Test dell'efficienza in vitro e in vivo di nanoparticelle mRNA-lipidi formulate mediante miscelazione microfluidica

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo per la formulazione di nanoparticelle lipidiche (LNP) che incapsulano l'mRNA che codifica per la luciferasi delle lucciole. Questi LNP sono stati testati per la loro potenza in vitro in cellule HepG2 e in vivo in topi C57BL/6.

Abstract

Le nanoparticelle lipidiche (LNP) hanno recentemente attirato l'attenzione generale con il successo dello sviluppo dei vaccini a mRNA COVID-19 di Moderna e Pfizer/BioNTech. Questi vaccini hanno dimostrato l'efficacia delle terapie a base di mRNA-LNP e hanno aperto la porta a future applicazioni cliniche. Nei sistemi mRNA-LNP, gli LNP fungono da piattaforme di rilascio che proteggono il carico di mRNA dalla degradazione da parte delle nucleasi e mediano il loro rilascio intracellulare. Le LNP sono tipicamente composte da quattro componenti: un lipide ionizzabile, un fosfolipide, il colesterolo e un coniugato di polietilenglicole (PEG) ancorato ai lipidi (lipid-PEG). Qui, gli LNP che incapsulano l'mRNA che codifica per la luciferasi della lucciola sono formulati mediante miscelazione microfluidica della fase organica contenente i componenti lipidici LNP e della fase acquosa contenente l'mRNA. Questi mRNA-LNP vengono quindi testati in vitro per valutare la loro efficienza di trasfezione nelle cellule HepG2 utilizzando un saggio bioluminescente basato su piastre. Inoltre, gli mRNA-LNP sono valutati in vivo in topi C57BL/6 a seguito di un'iniezione endovenosa attraverso la vena caudale laterale. L'imaging a bioluminescenza di tutto il corpo viene eseguito utilizzando un sistema di imaging in vivo . Vengono mostrati risultati rappresentativi per le caratteristiche dell'mRNA-LNP, la loro efficienza di trasfezione nelle cellule HepG2 e il flusso luminescente totale nei topi C57BL/6.

Introduzione

Le nanoparticelle lipidiche (LNP) si sono dimostrate molto promettenti negli ultimi anni nel campo della terapia genica non virale. Nel 2018, la Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti ha approvato la prima terapia di interferenza dell'RNA (RNAi), Onpattro di Alnylam, per il trattamento dell'amiloidosi ereditaria da transtiretina 1,2,3,4. Questo è stato un importante passo avanti per le nanoparticelle lipidiche e le terapie a base di RNA. Più recentemente, Moderna e Pfizer/BioNTech hanno ricevuto l'approvazione della FDA per i loro vaccini mRNA-LNP contro SARS-CoV-2 ^4,5. In ciascuna di queste terapie a base di acidi nucleici a base di LNP, l'LNP serve a proteggere il suo carico dalla degradazione da parte delle nucleasi e a facilitare una potente veicolazione intracellulare ^6,7. Mentre le LNP hanno avuto successo nelle terapie RNAi e nelle applicazioni dei vaccini, le mRNA-LNP sono state esplorate anche per l'uso nelle terapie di sostituzione proteica⁸ e per la co-somministrazione di mRNA Cas9 e RNA guida per la somministrazione del sistema CRISPR-Cas9 per l'editing genetico⁹. Tuttavia, non esiste una formulazione specifica adatta a tutte le applicazioni e sottili cambiamenti nei parametri di formulazione di LNP possono influenzare notevolmente la potenza e la biodistribuzione in vivo 8,10,11. Pertanto, i singoli mRNA-LNP devono essere sviluppati e valutati per determinare la formulazione ottimale per ciascuna terapia a base di LNP.

Le LNP sono comunemente formulate con quattro componenti lipidici: un lipide ionizzabile, un fosfolipide, il colesterolo e un coniugato polietilenglicole (PEG) ancorato ai lipidi (lipid-PEG)^11,12,13. Il potente rilascio intracellulare facilitato dalle LNP si basa, in parte, sulla componente lipidica ionizzabile¹². Questo componente è neutro a pH fisiologico ma si carica positivamente nell'ambiente acido dell'endosoma¹¹. Si ritiene che questo cambiamento nella carica ionica sia un fattore chiave per la fuga endosomiale^12,14,15. Oltre al lipide ionizzabile, la componente fosfolipidica (lipide helper) migliora l'incapsulamento del carico e aiuta nella fuga endosomiale, il colesterolo offre stabilità e migliora la fusione della membrana e il lipide-PEG riduce al minimo l'aggregazione e l'opsonizzazione di LNP in circolazione^10,11,14,16. Per formulare l'LNP, questi componenti lipidici vengono combinati in una fase organica, tipicamente etanolo, e miscelati con una fase acquosa contenente il carico di acido nucleico. Il processo di formulazione di LNP è molto versatile in quanto consente di sostituire e combinare facilmente diversi componenti a diversi rapporti molari al fine di formulare molte formulazioni di LNP con una moltitudine di proprietà fisico-chimiche^10,17. Tuttavia, quando si esplora questa vasta varietà di LNP, è fondamentale che ogni formulazione venga valutata utilizzando una procedura standardizzata per misurare con precisione le differenze nella caratterizzazione e nelle prestazioni.

Qui viene delineato il flusso di lavoro completo per la formulazione di mRNA-LNP e la valutazione delle loro prestazioni in cellule e animali.

Protocollo

NOTA: Mantenere sempre condizioni prive di RNasi durante la formulazione di mRNA-LNP pulendo le superfici e le apparecchiature con un decontaminante di superficie per RNasi e DNA. Utilizzare solo puntali e reagenti privi di RNasi.

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Università della Pennsylvania e un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Pennsylvania.

1. Preparazione pre-formulazione

1. Riempire un becher pulito da 4 L con 200-300 ml di soluzione salina fresca tamponata con fosfato (PBS).
   1. Diluire il PBS 10x nel becher 10 volte con acqua ultrapura per ottenere un becher di PBS 1x. Assicurarsi che il volume finale del PBS 1x sia compreso tra 2-3 L.
   2. Inserire le cassette per dialisi (20 kDa di taglio del peso molecolare [MWCO]) della capacità appropriata per la formulazione di LNP nel becher riempito per idratarle.
      NOTA: Le cassette per dialisi richiedono un minimo di 2 minuti per idratarsi prima dell'uso.
   3. Metti una barra di agitazione nel bicchiere e copri il bicchiere con un foglio di alluminio.
   4. Posizionare il becher coperto su una piastra magnetica per mescolare. Accendere la piastra di agitazione e impostarla in modo che giri a 300-400 giri/min.
2. Diluire 10 volte una riserva tampone di acido citrico da 100 mM (pH 3) con acqua ultrapura per creare il tampone di acido citrico da 10 mM utilizzato per la diluizione dell'mRNA.
3. Produrre soluzioni stock di lipidi ionizzabili C12-200, lipidi helper, colesterolo e PEG (lipid-PEG) ancorati ai lipidi sciogliendo ciascun lipide in etanolo al 100%. Le concentrazioni dei componenti lipidici sono dettagliate nella Tabella 1.
   1. Riscaldare e miscelare le soluzioni madre a 37 °C per assicurarsi che siano completamente sciolte.

2. Preparazione delle miscele di lipidi e acidi nucleici

1. Calcolare i volumi richiesti di lipidi ionizzabili, lipidi helper, colesterolo e lipidi-PEG in base al rapporto molare desiderato e al rapporto lipidi ionizzabili/mRNA (Tabella 1). Preparare il 10% in più di volume della fase organica per tenere conto del volume morto nelle siringhe durante la formulazione.
   1. Combina i volumi calcolati dei diversi componenti lipidici in una provetta conica.
   2. Diluire i lipidi con etanolo al 100% fino a ottenere un volume finale, V, che rappresenta il 25% del volume finale di LNP.
2. Calcolare la quantità di mRNA necessaria per la formulazione in base al rapporto tra lipidi ionizzabili e peso dell'mRNA e al volume totale di mRNA-LNP necessario (Tabella 1).
   1. Scongelare l'mRNA che codifica per la luciferasi della lucciola sul ghiaccio.
   2. Diluire l'mRNA a un volume finale, 3V, tre volte il volume della fase organica, in tampone di acido citrico 10 mM.
      NOTA: Ogni volume lipidico, V, deve contenere una quantità sufficiente di lipidi ionizzabili per l'mRNA diluito in 3V. Ciò corrisponde al rapporto desiderato tra lipidi ionizzabili e mRNA in peso.

3. Formulazione microfluidica di mRNA-LNP

1. Spruzzare una salvietta delicata con un decontaminante per superfici per RNasi e DNA e pulire accuratamente l'interno dello strumento microfluidico.
   1. Aprire una nuova cartuccia microfluidica e inserirla con i canali di ingresso rivolti verso il basso e in direzione opposta.
   2. Assicurarsi che il braccio conico della provetta contenga due provette coniche da 15 mL e che sia nella posizione più a destra.
   3. Configurare due provette coniche sterili da 15 mL sul supporto con i tappi rimossi.
2. Riempire una siringa da 5 mL con la soluzione di mRNA contenente mRNA diluito in tampone di acido citrico da 10 mM.
   1. Riempire una siringa da 3 ml con la soluzione lipidica che contiene i lipidi diluiti in etanolo puro al 100%.
   2. Sollevare il supporto della cartuccia sul dispositivo microfluidico.
   3. Inserire la siringa da 5 ml, senza l'ago, che contiene mRNA nell'ingresso sinistro della cartuccia.
   4. Inserire la siringa da 3 ml, senza l'ago, che contiene lipidi nell'ingresso destro della cartuccia.
   5. Capovolgere il supporto della cartuccia verso il basso e chiudere il coperchio dello strumento microfluidico.
3. Accendere lo strumento microfluidico utilizzando l'interruttore situato sul retro dello strumento.
   1. Selezionare Esecuzione rapida.
   2. Selezionare i tipi di siringa corretti per le siringhe da 5 mL e 3 mL inserite.
   3. Inserire i parametri per la formulazione di mRNA-LNP con un rapporto di flusso acquoso/organico di 3:1 come descritto nella Tabella 2.
   4. Premere il pulsante Avanti per passare alla schermata successiva.
   5. Verificare che siano stati inseriti i parametri corretti.
   6. Premere il pulsante Start per formulare gli mRNA-LNP.

4. Processamento post-formulazione e caratterizzazione degli mRNA-LNP

1. Caricare gli mRNA-LNP raccolti nella provetta conica destra nelle cassette di dialisi precedentemente idratate.
   NOTA: Non forare o danneggiare la membrana della cassetta durante il caricamento degli mRNA-LNP. Se la membrana è danneggiata, gli mRNA-LNP andranno persi durante il carico.
   1. Riposizionare le cassette di dialisi contenenti gli mRNA-LNP nel becher contenente 1x PBS e lasciarle dializzare per almeno 2 ore.
   2. Dopo la dialisi, portare le cassette di dialisi contenenti gli mRNA-LNP in una cabina sterile di biosicurezza e rimuovere gli mRNA-LNP utilizzando una siringa con un ago.
   3. Filtrare sterile gli mRNA-LNP utilizzando un filtro a siringa da 0,22 μm e raccoglierli in una provetta conica sterile.
   4. Inserire 65 μL della soluzione di mRNA-LNP in una microprovetta da 1,5 mL a scopo di caratterizzazione.
2. Diluire 10 μL di mRNA-LNPs 1:100 in 990 μL di 1x PBS in una cuvetta per la misurazione delle dimensioni idrodinamiche e dell'indice di polidispersità utilizzando la diffusione dinamica della luce.
3. Valutare la concentrazione e l'efficienza di incapsulamento degli mRNA-LNP utilizzando un saggio di fluorescenza (i.e., RiboGreen).
   1. Preparare una soluzione madre di 1x tampone TE diluendo 20x tampone TE con acqua di biologia molecolare.
   2. Preparare una soluzione madre di tampone Triton X-100 all'1% diluendo Triton X-100 con 1x tampone TE.
   3. Preparare il reagente fluorescente diluendo la scorta di reagenti 1:200 con 1x tampone TE.
   4. Diluire gli mRNA-LNP 1:100 in 1x tampone TE e 1% tampone Triton X-100 in una piastra a 96 pozzetti a fondo nero a parete nera in 100 μL.
   5. Preparare una curva standard a bassa gamma diluendo lo standard di RNA secondo le istruzioni del produttore e placcare la curva standard nella piastra a 96 pozzetti.
   6. Aggiungere 100 μL di reagente fluorescente diluito a ciascun pozzetto contenente mRNA-LNP diluito o standard diluito.
   7. Posizionare la piastra a 96 pozzetti all'interno di un lettore di piastre e agitare per 1 minuto, seguito da un'attesa di 4 minuti.
   8. Misurare l'intensità della fluorescenza di ciascun pozzetto secondo il protocollo del produttore a un'eccitazione/emissione di 480 nm/520 nm.
4. Utilizzare la curva standard per convertire i valori di fluorescenza in concentrazioni.
   1. Calcolare l'efficienza di incapsulamento sottraendo il valore ottenuto dalla diluizione delle LNP nel tampone TE (mRNA non incapsulato) dal valore ottenuto dalla diluizione delle LNP in Triton X-100 all'1% (mRNA totale) e dividendo per il valore ottenuto dalla diluizione delle LNP in Triton X-100 all'1%, secondo l'equazione 4.4.
   2. Calcolare la concentrazione di mRNA-LNP utilizzata per gli studi su cellule e animali sottraendo il valore ottenuto dalla diluizione delle LNP nel tampone TE (mRNA non incapsulato) dal valore ottenuto dalla diluizione delle LNP in Triton X-100 all'1% (mRNA totale).
5. Misurare la pK_a degli mRNA-LNP eseguendo un test del cloruro di 6-(p-toluidino)-2-naftalensulfonil (TNS).
   1. Preparare il reagente TNS creando una soluzione 0,16 mM di TNS in acqua ultrapura.
      NOTA: Quando si utilizza il reagente, assicurarsi di tenerlo sul ghiaccio e al riparo dalla luce per evitare la degradazione.
   2. Preparare soluzioni tamponate di 150 mM di cloruro di sodio, 20 mM di fosfato di sodio, 25 mM di citrato di ammonio e 20 mM di acetato di ammonio regolate a diversi valori di pH compresi tra 2 e 12 con incrementi di 0,5.
   3. Aggiungere 2,5 μL di LNP a ciascuna soluzione tampone a pH aggiustato in una piastra a 96 pozzetti a fondo nero a parete nera.
   4. Aggiungere il reagente TNS a ciascun pozzetto in modo che la concentrazione finale di TNS sia di 6 μM.
   5. Incubare la piastra a 96 pozzetti in un luogo buio per 5 minuti.
   6. Misurare la fluorescenza a un'eccitazione/emissione di 322 nm/431 nm utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza.
   7. Adattare i dati a una curva sigmoidale e calcolare il pK_a utilizzando l'equazione adattata per trovare il pH al quale è stato osservato il 50% dell'intensità massima.
6. I risultati rappresentativi per le dimensioni idrodinamiche dell'mRNA-LNP, la PDI, l'efficienza di incapsulamento e la pK_a sono mostrati nella Tabella 3.

5. Trasfezione in vitro di cellule HepG2

NOTA: Varie altre linee cellulari, come le cellule HeLa o le cellule HEK-293T, possono essere utilizzate per valutare l'efficienza di trasfezione delle LNP in vitro. Tutte le cellule devono risultare negative al test per il micoplasma prima degli studi di trasfezione LNP.

1. Piastra 5.000 cellule HepG2 in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo trasparente a parete bianca in 100 μL di terreno di coltura cellulare completo (DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina)
   1. Lasciare agire le cellule per una notte in un incubatore a CO 2 controllato a 37 °C e al 5% di CO₂ .
2. Diluire gli mRNA-LNP in un terreno di coltura cellulare completo in modo che la dose totale sia erogata in 100 μL.
   1. Rimuovere il terreno completo dai pozzetti.
   2. Trattare le cellule con mRNA-LNP diluiti in terreno di coltura cellulare completo alle dosi desiderate o con terreno completo (controllo).
   3. Rimettere la piastra a 96 pozzetti contenente le cellule trattate nell'incubatore a CO₂ controllato per 24 ore.
3. Valutare l'efficienza di trasfezione eseguendo un saggio della luciferasi.
   1. Preparare il reagente luciferasi e 1x tampone di lisi cellulare secondo le istruzioni del produttore.
   2. Estrarre la piastra a 96 pozzetti contenente le cellule dall'incubatore e portarla in un armadio di biosicurezza.
   3. Rimuovere il terreno di coltura cellulare da ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
   4. Aggiungere 20 μL di tampone di lisi 1x a ciascun pozzetto, seguiti da 100 μL del reagente del saggio della luciferasi precedentemente preparato.
   5. Proteggere la piastra dalla luce e posizionare la piastra in un lettore di piastre per misurare il segnale bioluminescente di ciascun pozzetto.
      NOTA: Nella Figura 1 sono riportati risultati rappresentativi che dimostrano il trattamento delle cellule HepG2 con mRNA-LNP C12-200 precedentemente formulati.

6. Valutazione in vivo di mRNA-LNPs nei topi dopo iniezione nella vena caudale

1. Diluire la soluzione di mRNA-LNP con 1x PBS sterile in modo che siano presenti 2 μg di mRNA totale in un volume di iniezione della vena caudale di 100 μL, che corrisponde a una dose di peso corporeo di circa 0,1 mg/kg per un topo di 20 g.
2. Trattieni ogni topo utilizzando un metodo approvato e pulisci la coda con un tampone inumidito con alcol al 70%.
   1. Riempire una siringa da insulina da 29 g con 100 μL di mRNA-LNP (2 μg) o 100 μL di 1x PBS. Rimuovere eventuali bolle dalla siringa.
   2. Inserire l'ago con lo smusso rivolto verso l'alto nella vena caudale laterale del topo e iniettare lentamente i 100 μL di mRNA-LNP o 1x PBS.
   3. Rimuovere l'ago e applicare pressione fino a raggiungere l'emostasi.
3. Preparare una soluzione madre di 15 mg/mL di sale di potassio d-luciferina in 1x PBS sterile 6 ore dopo l'iniezione.
   1. Accendere il sistema di imaging in vivo (IVIS) e aprire il software di imaging.
   2. Premere Initialize (Inizializza) per preparare lo strumento per l'acquisizione dei dati.
   3. Seleziona la casella accanto a luminescenza e imposta il tempo di esposizione su auto. Assicurarsi che sia selezionato il campo visivo corretto per il numero di topi ripresi.
   4. Somministrare 200 μL di d-luciferina per via intraperitoneale (150 mg di luciferina per kg di peso corporeo) ai topi precedentemente trattati.
   5. Posizionare i topi in una camera di anestesia impostata su isoflurano al 2,5% e una portata di ossigeno di 2,0 L/min.
   6. Attendere 10 minuti affinché il segnale della luciferasi si stabilizzi prima di eseguire l'imaging dei topi trattati con mRNA-LNP.
   7. Assicurarsi che i topi siano completamente anestetizzati e reindirizzare la linea anestetica per somministrare l'isoflurano attraverso i coni nasali all'interno della camera di imaging.
   8. Trasferisci i topi sui coni del naso e assicurati che siano sulla schiena con l'addome esposto.
   9. Chiudere lo sportello della camera e fare clic sul pulsante Acquisisci nel software per ottenere immagini di bioluminescenza.
      NOTA: I risultati rappresentativi per l'imaging di tutto il corpo nel topo dopo il trattamento con mRNA-LNP o PBS 1X sono mostrati nella Figura 2.

Risultati

Gli mRNA-LNP sono stati formulati utilizzando uno strumento microfluidico che possedeva un diametro idrodinamico medio di 76,16 nm e un indice di polidispersità di 0,098. Il pK_a degli mRNA-LNP è risultato essere 5,75 eseguendo un test TNS¹⁸. L'efficienza di incapsulamento per questi mRNA-LNP è stata calcolata al 92,3% utilizzando il saggio di fluorescenza modificato e l'equazione 4.4. La concentrazione complessiva di RNA utilizzata per il trattamento cellula...

Discussione

Con questo flusso di lavoro, una varietà di mRNA-LNP può essere formulata e testata per la loro efficienza in vitro e in vivo. I lipidi ionizzabili e gli eccipienti possono essere scambiati e combinati con diversi rapporti molari e diversi rapporti di peso tra lipidi ionizzabili e mRNA per produrre mRNA-LNP con diverse proprietà fisico-chimiche²². Qui, abbiamo formulato C12-200 mRNA-LNP con un rapporto molare di 35/16/46,5/2,5 (lipide ionizzabile:lipide helper:colesterolo:lipi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Hydrochloric Acid	Sigma	7647-01-0
0.22 μm Syringe Filters	Genesee	25-243
1 mL BD Slip Tip Syringe	BD	309659
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)	Avanti Polar Lipids	880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725P
1.5 mL Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
200 proof Ethanol	Decon Labs	2716
23G Needles	Fisher Scientific	14-826-6C
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips	Fisher Scientific	14-823-435
3 mL Dialysis Cassettes	Thermo Scientific	A52976
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Scientific	165306
Ammonium Acetate, 1 Kilogram	Research Products International	631-61-8
Ammonium Citrate dibasic	SIgma	3012-65-5
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL	BD	309646
C12-200 Ionizable Lipid	Cayman Chemical	36699
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664
Cholesterol	Sigma	57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7202
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14955129
D-Luciferin, Potassium Salt	Thermo Scientific	L2916
DMEM, high glucose	Thermofisher Scientific	11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mL	Fisher Scientific	1484132
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]	ATCC	HB-8065
HyPure Molecular Biology Grade Water	Cytiva	SH30538.03
Infinite 200 PRO Plate Reader	Tecan	N/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	N/A
Large Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-11D
Luciferase Assay Kit	Promega	E4550
NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack	Precision Nanosystems	NIN0065
NanoAssemblr Ignite Instrument	Precision Nanosystems	NIN0001
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0	Teknova	Q2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit	Thermo Scientific	R11490
Reporter Lysis 5x Buffer	Promega	E3971
RNase Away Surface Decontaminant	Thermofisher Scientific	7000TS1
Sodium Chloride	Sigma	7647-14-5
Sodium Hydroxide	Sigma	1310-73-2
Sodium Phosphate	Sigma	7601-54-9
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)	Sigma	T9792
Triton X-100	Sigma	9036-19-5
Zetasizer	Malvern Panalytical	NanoZS