Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, ateşböceği lusiferazını kodlayan mRNA'yı kapsülleyen lipid nanopartiküllerini (LNP'ler) formüle etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu LNP'ler, HepG2 hücrelerinde in vitro ve C57BL / 6 farelerinde in vivo potansiyelleri açısından test edildi.

Özet

Lipid nanopartikülleri (LNP'ler), Moderna ve Pfizer/BioNTech tarafından COVID-19 mRNA aşılarının başarılı bir şekilde geliştirilmesiyle son zamanlarda büyük ilgi görmüştür. Bu aşılar, mRNA-LNP terapötiklerinin etkinliğini göstermiş ve gelecekteki klinik uygulamalar için kapıyı açmıştır. mRNA-LNP sistemlerinde, LNP'ler, mRNA kargosunu nükleazlar tarafından bozulmaya karşı koruyan ve hücre içi iletimlerine aracılık eden dağıtım platformları olarak hizmet eder. LNP'ler tipik olarak dört bileşenden oluşur: iyonlaşabilir bir lipit, bir fosfolipid, kolesterol ve bir lipide bağlı polietilen glikol (PEG) konjugatı (lipid-PEG). Burada, ateşböceği lusiferazı kodlayan mRNA'yı kapsülleyen LNP'ler, LNP lipid bileşenlerini içeren organik fazın ve mRNA içeren sulu fazın mikroakışkan karışımı ile formüle edilir. Bu mRNA-LNP'ler daha sonra biyolüminesan plaka bazlı bir test kullanılarak HepG2 hücrelerinde transfeksiyon verimliliklerini değerlendirmek için in vitro olarak test edilir. Ek olarak, mRNA-LNP'ler, lateral kuyruk damarı yoluyla intravenöz bir enjeksiyonu takiben C57BL/6 farelerinde in vivo olarak değerlendirilir. Tüm vücut biyolüminesans görüntüleme, in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. mRNA-LNP özellikleri, HepG2 hücrelerindeki transfeksiyon etkinlikleri ve C57BL/6 farelerinde toplam ışıldayan akı için temsili sonuçlar gösterilmiştir.

Giriş

Lipid nanopartikülleri (LNP'ler) son yıllarda viral olmayan gen terapisi alanında büyük umut vaat etmektedir. 2018'de Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), kalıtsal transtirenin amiloidozu 1,2,3,4'ün tedavisi için ilk RNA interferansı (RNAi) terapötik olan Onpattro by Alnylam'ı onayladı. Bu, lipid nanopartikülleri ve RNA bazlı tedaviler için ileriye doğru atılmış önemli bir adımdı. Daha yakın zamanlarda, Moderna ve Pfizer/BioNTech, SARS-CoV-2 4,5'e karşı mRNA-LNP aşıları için FDA onayları aldı. Bu LNP bazlı nükleik asit tedavilerinin her birinde, LNP, kargosunu nükleazlar tarafından bozulmaya karşı korumaya ve güçlü hücre içi iletimi kolaylaştırmaya hizmet eder 6,7. LNP'ler RNAi tedavilerinde ve aşı uygulamalarında başarı elde ederken, mRNA-LNP'ler ayrıca protein replasman tedavilerinde8 kullanım için ve ayrıca Cas9 mRNA'nın birlikte verilmesi ve gen düzenleme için CRISPR-Cas9 sisteminin verilmesi için RNA'yı yönlendirmek için araştırılmıştır9. Bununla birlikte, tüm uygulamalar için uygun olan tek bir spesifik formülasyon yoktur ve LNP formülasyon parametrelerindeki ince değişiklikler, in vivo 8,10,11 gücünü ve biyolojik dağılımı büyük ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, her LNP bazlı tedavi için optimal formülasyonu belirlemek için bireysel mRNA-LNP'ler geliştirilmeli ve değerlendirilmelidir.

LNP'ler genellikle dört lipid bileşeni ile formüle edilir: iyonlaşabilir bir lipit, bir fosfolipid, kolesterol ve bir lipide bağlı polietilen-glikol (PEG) konjugatı (lipit-PEG)11,12,13. LNP'ler tarafından kolaylaştırılan güçlü hücre içi iletim, kısmen iyonlaşabilir lipid bileşeni12'ye dayanır. Bu bileşen fizyolojik pH'ta nötrdür, ancak endozom11'in asidik ortamında pozitif yüklü hale gelir. İyonik yükteki bu değişikliğin endozomal kaçışa önemli bir katkıda bulunduğu düşünülmektedir12,14,15. İyonize olabilen lipide ek olarak, fosfolipid (yardımcı lipid) bileşeni, yükün kapsüllenmesini iyileştirir ve endozomal kaçışa yardımcı olur, kolesterol stabilite sağlar ve membran füzyonunu arttırır ve lipid-PEG, dolaşımda LNP agregasyonunu ve opsonizasyonu en aza indirir10,11,14,16. LNP'yi formüle etmek için, bu lipit bileşenleri organik bir fazda, tipik olarak etanolde birleştirilir ve nükleik asit kargosunu içeren sulu bir faz ile karıştırılır. LNP formülasyon işlemi, çok sayıda fizikokimyasal özelliğe sahip birçok LNP formülasyonunu formüle etmek için farklı bileşenlerin kolayca ikame edilmesine ve farklı molar oranlarda birleştirilmesine izin vermesi bakımından çok yönlüdür10,17. Bununla birlikte, bu çok çeşitli LNP'leri keşfederken, karakterizasyon ve performanstaki farklılıkları doğru bir şekilde ölçmek için her formülasyonun standart bir prosedür kullanılarak değerlendirilmesi çok önemlidir.

Burada, mRNA-LNP'lerin formülasyonu ve hücrelerde ve hayvanlarda performanslarının değerlendirilmesi için eksiksiz iş akışı özetlenmiştir.

Protokol

NOT: Yüzeyleri ve ekipmanı RNazlar ve DNA için bir yüzey dekontaminantı ile silerek mRNA-LNP'leri formüle ederken her zaman RNaz içermeyen koşulları koruyun. Yalnızca RNaz içermeyen uçlar ve reaktifler kullanın.

Tüm hayvan prosedürleri, Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna ve Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Ön formülasyon hazırlığı

  1. Temiz bir 4 L'lik kabı 200-300 mL taze 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun.
    1. 1x PBS'lik bir beher elde etmek için beherdeki 10x PBS'yi ultra saf suyla 10 kat seyreltin. 1x PBS'nin son hacminin 2-3 L arasında olduğundan emin olun.
    2. LNP formülasyonu için uygun kapasiteye sahip diyaliz kasetlerini (20 kDa moleküler ağırlık kesme [MWCO]) nemlendirmek için doldurulmuş behere yerleştirin.
      NOT: Diyaliz kasetleri kullanılmadan önce nemlendirilmesi için en az 2 dakika gerektirir.
    3. Behere bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve kabı alüminyum folyo ile örtün.
    4. Kapalı kabı manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin. Karıştırma plakasını açın ve 300-400 rpm'de dönmeye ayarlayın.
  2. mRNA seyreltmesi için kullanılan 10 mM sitrik asit tamponunu oluşturmak için 100 mM sitrik asit tampon stoğunu (pH 3) ultra saf suyla 10 kat seyreltin.
  3. Her bir lipidi %100 etanol içinde çözerek C12-200 iyonize olabilen lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve lipid bağlantılı PEG (lipid-PEG) stok çözeltileri yapın. Lipid bileşenlerinin konsantrasyonları Tablo 1'de detaylandırılmıştır.
    1. Tamamen çözündüklerinden emin olmak için stok çözeltilerini 37 °C'de ısıtın ve karıştırın.

2. Lipid ve nükleik asit karışımlarının hazırlanması

  1. İstenen molar orana ve iyonlaşabilir lipid/mRNA ağırlık oranına göre gerekli iyonlaşabilir lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve lipit-PEG hacimlerini hesaplayın (Tablo 1). Formülasyon sırasında şırıngalardaki ölü hacmi hesaba katmak için organik fazın %10 ekstra hacmini hazırlayın.
    1. Farklı lipit bileşenlerinin hesaplanan hacimlerini konik bir tüpte birleştirin.
    2. Lipitleri% 100 etanol ile, LNP'nin nihai hacminin% 25'ini temsil eden son hacim V'ye seyreltin.
  2. İyonlaşabilir lipid/mRNA ağırlık oranına ve gereken toplam mRNA-LNP hacmine dayalı olarak formülasyon için gereken mRNA miktarını hesaplayın (Tablo 1).
    1. Ateşböceği lusiferaz kodlayan mRNA'yı buz üzerinde çözün.
    2. mRNA'yı, 10 mM sitrik asit tamponunda organik fazın hacminin üç katı olan 3V'luk son hacme seyreltin.
      NOT: Her lipid hacmi, V, 3 V'ta seyreltilmiş mRNA için yeterli iyonize edilebilir lipid içermelidir. Bu, istenen iyonlaşabilir lipid / mRNA ağırlık oranına karşılık gelir.

3. mRNA-LNP'lerin mikroakışkan formülasyonu

  1. RNazlar ve DNA için bir yüzey dekontaminantı ile hassas bir görev mendili püskürtün ve mikroakışkan aletin içini iyice silin.
    1. Yeni bir mikroakışkan kartuş açın ve giriş kanalları aşağı ve uzağa bakacak şekilde yerleştirin.
    2. Konik boru kolunun iki adet 15 mL konik boru tuttuğundan ve en sağa doğru konumda olduğundan emin olun.
    3. Tutucu üzerinde kapaklar kapalıyken iki adet steril 15 mL konik tüp yapılandırın.
  2. 5 mL'lik bir şırıngayı, 10 mM sitrik asit tamponunda seyreltilmiş mRNA içeren mRNA çözeltisiyle doldurun.
    1. 3 mL'lik bir şırıngayı, saf% 100 etanol içinde seyreltilmiş lipitleri içeren lipit çözeltisiyle doldurun.
    2. Mikroakışkan cihazdaki kartuş tutucuyu yukarı çevirin.
    3. mRNA içeren 5 mL'lik şırıngayı iğnesiz olarak kartuşun sol girişine yerleştirin.
    4. Lipid içeren 3 mL'lik şırıngayı iğnesiz olarak kartuşun sağ girişine yerleştirin.
    5. Kartuş tutucuyu tekrar aşağı çevirin ve mikroakışkan aletin kapağını kapatın.
  3. Cihazın arkasında bulunan anahtarı kullanarak mikroakışkan aleti açın.
    1. Hızlı Çalıştır'ı seçin.
    2. Takılan 5 mL ve 3 mL şırıngalar için doğru şırınga tiplerini seçin.
    3. mRNA-LNP formülasyonu için parametreleri Tablo 2'de açıklandığı gibi 3:1 sulu/organik akış hızı oranında girin.
    4. Bir sonraki ekrana gitmek için İleri düğmesine basın.
    5. Doğru parametrelerin girildiğini onaylayın.
    6. mRNA-LNP'leri formüle etmek için Başlat düğmesine basın.

4. mRNA-LNP'lerin formülasyon sonrası işlenmesi ve karakterizasyonu

  1. Sağ konik tüpte toplanan mRNA-LNP'leri önceden hidratlanmış diyaliz kasetlerine yükleyin.
    NOT: mRNA-LNP'leri yüklerken kasetin zarını delmeyin veya zarar vermeyin. Membran hasar görürse, yükleme sırasında mRNA-LNP'ler kaybolacaktır.
    1. mRNA-LNP'leri içeren diyaliz kasetlerini 1x PBS içeren behere geri yerleştirin ve en az 2 saat diyalize bırakın.
    2. Diyalizden sonra, mRNA-LNP'leri içeren diyaliz kasetlerini steril bir biyogüvenlik kabinine getirin ve iğneli bir şırınga kullanarak mRNA-LNP'leri çıkarın.
    3. 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak mRNA-LNP'leri steril olarak filtreleyin ve steril bir konik tüpte toplayın.
    4. Karakterizasyon amacıyla 65 μL mRNA-LNP çözeltisini 1.5 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin.
  2. Dinamik ışık saçılımı kullanarak hidrodinamik boyut ve polidispersite indeksinin ölçümü için bir küvette 10 μL mRNA-LNP'yi 990 μL 1x PBS'de 1:100 oranında seyreltin.
  3. Bir floresan testi (yani RiboGreen) kullanarak mRNA-LNP'lerin konsantrasyonunu ve kapsülleme verimliliğini değerlendirin.
    1. 20x TE tamponunu moleküler biyoloji suyu ile seyrelterek 1x TE tamponundan oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın.
    2. Triton X-100'ü 1x TE tamponu ile seyrelterek% 1 Triton X-100 tamponundan oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın.
    3. Reaktif stoğunu 1:200 oranında 1x TE tamponu ile seyrelterek floresan reaktifi hazırlayın.
    4. mRNA-LNP'leri 100x TE tamponunda 1:100 ve siyah duvarlı siyah tabanlı 96 oyuklu bir plakada 100 μL'de %1 Triton X-100 tamponu seyreltin.
    5. RNA standardını üreticinin talimatlarına göre seyrelterek düşük aralıklı bir standart eğri hazırlayın ve standart eğriyi 96 oyuklu plakada plakalayın.
    6. Seyreltilmiş mRNA-LNP veya seyreltilmiş standart içeren her bir oyuğa 100 μL seyreltilmiş floresan reaktif ekleyin.
    7. 96 oyuklu plakayı bir plaka okuyucunun içine yerleştirin ve 1 dakika çalkalayın, ardından 4 dakika bekleyin.
    8. Her bir kuyucuğun floresan yoğunluğunu, üreticinin protokolüne göre 480 nm/520 nm'lik bir uyarma/emisyonda ölçün.
  4. Floresan değerlerini konsantrasyonlara dönüştürmek için standart eğriyi kullanın.
    1. LNP'lerin TE tamponunda (kapsüllenmemiş mRNA) seyreltilmesinden elde edilen değeri, LNP'lerin %1 Triton X-100'de (toplam mRNA) seyreltilmesinden elde edilen değerden çıkararak ve LNP'lerin %1 Triton X-100'de seyreltilmesinden elde edilen değere bölerek kapsülleme verimliliğini hesaplayın, denklem 4.4'e göre.
    2. Hücre ve hayvan çalışmaları için kullanılan mRNA-LNP konsantrasyonunu, TE tamponunda (kapsüllenmemiş mRNA) LNP'lerin seyreltilmesinden elde edilen değeri, LNP'lerin %1 Triton X-100'de (toplam mRNA) seyreltilmesinden elde edilen değerden çıkararak hesaplayın.
  5. 6-(p-toluidino)-2-naftalinsülfonil klorür (TNS) testi yaparak mRNA-LNP'lerinpKA'sını ölçün.
    1. Ultra saf suda 0.16 mM'lik bir TNS çözeltisi oluşturarak TNS reaktifini hazırlayın.
      NOT: Reaktifi kullanırken, bozulmayı önlemek için buz üzerinde ve ışıktan uzak tuttuğunuzdan emin olun.
    2. 0,5'lik artışlarla 2 ila 12 arasında değişen farklı pH değerlerine ayarlanmış 150 mM sodyum klorür, 20 mM sodyum fosfat, 25 mM amonyum sitrat ve 20 mM amonyum asetat tamponlu çözeltiler hazırlayın.
    3. Siyah duvarlı siyah tabanlı 96 oyuklu bir plakada her bir pH ayarlı tampon çözeltisine 2,5 μL LNP ekleyin.
    4. Nihai TNS konsantrasyonu 6 μM olacak şekilde her bir oyuğa TNS reaktifi ekleyin.
    5. 96 oyuklu plakayı karanlık bir yerde 5 dakika inkübe edin.
    6. Bir floresan plaka okuyucu kullanarak 322 nm/431 nm'lik bir uyarma/emisyonda floresansı ölçün.
    7. Verileri sigmoidal bir eğriye sığdırın ve maksimum yoğunluğun %50'sinin gözlemlendiğipH'ı bulmak için uygun denklemi kullanarak p K a'yı hesaplayın.
  6. mRNA-LNP hidrodinamik boyutu, PDI, kapsülleme verimliliği ve pKa için temsili sonuçlar Tablo 3'te gösterilmektedir.

5. HepG2 hücrelerinin in vitro transfeksiyonu

NOT: HeLa hücreleri veya HEK-293T hücreleri gibi çeşitli diğer hücre hatları, LNP'lerin transfeksiyon verimliliğini in vitro olarak değerlendirmek için kullanılabilir. LNP transfeksiyon çalışmalarından önce tüm hücreler mikoplazma için negatif test yapmalıdır.

  1. Plaka: 100 μL tam hücre kültürü ortamında beyaz duvarlı şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 5.000 HepG2 hücresi (DMEM% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir)
    1. Hücreleri, 37 ° C ve% 5 CO 2'de kontrollü bir CO2 inkübatörde gece boyunca yapışmaya bırakın.
  2. mRNA-LNP'leri tam hücre kültürü ortamında seyreltin, böylece toplam doz 100 μL olarak verilir.
    1. Tüm ortamı kuyulardan çıkarın.
    2. Hücreleri, istenen dozlarda tam hücre kültürü ortamında seyreltilmiş mRNA-LNP'ler veya tam ortam (kontrol) ile tedavi edin.
    3. Tedavi edilen hücreleri içeren 96 oyuklu plakayı 24 saat boyunca kontrollü CO2 inkübatörüne geri yerleştirin.
  3. Bir lusiferaz testi yaparak transfeksiyon verimliliğini değerlendirin.
    1. Lusiferaz reaktifini ve 1x hücre lizis tamponunu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
    2. Hücreleri içeren 96 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve bir biyogüvenlik kabinine getirin.
    3. Hücre kültürü ortamını 96 oyuklu plakanın her oyuğundan çıkarın.
    4. Her bir oyuğa 20 μL 1x lizis tamponu ve ardından önceden hazırlanmış 100 μL lusiferaz tahlil reaktifi ekleyin.
    5. Plakayı ışıktan koruyun ve her bir kuyucuğun biyolüminesan sinyalini ölçmek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin.
      NOT: HepG2 hücrelerinin önceden formüle edilmiş C12-200 mRNA-LNP'ler ile tedavisini gösteren temsili sonuçlar Şekil 1'de gösterilmektedir.

6. Kuyruk damarı enjeksiyonunu takiben farelerde mRNA-LNP'lerin in vivo değerlendirmesi

  1. mRNA-LNP çözeltisini steril 1x PBS ile seyreltin, böylece 20 g'lık bir fare için yaklaşık 0,1 mg/kg'lık bir vücut ağırlığı dozuna karşılık gelen 100 μL'lik bir kuyruk damarı enjeksiyon hacminde 2 μg toplam mRNA bulunur.
  2. Her fareyi onaylanmış bir yöntem kullanarak kısıtlayın ve kuyruğu% 70 alkolle nemlendirilmiş bir bezle silin.
    1. 29 G'lik bir insülin şırıngasını 100 μL mRNA-LNP (2 μg) veya 100 μL 1x PBS ile doldurun. Şırıngadaki kabarcıkları çıkarın.
    2. İğneyi, eğimi yukarı bakacak şekilde farenin yan kuyruk damarına sokun ve 100 μL mRNA-LNP veya 1x PBS'yi yavaşça enjekte edin.
    3. İğneyi çıkarın ve hemostaz elde edilene kadar basınç uygulayın.
  3. Enjeksiyondan 6 saat sonra steril 1x PBS'de 15 mg / mL d-lusiferin potasyum tuzu stok çözeltisi hazırlayın.
    1. In vivo görüntüleme sistemini (IVIS) açın ve görüntüleme yazılımını açın.
    2. Enstrümanı veri toplamaya hazırlamak için Başlat'a basın.
    3. Lüminesans'ın yanındaki kutuyu işaretleyin ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın. Görüntülenen fare sayısı için doğru görüş alanının seçildiğinden emin olun.
    4. Daha önce tedavi edilen farelere intraperitoneal olarak 200 μL d-lusiferin (vücut ağırlığının kg'ı başına 150 mg lusiferin) uygulayın.
    5. Fareleri %2,5 izofluran ve 2,0 L/dk oksijen akış hızına ayarlanmış bir anestezi odasına yerleştirin.
    6. mRNA-LNP ile tedavi edilen fareleri görüntülemeden önce lusiferaz sinyalinin stabilize olması için 10 dakika bekleyin.
    7. Farelerin tamamen uyuşturulduğundan emin olun ve görüntüleme odasının içindeki burun konileri yoluyla izofluran uygulamak için anestezi hattını yönlendirin.
    8. Fareleri burun konilerine aktarın ve karınları açıkta kalacak şekilde sırt üstü olduklarından emin olun.
    9. Oda kapısını kapatın ve biyolüminesans görüntüleri elde etmek için yazılımdaki Al düğmesine tıklayın.
      NOT: mRNA-LNP veya 1X PBS tedavisini takiben fare tüm vücut görüntülemesi için temsili sonuçlar Şekil 2'de gösterilmektedir.

Sonuçlar

mRNA-LNP'ler, ortalama hidrodinamik çapı 76.16 nm ve polidispersite indeksi 0.098 olan bir mikroakışkan alet kullanılarak formüle edildi. mRNA-LNP'lerin pKa'sı , TNS testi18 yapılarak 5.75 olarak bulundu. Bu mRNA-LNP'ler için kapsülleme verimliliği, modifiye floresan testi ve denklem 4.4 kullanılarak %92.3 olarak hesaplandı. Hücre tedavisi ve hayvan dozu için kullanılan toplam RNA konsantrasyonu 40.24 ng / μL idi. Bu değer, modifiye floresan d...

Tartışmalar

Bu iş akışıyla, çeşitli mRNA-LNP'ler in vitro ve in vivo verimlilikleri için formüle edilebilir ve test edilebilir. İyonlaşabilir lipitler ve eksipiyanlar, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip mRNA-LNP'ler üretmek için farklı molar oranlarda ve farklı iyonlaşabilir lipid / mRNA ağırlık oranlarında değiştirilebilir ve birleştirilebilir22. Burada, molar oranı 35/16/46.5/2.5 (iyonlaşabilir lipid: yardımcı lipid: kolesterol: lipid-PEG) olan C12-200 mRNA...

Açıklamalar

Beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

M.J.M., ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü'nden (DP2 TR002776), Scientific Interface'de (CASI) Burroughs Wellcome Fund Kariyer Ödülü'nden, ABD Ulusal Bilim Vakfı KARİYER ödülünden (CBET-2145491) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 ve NIDDK R01 DK123049) ek fon sağladığını kabul eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M Hydrochloric AcidSigma7647-01-0
0.22 μm Syringe FiltersGenesee25-243
1 mL BD Slip Tip SyringeBD309659
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)Avanti Polar Lipids880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)Avanti Polar Lipids850725P
1.5 mL Eppendorf TubesFisher Scientific05-408-129
15 mL Conical TubesFisher Scientific14-959-70C
200 proof EthanolDecon Labs2716
23G NeedlesFisher Scientific14-826-6C
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tipsFisher Scientific14-823-435
3 mL Dialysis CassettesThermo ScientificA52976
96 Well Black Wall Black Bottom PlateFisher Scientific07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC SurfaceThermo Scientific165306
Ammonium Acetate, 1 KilogramResearch Products International 631-61-8
Ammonium Citrate dibasicSIgma3012-65-5
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mLBD309646
C12-200 Ionizable LipidCayman Chemical36699
C57BL/6 MiceJackson Laboratory000664
CholesterolSigma57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU)TriLink BiotechnologiesL-7202
Disposable cuvettesFisher Scientific14955129
D-Luciferin, Potassium SaltThermo ScientificL2916
DMEM, high glucoseThermofisher Scientific11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mLFisher Scientific1484132
Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HyPure Molecular Biology Grade WaterCytivaSH30538.03
Infinite 200 PRO Plate ReaderTecanN/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkin ElmerN/A
Large KimwipesFisher Scientific06-666-11D
Luciferase Assay KitPromegaE4550
NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 PackPrecision NanosystemsNIN0065
NanoAssemblr Ignite InstrumentPrecision NanosystemsNIN0001
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-freeThermo ScientificAM9624
Penicillin-StreptomycinThermofisher Scientific15140122
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0TeknovaQ2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay KitThermo ScientificR11490
Reporter Lysis 5x BufferPromegaE3971
RNase Away Surface DecontaminantThermofisher Scientific7000TS1
Sodium ChlorideSigma7647-14-5
Sodium HydroxideSigma1310-73-2
Sodium PhosphateSigma7601-54-9
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)SigmaT9792
Triton X-100Sigma9036-19-5
ZetasizerMalvern PanalyticalNanoZS

Referanslar

  1. Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
  2. Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
  3. Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
  4. Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
  5. Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
  6. Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
  7. Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
  8. Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
  9. Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
  10. Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
  11. El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
  12. Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
  13. Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
  14. Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
  15. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
  16. Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
  17. Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
  18. Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
  19. Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
  20. Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
  21. Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
  22. Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
  23. Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
  24. Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
  25. Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
  26. Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
  27. Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
  28. Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
  29. Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
  30. Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
  31. Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
  32. Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
  33. Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
  34. Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
  35. Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
  36. Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
  37. Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
  38. Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
  39. Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
  40. Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 191In Vitro VerimlilikIn Vivo VerimlilikLNP lerMRNA KargoN kleaz Y k mH cre i Da t myonize LipidFosfolipidKolesterolLipid PEG KonjugatAte b ce i LuciferazTransfeksiyon Etkinli iHepG2 H creleriBiyol minesan Plaka Bazl TestC57BL 6 Farelerntraven z EnjeksiyonLateral Kuyruk VeniT m V cut Biyol minesans G r nt lemeIn Vivo G r nt leme Sistemi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır