测试通过微流控混合配制的mRNA-脂质纳米颗粒的 体外 和 体内 效率

摘要

在这里，提出了一种用于配制脂质纳米颗粒（LNP）的方案，该脂质纳米颗粒封装编码萤火虫荧光素酶的mRNA。这些 LNP 在体外 HepG2 细胞和体内 C57BL/6 小鼠中测试 了它们的效力。

摘要

最近，随着 Moderna 和辉瑞/BioNTech 成功开发 COVID-19 mRNA 疫苗，脂质纳米颗粒 （LNP） 引起了广泛关注。这些疫苗证明了mRNA-LNP疗法的疗效，并为未来的临床应用打开了大门。在 mRNA-LNP 系统中，LNP 作为递送平台，保护 mRNA 货物免受核酸酶降解并介导其细胞内递送。LNP 通常由四种组分组成:可电离脂质、磷脂、胆固醇和脂质锚定聚乙二醇 （PEG） 偶联物 （lipid-PEG）。在这里，通过微流控混合含有LNP脂质成分的有机相和含有mRNA的水相来制备封装编码萤火虫荧光素酶的mRNA的LNP。然后使用基于生物发光板的测定法在体外测试这些 mRNA-LNP，以评估它们在 HepG2 细胞中的转染效率。此外，在通过侧尾静脉静脉注射后，在C57BL / 6小鼠中在体内评估mRNA-LNP。全身生物发光成像是通过使用体内成像系统进行的。显示了 mRNA-LNP 特性、它们在 HepG2 细胞中的转染效率以及 C57BL/6 小鼠中的总发光通量的代表性结果。

引言

近年来，脂质纳米颗粒（LNPs）在非病毒基因治疗领域展现出巨大的前景。2018 年，美国食品和药物管理局 （FDA） 批准了有史以来第一个 RNA 干扰 （RNAi） 疗法 Onpattro by Alnylam，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性 1,2,3,4。这是脂质纳米颗粒和基于RNA的疗法向前迈出的重要一步。最近，Moderna 和辉瑞/BioNTech 的 mRNA-LNP 疫苗获得了 FDA 批准，用于对抗 SARS-CoV-2 ^4,5。在每一种基于 LNP 的核酸疗法中，LNP 都有助于保护其货物免受核酸酶降解，并促进有效的细胞内递送 ^6,7。虽然 LNP 在 RNAi 疗法和疫苗应用中取得了成功，但 mRNA-LNP 也被探索用于蛋白质替代疗法⁸ 以及 Cas9 mRNA 的共同递送和引导 RNA 的递送，用于递送用于基因编辑的 CRISPR-Cas9 系统⁹。然而，没有一种特定的制剂适合所有应用，LNP制剂参数的细微变化会极大地影响体内的效力和生物分布8,10,11。因此，必须开发和评估单个 mRNA-LNP，以确定每种基于 LNP 的疗法的最佳配方。

LNP 通常由四种脂质成分配制而成:可电离脂质、磷脂、胆固醇和脂质锚定聚乙二醇 （PEG） 偶联物 （lipid-PEG）^11,12,13。LNP促进的有效细胞内递送部分依赖于可电离脂质成分¹²。该成分在生理pH值下呈中性，但在内体¹¹的酸性环境中带正电。离子电荷的这种变化被认为是内体逃逸的关键因素^12,14,15。除了可电离脂质外，磷脂（辅助脂质）成分还改善了货物的包封并有助于内体逃逸，胆固醇提供稳定性并增强膜融合，脂质-PEG 最大限度地减少循环中 LNP 聚集和调理作用^10,11,14,16.为了配制LNP，将这些脂质成分结合在有机相（通常是乙醇）中，并与含有核酸货物的水相混合。LNP配方工艺用途广泛，因为它允许以不同的摩尔比轻松替换和组合不同的组分，以配制许多具有多种物理化学性质的LNP配方^10,17。然而，在探索种类繁多的LNP时，至关重要的是，必须使用标准化程序对每种配方进行评估，以准确测量表征和性能的差异。

本文概述了mRNA-LNP的配方及其在细胞和动物中性能评估的完整工作流程。

研究方案

注意:在配制 mRNA-LNP 时，始终保持无 RNase 条件，方法是用 RNase 和 DNA 的表面去污剂擦拭表面和设备。仅使用不含 RNase 的吸头和试剂。

所有动物程序均按照宾夕法尼亚大学的《实验动物护理和使用指南》和宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行。

1.制剂前准备

1. 用 200-300 mL 新鲜的 10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 填充干净的 4 L 烧杯。
   1. 用超纯水将烧杯中的10x PBS稀释10倍，以获得1x PBS的烧杯。确保1x PBS的最终体积在2-3L之间。
   2. 将适合LNP制剂容量的透析盒（20kDa截留分子量[MWCO]）放入填充的烧杯中以水合它们。
      注意:透析盒在使用前至少需要 2 分钟来补水。
   3. 将搅拌棒放入烧杯中，并用铝箔盖住烧杯。
   4. 将盖好的烧杯放在磁力搅拌板上。打开搅拌板，将其设置为以 300-400 rpm 的速度旋转。
2. 用超纯水将 100 mM 柠檬酸缓冲液 （pH 3） 稀释 10 倍，以产生用于 mRNA 稀释的 10 mM 柠檬酸缓冲液。
3. 通过将每种脂质溶解在 100% 乙醇中，制备 C12-200 可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和脂质锚定 PEG（脂质-PEG）储备溶液。脂质成分的浓度详见 表1。
   1. 在37°C下加热并混合储备溶液，以确保它们完全溶解。

2. 脂质和核酸混合物的制备

1. 根据所需的摩尔比和可电离脂质与mRNA的重量比计算所需的可电离脂质，辅助脂质，胆固醇和脂质-PEG的体积（表1）。准备10%的额外体积的有机相，以考虑配制过程中注射器中的死体积。
   1. 将锥形管中不同脂质成分的计算体积组合在一起。
   2. 用100%乙醇稀释脂质至最终体积 V，其代表LNP最终体积的25%。
2. 根据可电离脂质与mRNA的重量比和所需的mRNA-LNP总体积计算制剂所需的mRNA量（表1）。
   1. 在冰上解冻萤火虫荧光素酶编码的mRNA。
   2. 在10mM柠檬酸缓冲液中将mRNA稀释至最终体积3V，是有机相体积的三倍。
      注意:每个脂质体积 V 必须含有足够的可电离脂质，用于在 3V 中稀释的 mRNA。这对应于所需的可电离脂质与mRNA的重量比。

3. mRNA-LNPs的微流控配方

1. 用表面去除 RNase 和 DNA 的污染物喷洒精细的任务擦拭布，并彻底擦拭微流体仪器的内部。
   1. 打开一个新的微流控滤芯，插入时入口通道朝下并背对。
   2. 确保锥形管臂固定两个 15 mL 锥形管，并且位于最右侧的位置。
   3. 在盖子关闭的情况下，在支架上配置两个无菌 15 mL 锥形管。
2. 用含有在 10 mM 柠檬酸缓冲液中稀释的 mRNA 的 mRNA 溶液填充 5 mL 注射器。
   1. 用脂质溶液填充 3 mL 注射器，该脂质溶液含有在纯 100% 乙醇中稀释的脂质。
   2. 向上翻转微流体装置上的墨盒支架。
   3. 将含有 mRNA 的 5 mL 注射器（不含针头）插入卡式瓶的左侧入口。
   4. 将含有脂质的 3 mL 注射器（不含针头）插入墨盒的右侧入口。
   5. 将墨盒支架翻转回去，然后关闭微流体仪器的盖子。
3. 使用位于仪器背面的开关打开微流体仪器。
   1. 选择 "快速运行"。
   2. 为插入的 5 mL 和 3 mL 注射器选择正确的注射器类型。
   3. 如 表2所述，以3:1的水与有机流速比输入mRNA-LNP制剂的参数。
   4. 按 "下一步 "按钮转到下一个屏幕。
   5. 确认输入了正确的参数。
   6. 按下 开始 按钮配制 mRNA-LNP。

4. mRNA-LNP的制剂后处理和表征

1. 将收集在右锥形管中的mRNA-LNP加载到先前水合的透析盒中。
   注意:加载 mRNA-LNP 时，请勿刺穿或损坏盒的膜。如果膜损坏，mRNA-LNPs将在加载时丢失。
   1. 将含有mRNA-LNP的透析盒放回含有1x PBS的烧杯中，并让它们透析至少2小时。
   2. 透析后，将含有mRNA-LNP的透析盒放入无菌生物安全柜中，并使用带针头的注射器取出mRNA-LNP。
   3. 使用0.22μm注射器过滤器无菌过滤mRNA-LNP，并将它们收集在无菌锥形管中。
   4. 将 65 μL mRNA-LNP 溶液放入 1.5 mL 微管中以进行表征。
2. 在比色皿中将 10 μL mRNA-LNP 以 1:100 的比例稀释在 990 μL 的 1x PBS 中，以使用动态光散射测量流体动力学尺寸和多分散指数。
3. 使用荧光测定法（即RiboGreen）评估mRNA-LNP的浓度和包封效率。
   1. 通过用分子生物学水稀释20x TE缓冲液来制备1x TE缓冲液的储备溶液。
   2. 通过用1x TE缓冲液稀释Triton X-100，制备1%Triton X-100缓冲液的储备溶液。
   3. 用 1x TE 缓冲液以 1:200 稀释试剂储备液来制备荧光试剂。
   4. 在 100 μL 的黑壁黑底 96 孔板中以 1:100 的比例稀释 mRNA-LNP 和 1% Triton X-100 缓冲液。
   5. 按照制造商的说明稀释RNA标准品，制备低范围标准曲线，并将标准曲线铺在96孔板中。
   6. 向每个含有稀释的 mRNA-LNP 或稀释标准品的孔中加入 100 μL 稀释的荧光试剂。
   7. 将 96 孔板放入酶标仪中，摇动 1 分钟，然后等待 4 分钟。
   8. 根据制造商的方案，在480nm / 520nm的激发/发射下测量每个孔的荧光强度。
4. 使用标准曲线将荧光值转换为浓度。
   1. 根据 公式4.4，从在1%Triton X-100（总mRNA）中稀释LNPs获得的值中减去在TE缓冲液（未包封的mRNA）中稀释LNP获得的值，并除以在1%Triton X-100中稀释LNP获得的值，计算包封效率。
   2. 计算用于细胞和动物研究的mRNA-LNP浓度，方法是从1%Triton X-100（总mRNA）中稀释LNP获得的值中减去在TE缓冲液（未封装的mRNA）中稀释LNP获得的值。
5. 通过进行6-（对甲苯胺基）-2-萘磺酰氯（TNS）测定来测量mRNA-LNP的pK_a 。
   1. 通过在超纯水中制备0.16mM的TNS溶液来制备TNS试剂。
      注意:使用试剂时，请务必将其放在冰上并避光，以免降解。
   2. 制备150mM氯化钠，20mM磷酸钠，25mM柠檬酸铵和20mM醋酸铵的缓冲溶液，以0.5的增量调节至2至12的不同pH值。
   3. 在黑壁黑底 96 孔板中向每种 pH 调节缓冲溶液中加入 2.5 μL LNP。
   4. 向每个孔中加入TNS试剂，使最终TNS浓度为6μM。
   5. 将 96 孔板在黑暗位置孵育 5 分钟。
   6. 使用荧光酶标仪测量322nm / 431nm激发/发射的荧光。
   7. 将数据拟合到S形曲线上，并使用拟合方程计算pK_a ，以找到观察到最大强度的50%的pH值。
6. mRNA-LNP流体动力学尺寸、PDI、包封效率和pK_a 的代表性结果如 表3所示。

5. HepG2细胞的 体外 转染

注:各种其他细胞系，如HeLa细胞或HEK-293T细胞，可用于评估LNP 在体外的转染效率。在 LNP 转染研究之前，所有细胞的支原体检测均应呈阴性。

1. 在 100 μL 完全细胞培养基（补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM）中，在白壁透明底 96 孔板的每个孔中接种 5,000 个 HepG2 细胞
   1. 让细胞在37°C和5%CO 2的受控CO₂培养箱中粘附过夜。
2. 在完全细胞培养基中稀释mRNA-LNP，使总剂量以100μL递送。
   1. 从孔中取出完整的培养基。
   2. 用在所需剂量的完全细胞培养基或完全培养基（对照）中稀释的mRNA-LNP处理细胞。
   3. 将含有处理细胞的 96 孔板放回受控的 CO₂ 培养箱中 24 小时。
3. 通过进行荧光素酶测定来评估转染效率。
   1. 按照制造商的说明制备荧光素酶试剂和1x细胞裂解缓冲液。
   2. 从培养箱中取出装有细胞的 96 孔板，并将其放入生物安全柜中。
   3. 从96孔板的每个孔中取出细胞培养基。
   4. 向每个孔中加入 20 μL 的 1x 裂解缓冲液，然后加入 100 μL 先前制备的荧光素酶测定试剂。
   5. 保护板避光，并将板放入酶标仪中以测量每个孔的生物发光信号。
      注: 图1显示了用先前配制的C12-200 mRNA-LNP处理HepG2细胞的代表性结果。

6. 尾静脉注射后小鼠mRNA-LNPs的 体内 评价

1. 用无菌1x PBS稀释mRNA-LNP溶液，使2μg总mRNA存在于100μL尾静脉注射体积中，这相当于20g小鼠的体重剂量约为0.1mg / kg。
2. 使用经批准的方法约束每只鼠标，并用蘸有 70% 酒精的垫擦拭尾巴。
   1. 用 100 μL mRNA-LNP （2 μg） 或 100 μL 1x PBS 填充 29 G 胰岛素注射器。从注射器中去除所有气泡。
   2. 将针头斜面朝上插入小鼠的侧尾静脉，并缓慢注射100μL的mRNA-LNP或1x PBS。
   3. 取下针头并施加压力，直到达到止血。
3. 注射后 6 小时在无菌 1x PBS 中制备 15 mg/mL d-荧光素钾盐的储备溶液。
   1. 打开 活体 成像系统（IVIS），打开成像软件。
   2. 按 初始化 准备仪器进行数据采集。
   3. 选中发光旁边的框，并将曝光时间设置为自动。确保为正在成像的小鼠数量选择了正确的视野。
   4. 腹膜内施用200μLd-荧光素（每kg体重150mg荧光素）给先前治疗的小鼠。
   5. 将小鼠置于设置为2.5%异氟醚和2.0L / min氧气流速的麻醉室中。
   6. 等待10分钟，使荧光素酶信号稳定，然后对mRNA-LNP处理的小鼠进行成像。
   7. 确保小鼠完全麻醉，并重定向麻醉线以 通过 成像室内的鼻锥施用异氟醚。
   8. 将小鼠转移到鼻锥上，并确保它们仰卧，腹部暴露在外。
   9. 关闭腔室门，点击软件中的 采集 按钮，获取生物发光图像。
      注:mRNA-LNP或1X PBS处理后小鼠全身成像的代表性结果 如图2所示。

结果

mRNA-LNPs采用微流控仪器配制，其平均流体动力学直径为76.16 nm，多分散指数为0.098。通过进行 TNS 测定，发现 mRNA-LNP 的 pK_a 为 5.75¹⁸。使用改良荧光测定法和 方程式 4.4 计算出这些 mRNA-LNP 的包封效率为 92.3%。用于细胞处理和动物给药的总RNA浓度为40.24 ng/μL。该值是从改良的荧光测定¹⁹中获得的，特别是通过将用1%Triton X-100和1x TE缓冲液稀?...

讨论

通过该工作流程，可以配制和测试各种mRNA-LNP的体外和体内效率。可电离脂质和赋形剂可以以不同的摩尔比和不同的可电离脂质与mRNA重量比进行交换和组合，以产生具有不同物理化学性质的mRNA-LNPs22。在这里，我们配制了摩尔比为 35/16/46.5/2.5（可电离脂质:辅助脂质:胆固醇:脂质-PEG）的 C12-200 mRNA-LNP，可电离脂质与 mRNA 重量比为 10:1。这些 LNP 在体外 HepG2 细胞

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Hydrochloric Acid	Sigma	7647-01-0
0.22 μm Syringe Filters	Genesee	25-243
1 mL BD Slip Tip Syringe	BD	309659
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)	Avanti Polar Lipids	880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725P
1.5 mL Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
200 proof Ethanol	Decon Labs	2716
23G Needles	Fisher Scientific	14-826-6C
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips	Fisher Scientific	14-823-435
3 mL Dialysis Cassettes	Thermo Scientific	A52976
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Scientific	165306
Ammonium Acetate, 1 Kilogram	Research Products International	631-61-8
Ammonium Citrate dibasic	SIgma	3012-65-5
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL	BD	309646
C12-200 Ionizable Lipid	Cayman Chemical	36699
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664
Cholesterol	Sigma	57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7202
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14955129
D-Luciferin, Potassium Salt	Thermo Scientific	L2916
DMEM, high glucose	Thermofisher Scientific	11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mL	Fisher Scientific	1484132
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]	ATCC	HB-8065
HyPure Molecular Biology Grade Water	Cytiva	SH30538.03
Infinite 200 PRO Plate Reader	Tecan	N/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	N/A
Large Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-11D
Luciferase Assay Kit	Promega	E4550
NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack	Precision Nanosystems	NIN0065
NanoAssemblr Ignite Instrument	Precision Nanosystems	NIN0001
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0	Teknova	Q2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit	Thermo Scientific	R11490
Reporter Lysis 5x Buffer	Promega	E3971
RNase Away Surface Decontaminant	Thermofisher Scientific	7000TS1
Sodium Chloride	Sigma	7647-14-5
Sodium Hydroxide	Sigma	1310-73-2
Sodium Phosphate	Sigma	7601-54-9
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)	Sigma	T9792
Triton X-100	Sigma	9036-19-5
Zetasizer	Malvern Panalytical	NanoZS