LNPs المعقمة باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر ، واجمعها في أنبوب مخروطي معقم.
    4. ضع 65 ميكرولتر من محلول mRNA-LNP في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل لأغراض التوصيف.
  2. تمييع 10 ميكرولتر من mRNA-LNPs 1: 100 في 990 ميكرولتر من 1x PBS في كوفيت لقياس الحجم الهيدروديناميكي ومؤشر التشتت المتعدد باستخدام تشتت الضوء الديناميكي.
  3. تقييم تركيز وكفاءة تغليف mRNA-LNPs باستخدام مقايسة مضان (أي RiboGreen).
    1. قم بإعداد محلول مخزون من 1x TE buffer عن طريق تخفيف 20x TE buffer بماء البيولوجيا الجزيئية.
    2. قم بإعداد حل مخزون بنسبة 1٪ من المخزن المؤقت Triton X-100 عن طريق تخفيف Triton X-100 باستخدام 1x TE buffer.
    3. قم بإعداد الكاشف الفلوري عن طريق تخفيف مخزون الكاشف 1: 200 باستخدام 1x TE buffer.
    4. قم بتخفيف mRNA-LNPs 1: 100 في 1x TE buffer و 1٪ Triton X-100 buffer في لوحة سوداء القاع ذات 96 بئرا في 100 ميكرولتر.
    5. قم بإعداد منحنى قياسي منخفض المدى عن طريق تخفيف معيار الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وقم بلوحة المنحنى القياسي في لوحة 96 بئرا.
    6. أضف 100 ميكرولتر من كاشف الفلورسنت المخفف إلى كل بئر يحتوي على mRNA-LNP المخفف أو المعيار المخفف.
    7. ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا داخل قارئ الأطباق ، ورجها لمدة 1 دقيقة ، متبوعة بانتظار لمدة 4 دقائق.
    8. قم بقياس شدة التألق لكل بئر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة عند إثارة / انبعاث 480 نانومتر / 520 نانومتر.
  4. استخدم المنحنى القياسي لتحويل قيم التألق إلى تركيزات.
    1. احسب كفاءة التغليف عن طريق طرح القيمة التي تم الحصول عليها من تمييع LNPs في المخزن المؤقت TE (mRNA غير المغلف) من القيمة التي تم الحصول عليها من تمييع LNPs في 1٪ Triton X-100 (إجمالي mRNA) والقسمة على القيمة التي تم الحصول عليها من تمييع LNPs في 1٪ Triton X-100 ، وفقا للمعادلة 4.4.
    2. احسب تركيز mRNA-LNP المستخدم في دراسات الخلايا عن طريق طرح القيمة التي تم الحصول عليها من تمييع LNPs في المخزن المؤقت TE (mRNA غير المغلف) من القيمة التي تم الحصول عليها من تخفيف LNPs في 1٪ Triton X-100 (إجمالي mRNA).
  5. قم بقياس pKa ل mRNA-LNPs عن طريق إجراء مقايسة 6- (p-toluidino) -2-naphthalenesulfonyl chloride (TNS).
    1. قم بإعداد كاشف TNS عن طريق إنشاء محلول 0.16 mM من TNS في ماء عالي النقاء.
      ملاحظة: عند استخدام الكاشف ، تأكد من إبقائه على الجليد وبعيدا عن الضوء لتجنب التدهور.
    2. تحضير المحاليل المخزنة من 150 mM كلوريد الصوديوم ، 20 mM فوسفات الصوديوم ، 25 mM سترات الأمونيوم ، و 20 mM أسيتات الأمونيوم المعدلة إلى قيم الأس الهيدروجيني المختلفة التي تتراوح من 2 إلى 12 بزيادات 0.5.
    3. أضف 2.5 ميكرولتر من LNP إلى كل محلول عازل معدل الأس الهيدروجيني في لوحة ذات قاع أسود أسود ذات 96 بئرا.
    4. أضف كاشف TNS إلى كل بئر بحيث يكون تركيز TNS النهائي 6 ميكرومتر.
    5. احتضن لوحة 96 بئرا في مكان مظلم لمدة 5 دقائق.
    6. قم بقياس التألق عند إثارة / انبعاث 322 نانومتر / 431 نانومتر باستخدام قارئ لوحة مضان.
    7. قم بملاءمة البيانات مع منحنى سيني ، واحسب pKa باستخدام المعادلة الملائمة لإيجاد الرقم الهيدروجيني الذي لوحظ عنده 50٪ من أقصى شدة.
  6. ويبين الجدول 3 النتائج التمثيلية للحجم الهيدروديناميكي mRNA-LNP ومؤشر PDI وكفاءة التغليف و pKa.

5. في المختبر نقل خلايا HepG2

ملاحظة: يمكن استخدام خطوط خلايا أخرى مختلفة ، مثل خلايا HeLa أو خلايا HEK-293T ، لتقييم كفاءة نقل LNPs في المختبر. يجب أن تكون جميع الخلايا سلبية للميكوبلازما قبل دراسات نقل LNP.

  1. صفيحة 5000 خلية HepG2 في كل بئر من صفيحة 96 بئرا ذات قاع أبيض صافية في 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الكامل (DMEM مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين)
    1. اترك الخلايا لتلتصق طوال الليل في حاضنة CO 2 الخاضعة للرقابة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. تمييع mRNA-LNPs في وسط زراعة الخلايا الكامل بحيث يتم تسليم الجرعة الإجمالية في 100 ميكرولتر.
    1. قم بإزالة الوسط الكامل من الآبار.
    2. عالج الخلايا إما ب mRNA-LNPs المخفف في وسط زراعة الخلايا الكامل بالجرعات المطلوبة أو الوسط الكامل (التحكم).
    3. ضع لوحة 96 بئرا التي تحتوي على الخلايا المعالجة مرة أخرى في حاضنة CO2 الخاضعة للرقابة لمدة 24 ساعة.
  3. تقييم كفاءة النقل عن طريق إجراء فحص لوسيفيراز.
    1. قم بإعداد كاشف luciferase ومخزن تحلل الخلايا 1x وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. أخرج اللوحة المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على الخلايا من الحاضنة ، وأحضرها إلى خزانة السلامة البيولوجية.
    3. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من كل بئر من لوحة 96 بئرا.
    4. أضف 20 ميكرولتر من 1x محلول تحلل إلى كل بئر ، متبوعا ب 100 ميكرولتر من كاشف فحص لوسيفيراز المعد مسبقا.
    5. احم اللوحة من الضوء ، وضع اللوحة في قارئ لوحة لقياس إشارة الإضاءة الحيوية لكل بئر.
      ملاحظة: النتائج التمثيلية التي توضح علاج خلايا HepG2 باستخدام C12-200 mRNA-LNPs المصاغة مسبقا موضحة في الشكل 1.

6. تقييم في الجسم الحي ل mRNA-LNPs في الفئران بعد حقن الوريد الذيل

  1. قم بتخفيف محلول mRNA-LNP باستخدام 1x PBS معقم بحيث يوجد 2 ميكروغرام من إجمالي mRNA في حجم حقن الوريد الذيلي 100 ميكرولتر ، والذي يتوافق مع جرعة وزن الجسم حوالي 0.1 مجم / كجم لفأر 20 جم.
  2. كبح كل ماوس باستخدام طريقة معتمدة ، وامسح الذيل بوسادة مبللة بالكحول بنسبة 70٪.
    1. املأ حقنة أنسولين 29 جم إما ب 100 ميكرولتر من mRNA-LNP (2 ميكروغرام) أو 100 ميكرولتر من 1x PBS. قم بإزالة أي فقاعات من المحقنة.
    2. أدخل الإبرة بحيث يكون المخروط متجها لأعلى في وريد الذيل الجانبي للفأر ، وقم بحقن 100 ميكرولتر ببطء من mRNA-LNP أو 1x PBS.
    3. انزع الإبرة واضغط حتى يتحقق الإرقاء.
  3. تحضير محلول مخزون من 15 ملغ / مل ملح البوتاسيوم د-لوسيفيرين في معقمة 1x PBS بعد 6 ساعات من الحقن.
    1. قم بتشغيل نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS) ، وافتح برنامج التصوير.
    2. اضغط على تهيئة لإعداد الأداة للحصول على البيانات.
    3. حدد المربع بجوار التلألؤ ، واضبط وقت التعرض على تلقائي. تأكد من تحديد مجال الرؤية الصحيح لعدد الفئران التي يتم تصويرها.
    4. تطبيق 200 ميكرولتر من د-لوسيفيرين داخل الصفاق (150 ملغ من لوسيفيرين لكل كيلوغرام من وزن الجسم) للفئران المعالجة سابقا.
    5. ضع الفئران في غرفة تخدير مضبوطة على 2.5٪ إيزوفلوران ومعدل تدفق أكسجين 2.0 لتر / دقيقة.
    6. انتظر 10 دقائق حتى تستقر إشارة لوسيفيراز قبل تصوير الفئران المعالجة ب mRNA-LNP.
    7. تأكد من تخدير الفئران بالكامل ، وإعادة توجيه خط التخدير لإدارة الأيزوفلوران عبر مخاريط الأنف داخل غرفة التصوير.
    8. نقل الفئران إلى مخاريط الأنف ، والتأكد من أنها على ظهورهم مع بطونهم مكشوفة.
    9. أغلق باب الحجرة ، وانقر فوق الزر "اكتساب " في البرنامج للحصول على صور التلألؤ الحيوي.
      ملاحظة: تظهر النتائج التمثيلية لتصوير الجسم بالكامل للفأر بعد علاج mRNA-LNP أو 1X PBS في الشكل 2.

النتائج

تمت صياغة mRNA-LNPs باستخدام أداة الموائع الدقيقة التي تمتلك متوسط قطر هيدروديناميكي يبلغ 76.16 نانومتر ومؤشر تشتت متعدد يبلغ 0.098. تم العثور على pKa من mRNA-LNPs ليكون 5.75 عن طريق إجراء مقايسة TNS18. تم حساب كفاءة التغليف لهذه mRNA-LNPs لتكون 92.3٪ باستخدام مقايسة التألق المعدلة والم...

Discussion

باستخدام سير العمل هذا ، يمكن صياغة مجموعة متنوعة من mRNA-LNPs واختبارها من حيث كفاءتها في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن تبديل الدهون والسواغات المؤينة ودمجها بنسب مولية مختلفة ونسب مختلفة من الدهون المؤينة إلى mRNA لإنتاج mRNA-LNPs بخصائص فيزيائية كيميائية مختلفة22. هنا ، قمنا...

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

تعترف M.J.M. بالدعم المقدم من جائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH) (DP2 TR002776) ، وجائزة Burroughs Wellcome Fund Career في الواجهة العلمية (CASI) ، وجائزة CAREER لمؤسسة العلوم الوطنية الأمريكية (CBET-2145491) ، وتمويل إضافي من المعاهد الوطنية للصحة (NCI R01 CA241661 و NCI R37 CA244911 و NIDDK R01 DK123049).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M Hydrochloric AcidSigma7647-01-0
0.22 μm Syringe FiltersGenesee25-243
1 mL BD Slip Tip SyringeBD309659
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)Avanti Polar Lipids880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)Avanti Polar Lipids850725P
1.5 mL Eppendorf TubesFisher Scientific05-408-129
15 mL Conical TubesFisher Scientific14-959-70C
200 proof EthanolDecon Labs2716
23G NeedlesFisher Scientific14-826-6C
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tipsFisher Scientific14-823-435
3 mL Dialysis CassettesThermo ScientificA52976
96 Well Black Wall Black Bottom PlateFisher Scientific07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC SurfaceThermo Scientific165306
Ammonium Acetate, 1 KilogramResearch Products International 631-61-8
Ammonium Citrate dibasicSIgma3012-65-5
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mLBD309646
C12-200 Ionizable LipidCayman Chemical36699
C57BL/6 MiceJackson Laboratory000664
CholesterolSigma57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU)TriLink BiotechnologiesL-7202
Disposable cuvettesFisher Scientific14955129
D-Luciferin, Potassium SaltThermo ScientificL2916
DMEM, high glucoseThermofisher Scientific11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mLFisher Scientific1484132
Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HyPure Molecular Biology Grade WaterCytivaSH30538.03
Infinite 200 PRO Plate ReaderTecanN/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkin ElmerN/A
Large KimwipesFisher Scientific06-666-11D
Luciferase Assay KitPromegaE4550
NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 PackPrecision NanosystemsNIN0065
NanoAssemblr Ignite InstrumentPrecision NanosystemsNIN0001
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-freeThermo ScientificAM9624
Penicillin-StreptomycinThermofisher Scientific15140122
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0TeknovaQ2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay KitThermo ScientificR11490
Reporter Lysis 5x BufferPromegaE3971
RNase Away Surface DecontaminantThermofisher Scientific7000TS1
Sodium ChlorideSigma7647-14-5
Sodium HydroxideSigma1310-73-2
Sodium PhosphateSigma7601-54-9
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)SigmaT9792
Triton X-100Sigma9036-19-5
ZetasizerMalvern PanalyticalNanoZS

References

  1. Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
  2. Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
  3. Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
  4. Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
  5. Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
  6. Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
  7. Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
  8. Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
  9. Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
  10. Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
  11. El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
  12. Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
  13. Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
  14. Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
  15. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
  16. Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
  17. Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
  18. Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
  19. Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
  20. Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
  21. Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
  22. Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
  23. Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
  24. Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
  25. Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
  26. Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
  27. Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
  28. Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
  29. Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
  30. Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
  31. Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
  32. Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
  33. Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
  34. Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
  35. Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
  36. Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
  37. Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
  38. Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
  39. Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
  40. Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

191 LNPs MRNA PEG HepG2 C57BL 6

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved