Tester l’efficacité in vitro et in vivo de nanoparticules d’ARNm-lipides formulées par mélange microfluidique

Résumé

Ici, un protocole de formulation de nanoparticules lipidiques (LNP) qui encapsulent l’ARNm codant pour la luciférase lucifly est présenté. Ces LNP ont été testés pour leur puissance in vitro dans des cellules HepG2 et in vivo chez des souris C57BL/6.

Résumé

Les nanoparticules lipidiques (LNP) ont récemment attiré l’attention avec le développement réussi des vaccins à ARNm contre la COVID-19 par Moderna et Pfizer/BioNTech. Ces vaccins ont démontré l’efficacité des thérapies à base d’ARNm-LNP et ont ouvert la voie à de futures applications cliniques. Dans les systèmes ARNm-LNP, les LNP servent de plates-formes d’administration qui protègent la cargaison d’ARNm de la dégradation par les nucléases et interviennent dans leur livraison intracellulaire. Les LNP sont généralement composés de quatre composants : un lipide ionisable, un phospholipide, du cholestérol et un conjugué de polyéthylène glycol (PEG) ancré dans les lipides (lipide-PEG). Ici, les LNP encapsulant l’ARNm codant pour la luciférase luciole sont formulés par mélange microfluidique de la phase organique contenant les composants lipidiques du LNP et de la phase aqueuse contenant l’ARNm. Ces ARNm-LNP sont ensuite testés in vitro pour évaluer leur efficacité de transfection dans les cellules HepG2 à l’aide d’un test bioluminescent sur plaque. De plus, les ARNm-LNP sont évalués in vivo chez des souris C57BL/6 à la suite d’une injection intraveineuse via la veine caudale latérale. L’imagerie par bioluminescence du corps entier est réalisée à l’aide d’un système d’imagerie in vivo . Des résultats représentatifs sont présentés pour les caractéristiques de l’ARNm-LNP, leur efficacité de transfection dans les cellules HepG2 et le flux luminescent total chez les souris C57BL/6.

Introduction

Les nanoparticules lipidiques (LNP) se sont révélées très prometteuses ces dernières années dans le domaine de la thérapie génique non virale. En 2018, la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a approuvé le tout premier traitement d’interférence ARN (ARNi), Onpattro d’Alnylam, pour le traitement de l’amylose héréditaire à transthyrétine 1,2,3,4. Il s’agit d’une avancée importante pour les nanoparticules lipidiques et les thérapies à base d’ARN. Plus récemment, Moderna et Pfizer/BioNTech ont reçu l’approbation de la FDA pour leurs vaccins à ARNm-LNP contre le SRAS-CoV-2 ^4,5. Dans chacune de ces thérapies à base d’acides nucléiques à base de LNP, le LNP sert à protéger sa cargaison de la dégradation par les nucléases et à faciliter une administration intracellulaire puissante ^6,7. Alors que les LNP ont connu du succès dans les thérapies à base d’ARNi et les applications vaccinales, les ARNm-LNP ont également été explorés pour une utilisation dans les thérapies de remplacement des protéines⁸ ainsi que pour la co-livraison de l’ARNm Cas9 et de l’ARN guide pour l’administration du système CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes⁹. Cependant, il n’existe pas de formulation spécifique qui convienne à toutes les applications, et des changements subtils dans les paramètres de formulation du LNP peuvent grandement affecter la puissance et la biodistribution in vivo 8,10,11. Ainsi, des ARNm-LNP individuels doivent être développés et évalués afin de déterminer la formulation optimale pour chaque thérapie à base de LNP.

Les LNP sont généralement formulés avec quatre composants lipidiques : un lipide ionisable, un phospholipide, du cholestérol et un conjugué polyéthylène-glycol (PEG) ancré dans les lipides (lipide-PEG)^11,12,13. La puissante délivrance intracellulaire facilitée par les LNP repose, en partie, sur le composant lipidique ionisable¹². Ce composant est neutre au pH physiologique mais se charge positivement dans l’environnement acide de l’endosome¹¹. On pense que ce changement de charge ionique est un contributeur clé à l’échappement endosomal^12,14,15. En plus du lipide ionisable, le composant phospholipide (lipide auxiliaire) améliore l’encapsulation de la cargaison et aide à l’échappement endosomal, le cholestérol offre une stabilité et améliore la fusion membranaire, et le lipide-PEG minimise l’agrégation et l’opsonisation du LNP dans la circulation^10,11,14,16. Pour formuler le LNP, ces composants lipidiques sont combinés dans une phase organique, généralement de l’éthanol, et mélangés à une phase aqueuse contenant la cargaison d’acide nucléique. Le procédé de formulation du LNP est très polyvalent en ce sens qu’il permet de substituer et de combiner facilement différents composants à différents rapports molaires afin de formuler de nombreuses formulations de LNP avec une multitude de propriétés physico-chimiques^10,17. Cependant, lors de l’exploration de cette grande variété de LNP, il est crucial que chaque formulation soit évaluée à l’aide d’une procédure standardisée pour mesurer avec précision les différences de caractérisation et de performance.

Ici, le flux de travail complet pour la formulation des ARNm-LNP et l’évaluation de leurs performances dans les cellules et les animaux sont décrits.

Protocole

REMARQUE : Maintenez toujours des conditions exemptes de RNase lors de la formulation de RNm-LNP en essuyant les surfaces et l’équipement avec un décontaminant de surface pour les RNases et l’ADN. N’utilisez que des embouts et des réactifs sans RNase.

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Pennsylvanie et à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Pennsylvanie.

1. Préparation de la pré-formulation

1. Remplissez un bécher propre de 4 L avec 200 à 300 ml de solution saline fraîche tamponnée au phosphate (PBS) 10x.
   1. Diluer 10 fois le 10x PBS dans le bécher avec de l’eau ultra-pure pour obtenir un bécher de 1x PBS. Assurez-vous que le volume final du PBS 1x est compris entre 2 et 3 L.
   2. Placer des cassettes de dialyse (seuil de poids moléculaire de 20 kDa [MWCO]) de la capacité appropriée pour la formulation de LNP dans le bécher rempli pour les hydrater.
      REMARQUE : Les cassettes de dialyse nécessitent un minimum de 2 minutes pour s’hydrater avant utilisation.
   3. Placez une barre de mélange dans le bécher et couvrez le bécher de papier d’aluminium.
   4. Placez le bécher couvert sur une plaque d’agitation magnétique. Allumez la plaque d’agitation et réglez-la pour qu’elle tourne à 300-400 tr/min.
2. Diluer 10 fois un tampon d’acide citrique de 100 mM (pH 3) avec de l’eau ultrapure pour créer le tampon d’acide citrique de 10 mM utilisé pour la dilution de l’ARNm.
3. Fabriquez des solutions mères de lipides ionisables C12-200, de lipides auxiliaires, de cholestérol et de PEG ancré dans les lipides (lipid-PEG) en dissolvant chaque lipide dans de l’éthanol à 100 %. Les concentrations des composants lipidiques sont détaillées dans le tableau 1.
   1. Chauffer et mélanger les solutions mères à 37 °C pour s’assurer qu’elles sont complètement dissoutes.

2. Préparation des mélanges de lipides et d’acides nucléiques

1. Calculez les volumes requis de lipides ionisables, de lipides auxiliaires, de cholestérol et de lipides-PEG en fonction du rapport molaire souhaité et du rapport lipides/poids de l’ARNm ionisable (tableau 1). Préparer 10 % de volume supplémentaire de la phase organique pour tenir compte du volume mort dans les seringues pendant la formulation.
   1. Combinez les volumes calculés des différents composants lipidiques dans un tube conique.
   2. Diluer les lipides avec de l’éthanol à 100 % jusqu’à obtenir un volume final, V, qui représente 25 % du volume final de GNL.
2. Calculez la quantité d’ARNm nécessaire à la formulation en fonction du rapport lipide/poids de l’ARNm ionisable et du volume total d’ARNm-LNP nécessaire (tableau 1).
   1. Décongeler l’ARNm codant pour la luciférase des lucioles sur de la glace.
   2. Diluer l’ARNm à un volume final, 3V, trois fois le volume de la phase organique, dans un tampon d’acide citrique de 10 mM.
      REMARQUE : Chaque volume lipidique, V, doit contenir suffisamment de lipides ionisables pour l’ARNm dilué dans 3V. Cela correspond au rapport lipide ionisable/poids de l’ARNm souhaité.

3. Formulation microfluidique des ARNm-LNP

1. Vaporisez une lingette délicate avec un décontaminant de surface pour les RNases et l’ADN, et essuyez soigneusement l’intérieur de l’instrument microfluidique.
   1. Ouvrez une nouvelle cartouche microfluidique et insérez-la avec les canaux d’entrée vers le bas et vers l’extérieur.
   2. Assurez-vous que le bras du tube conique contient deux tubes coniques de 15 ml et qu’il est dans la position la plus à droite.
   3. Configurez deux tubes coniques stériles de 15 ml sur le support sans les bouchons.
2. Remplissez une seringue de 5 mL avec la solution d’ARNm qui contient de l’ARNm dilué dans un tampon d’acide citrique de 10 mM.
   1. Remplir une seringue de 3 mL avec la solution lipidique qui contient les lipides dilués dans de l’éthanol pur à 100 %.
   2. Relevez le porte-cartouche sur le dispositif microfluidique.
   3. Insérez la seringue de 5 ml, sans l’aiguille, qui contient l’ARNm dans l’entrée gauche de la cartouche.
   4. Insérez la seringue de 3 ml, sans l’aiguille, qui contient les lipides dans l’entrée droite de la cartouche.
   5. Retournez le porte-cartouche vers le bas et fermez le couvercle de l’instrument microfluidique.
3. Allumez l’instrument microfluidique à l’aide de l’interrupteur situé à l’arrière de l’instrument.
   1. Sélectionnez Exécution rapide.
   2. Sélectionnez les types de seringues appropriés pour les seringues de 5 ml et de 3 ml insérées.
   3. Entrez les paramètres de formulation de l’ARNm-LNP à un rapport de débit aqueux/organique de 3 :1, comme décrit dans le tableau 2.
   4. Appuyez sur le bouton Suivant pour passer à l’écran suivant.
   5. Vérifiez que les paramètres corrects ont été saisis.
   6. Appuyez sur le bouton Start pour formuler les ARNm-LNP.

4. Traitement post-formulation et caractérisation des ARNm-LNP

1. Chargez les ARNm-LNP collectés dans le tube conique droit dans les cassettes de dialyse préalablement hydratées.
   REMARQUE : Ne percez pas ou n’endommagez pas la membrane de la cassette lors du chargement des ARNm-LNP. Si la membrane est endommagée, les ARNm-LNP seront perdus lors du chargement.
   1. Replacer les cassettes de dialyse contenant les ARNm-LNP dans le bécher contenant 1x PBS, et les laisser se dialyser pendant au moins 2 h.
   2. Après la dialyse, amenez les cassettes de dialyse contenant les ARNm-LNP dans une enceinte de sécurité biologique stérile et retirez les ARNm-LNP à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille.
   3. Filtrer stérilement les ARNm-LNP à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm et les recueillir dans un tube conique stérile.
   4. Placer 65 μL de la solution d’ARNm-LNP dans un microtube de 1,5 mL à des fins de caractérisation.
2. Diluer 10 μL d’ARNm-LNP 1 :100 dans 990 μL de PBS 1x dans une cuvette pour la mesure de la taille hydrodynamique et de l’indice de polydispersité par diffusion dynamique de la lumière.
3. Évaluer la concentration et l’efficacité d’encapsulation des ARNm-LNP à l’aide d’un test de fluorescence (c.-à-d. RiboGreen).
   1. Préparer une solution mère de 1x tampon TE en diluant 20x tampon TE avec de l’eau de biologie moléculaire.
   2. Préparez une solution mère de tampon Triton X-100 à 1 % en diluant Triton X-100 avec 1 tampon TE.
   3. Préparez le réactif fluorescent en diluant le stock de réactifs 1 :200 avec 1x tampon TE.
   4. Diluer les ARNm-LNP 1 :100 dans 1x tampon TE et 1% de tampon Triton X-100 dans une plaque à 96 puits à paroi noire et à 100 μL.
   5. Préparez une courbe standard de plage inférieure en diluant l’étalon d’ARN conformément aux instructions du fabricant et plaquez la courbe standard dans la plaque à 96 puits.
   6. Ajouter 100 μL de réactif fluorescent dilué dans chaque puits contenant de l’ARNm-LNP dilué ou un étalon dilué.
   7. Placez la plaque à 96 puits à l’intérieur d’un lecteur de plaques et secouez pendant 1 minute, suivie d’une attente de 4 minutes.
   8. Mesurer l’intensité de fluorescence de chaque puits selon le protocole du fabricant à une excitation/émission de 480 nm/520 nm.
4. Utilisez la courbe standard pour convertir les valeurs de fluorescence en concentrations.
   1. Calculer l’efficacité d’encapsulation en soustrayant la valeur obtenue en diluant les LNP dans un tampon TE (ARNm non encapsulé) de la valeur obtenue en diluant les LNP dans 1 % de Triton X-100 (ARNm total) et en divisant par la valeur obtenue en diluant les LNP dans 1 % de Triton X-100, conformément à l’équation 4.4.
   2. Calculer la concentration d’ARNm-LNP utilisée pour les études cellulaires et animales en soustrayant la valeur obtenue en diluant les LNP dans un tampon TE (ARNm non encapsulé) de la valeur obtenue en diluant les LNP dans 1 % de Triton X-100 (ARNm total).
5. Mesurer le pK_a des ARNm-LNP en effectuant un dosage du chlorure de 6-(p-toluidino)-2-naphtalènesulfonyle (TNS).
   1. Préparez le réactif TNS en créant une solution de TNS à 0,16 mM dans de l’eau ultra-pure.
      REMARQUE : Lorsque vous utilisez le réactif, assurez-vous de le conserver sur de la glace et à l’abri de la lumière pour éviter toute dégradation.
   2. Préparez des solutions tamponnées de 150 mM de chlorure de sodium, 20 mM de phosphate de sodium, 25 mM de citrate d’ammonium et 20 mM d’acétate d’ammonium ajustées à différentes valeurs de pH allant de 2 à 12 par incréments de 0,5.
   3. Ajouter 2,5 μL de LNP à chaque solution tampon à pH ajusté dans une plaque à 96 puits à paroi noire et à fond noir.
   4. Ajouter le réactif TNS dans chaque puits de manière à ce que la concentration finale de TNS soit de 6 μM.
   5. Incuber la plaque à 96 puits dans un endroit sombre pendant 5 min.
   6. Mesurez la fluorescence à une excitation/émission de 322 nm/431 nm à l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence.
   7. Ajustez les données à une courbe sigmoïdale et calculez le pK a à l’aide de l’équation ajustée pour trouver le pH auquel 50 % de l’intensité maximale _a été observée.
6. Le tableau 3 présente des résultats représentatifs de la taille hydrodynamique de l’ARNm-LNP, de la PDI, de _{l’efficacité} d’encapsulation et du pK a.

5. Transfection in vitro de cellules HepG2

REMARQUE : Diverses autres lignées cellulaires, telles que les cellules HeLa ou les cellules HEK-293T, peuvent être utilisées pour évaluer l’efficacité de la transfection des LNP in vitro. Toutes les cellules doivent être testées négatives pour les mycoplasmes avant les études de transfection de LNP.

1. Plaquer 5 000 cellules HepG2 dans chaque puits d’une plaque à fond transparent à 96 puits à paroi blanche dans 100 μL de milieu de culture cellulaire complet (DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine)
   1. Laisser les cellules adhérer toute la nuit dans un incubateur contrôlé de CO 2 à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Diluer les ARNm-LNP dans un milieu de culture cellulaire complet afin que la dose totale soit délivrée dans 100 μL.
   1. Retirez le milieu complet des puits.
   2. Traiter les cellules avec des ARNm-LNP dilués dans un milieu de culture cellulaire complet aux doses désirées ou un milieu complet (témoin).
   3. Replacez la plaque à 96 puits contenant les cellules traitées dans l’incubateur contrôlé de CO₂ pendant 24 heures.
3. Évaluez l’efficacité de la transfection en effectuant un dosage de la luciférase.
   1. Préparez le réactif de luciférase et 1x tampon de lyse cellulaire selon les instructions du fabricant.
   2. Sortez la plaque de 96 puits contenant les cellules de l’incubateur et apportez-la dans une enceinte de sécurité biologique.
   3. Retirez le milieu de culture cellulaire de chaque puits de la plaque à 96 puits.
   4. Ajouter 20 μL de tampon de lyse 1x dans chaque puits, puis 100 μL du réactif de dosage de la luciférase préalablement préparé.
   5. Protégez la plaque de la lumière et placez-la dans un lecteur de plaques pour mesurer le signal bioluminescent de chaque puits.
      NOTA : La figure 1 présente des résultats représentatifs démontrant le traitement des cellules HepG2 avec des ARNm-LNP C12-200 formulés antérieurement.

6. Évaluation in vivo des ARNm-LNP chez la souris après injection dans la veine caudale

1. Diluer la solution d’ARNm-LNP avec 1x PBS stérile de manière à ce que 2 μg d’ARNm total soient présents dans un volume d’injection de 100 μL dans la veine de la queue, ce qui correspond à une dose de poids corporel d’environ 0,1 mg/kg pour une souris de 20 g.
2. Immobilisez chaque souris à l’aide d’une méthode approuvée et essuyez la queue avec un tampon imbibé d’alcool à 70 %.
   1. Remplissez une seringue à insuline de 29 G avec 100 μL d’ARNm-LNP (2 μg) ou 100 μL de PBS 1x. Retirez toutes les bulles de la seringue.
   2. Insérez l’aiguille avec le biseau vers le haut dans la veine caudale latérale de la souris et injectez lentement les 100 μL d’ARNm-LNP ou 1x PBS.
   3. Retirez l’aiguille et appliquez une pression jusqu’à ce que l’hémostase soit atteinte.
3. Préparer une solution mère de 15 mg/mL de sel de potassium de d-luciférine dans 1x PBS stérile 6 heures après l’injection.
   1. Allumez le système d’imagerie in vivo (IVIS) et ouvrez le logiciel d’imagerie.
   2. Appuyez sur Initialiser pour préparer l’instrument à l’acquisition de données.
   3. Cochez la case à côté de la luminescence et réglez le temps d’exposition sur auto. Assurez-vous que le champ de vision correct est sélectionné pour le nombre de souris photographiées.
   4. Administrer 200 μL de d-luciférine par voie intrapéritonéale (150 mg de luciférine par kg de poids corporel) aux souris précédemment traitées.
   5. Placez les souris dans une chambre d’anesthésie réglée à 2,5 % d’isoflurane et à un débit d’oxygène de 2,0 L/min.
   6. Attendez 10 min que le signal de la luciférase se stabilise avant d’imager les souris traitées à l’ARNm-LNP.
   7. Assurez-vous que les souris sont complètement anesthésiées et redirigez la ligne d’anesthésie pour administrer l’isoflurane via des cônes nasaux à l’intérieur de la chambre d’imagerie.
   8. Transférez les souris sur les cônes nasaux et assurez-vous qu’elles sont sur le dos avec leur abdomen exposé.
   9. Fermez la porte de la chambre et cliquez sur le bouton Acquérir dans le logiciel pour obtenir des images de bioluminescence.
      REMARQUE : Des résultats représentatifs de l’imagerie du corps entier de souris après un traitement par ARNm-LNP ou PBS 1X sont présentés à la figure 2.

Résultats

Les ARNm-LNP ont été formulés à l’aide d’un instrument microfluidique possédant un diamètre hydrodynamique moyen de 76,16 nm et un indice de polydispersité de 0,098. Le pK_a des ARNm-LNP s’est avéré être de 5,75 en effectuant un test TNS¹⁸. L’efficacité d’encapsulation de ces ARNm-LNP a été calculée à 92,3 % en utilisant le test de fluorescence modifié et l’équation 4.4. La concentration globale d’ARN utilisée pour le traitement c...

Discussion

Grâce à ce flux de travail, une variété d’ARNm-LNP peuvent être formulés et testés pour leur efficacité in vitro et in vivo. Les lipides et les excipients ionisables peuvent être échangés et combinés à différents rapports molaires et à différents rapports de poids lipides/ARNm ionisables pour produire des ARNm-LNP ayant des propriétés physico-chimiques différentes²². Ici, nous avons formulé des ARNm-LNP C12-200 avec un rapport molaire de 35/16/46,5/2,5 (lipi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Hydrochloric Acid	Sigma	7647-01-0
0.22 μm Syringe Filters	Genesee	25-243
1 mL BD Slip Tip Syringe	BD	309659
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)	Avanti Polar Lipids	880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725P
1.5 mL Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
200 proof Ethanol	Decon Labs	2716
23G Needles	Fisher Scientific	14-826-6C
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips	Fisher Scientific	14-823-435
3 mL Dialysis Cassettes	Thermo Scientific	A52976
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Scientific	165306
Ammonium Acetate, 1 Kilogram	Research Products International	631-61-8
Ammonium Citrate dibasic	SIgma	3012-65-5
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL	BD	309646
C12-200 Ionizable Lipid	Cayman Chemical	36699
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664
Cholesterol	Sigma	57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7202
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14955129
D-Luciferin, Potassium Salt	Thermo Scientific	L2916
DMEM, high glucose	Thermofisher Scientific	11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mL	Fisher Scientific	1484132
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]	ATCC	HB-8065
HyPure Molecular Biology Grade Water	Cytiva	SH30538.03
Infinite 200 PRO Plate Reader	Tecan	N/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	N/A
Large Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-11D
Luciferase Assay Kit	Promega	E4550
NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack	Precision Nanosystems	NIN0065
NanoAssemblr Ignite Instrument	Precision Nanosystems	NIN0001
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0	Teknova	Q2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit	Thermo Scientific	R11490
Reporter Lysis 5x Buffer	Promega	E3971
RNase Away Surface Decontaminant	Thermofisher Scientific	7000TS1
Sodium Chloride	Sigma	7647-14-5
Sodium Hydroxide	Sigma	1310-73-2
Sodium Phosphate	Sigma	7601-54-9
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)	Sigma	T9792
Triton X-100	Sigma	9036-19-5
Zetasizer	Malvern Panalytical	NanoZS