Testando a Eficiência In Vitro e In Vivo de Nanopartículas de RNAm-Lipídios Formuladas por Mistura Microfluídica

Resumo

Aqui, um protocolo para a formulação de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulam RNAm que codifica a luciferase do vagalume é apresentado. Esses LNPs foram testados quanto à sua potência in vitro em células HepG2 e in vivo em camundongos C57BL/6.

Resumo

As nanopartículas lipídicas (LNPs) atraíram atenção generalizada recentemente com o desenvolvimento bem-sucedido das vacinas de mRNA COVID-19 pela Moderna e Pfizer/BioNTech. Essas vacinas demonstraram a eficácia da terapêutica mRNA-LNP e abriram as portas para futuras aplicações clínicas. Em sistemas de mRNA-LNP, os LNPs servem como plataformas de entrega que protegem a carga de mRNA da degradação por nucleases e mediam sua entrega intracelular. Os LNPs são tipicamente compostos por quatro componentes: um lipídio ionizável, um fosfolipídio, colesterol e um conjugado de polietilenoglicol (PEG) ancorado a lipídios (lipid-PEG). Aqui, LNPs encapsulando mRNA que codificam a luciferase de vagalumes são formulados por mistura microfluídica da fase orgânica contendo componentes lipídicos do LNP e da fase aquosa contendo mRNA. Esses mRNA-LNPs são então testados in vitro para avaliar sua eficiência de transfecção em células HepG2 usando um ensaio baseado em placa bioluminescente. Além disso, os mRNA-LNPs são avaliados in vivo em camundongos C57BL/6 após uma injeção intravenosa através da veia lateral da cauda. A imagem de bioluminescência de corpo inteiro é realizada usando um sistema de imagem in vivo . Resultados representativos são mostrados para as características do RNAm-LNP, sua eficiência de transfecção em células HepG2 e o fluxo luminescente total em camundongos C57BL/6.

Introdução

Nanopartículas lipídicas (LNPs) têm se mostrado promissoras nos últimos anos no campo da terapia gênica não viral. Em 2018, a Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos aprovou a primeira terapêutica de RNA de interferência (RNAi), Onpattro by Alnylam, para o tratamento da amiloidose transtirretina hereditária ^1,2,3,4. Este foi um passo importante para nanopartículas lipídicas e terapias baseadas em RNA. Mais recentemente, a Moderna e a Pfizer/BioNTech receberam aprovações da FDA para suas vacinas de mRNA-LNP contra o SARS-CoV-2 ^4,5. Em cada uma dessas terapias de ácidos nucleicos baseadas em LNP, o LNP serve para proteger sua carga da degradação por nucleases e facilitar a potente liberação intracelular ^6,7. Enquanto LNPs têm visto sucesso em terapias de RNAi e aplicações de vacinas, mRNA-LNPs também têm sido explorados para uso em terapias de substituição de proteínas⁸, bem como para a co-entrega de mRNA Cas9 e RNA guia para a entrega do sistema CRISPR-Cas9 para edição de genes⁹. No entanto, não há uma formulação específica que seja adequada para todas as aplicações, e mudanças sutis nos parâmetros de formulação do LNP podem afetar sobremaneira a potência e a biodistribuição in vivo 8,10,11. Assim, RNAm-LNPs individuais devem ser desenvolvidos e avaliados para determinar a formulação ideal para cada terapia baseada em LNP.

Os LNPs são comumente formulados com quatro componentes lipídicos: um lipídio ionizável, um fosfolipídio, colesterol e um conjugado de polietilenoglicol (PEG) ancorado a lipídios (lipid-PEG)^11,12,13. A potente liberação intracelular facilitada pelos LNPs reside, em parte, no componente lipídico ionizável¹². Esse componente é neutro em pH fisiológico, mas torna-se carregado positivamente no ambiente ácido do endossomo¹¹. Acredita-se que essa mudança na carga iônica seja um dos principais contribuintes para o escape endossômico^12,14,15. Além do lipídio ionizável, o componente fosfolipídeo (lipídio auxiliar) melhora a encapsulação da carga e auxilia no escape endossomal, o colesterol oferece estabilidade e aumenta a fusão da membrana, e o lipídio-PEG minimiza a agregação e opsonização do LNP na circulação^10,11,14,16. Para formular o LNP, esses componentes lipídicos são combinados em uma fase orgânica, tipicamente etanol, e misturados com uma fase aquosa contendo a carga de ácido nucleico. O processo de formulação do LNP é muito versátil, pois permite que diferentes componentes sejam facilmente substituídos e combinados em diferentes razões molares para formular muitas formulações de LNP com uma infinidade de propriedades físico-químicas^10,17. No entanto, ao explorar essa grande variedade de LNPs, é crucial que cada formulação seja avaliada usando um procedimento padronizado para medir com precisão as diferenças na caracterização e desempenho.

Aqui, o fluxo de trabalho completo para a formulação de mRNA-LNPs e a avaliação de seu desempenho em células e animais é descrito.

Protocolo

NOTA: Sempre mantenha as condições livres de RNase ao formular mRNA-LNPs, limpando as superfícies e equipamentos com um descontaminante de superfície para RNases e DNA. Use apenas pontas e reagentes sem RNase.

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade da Pensilvânia e um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Pensilvânia.

1. Preparação da pré-formulação

1. Encha um copo limpo de 4 L com 200-300 mL de solução salina fresca tamponada com fosfato (PBS) 10x.
   1. Diluir o 10x PBS no copo 10 vezes com água ultrapura para obter um copo de 1x PBS. Certifique-se de que o volume final do PBS 1x esteja entre 2-3 L.
   2. Coloque os de diálise (20 kDa molecular weight cutoff [MWCO]) da capacidade apropriada para a formulação de LNP no copo cheio para hidratá-los.
      NOTA: Os de diálise requerem um mínimo de 2 minutos para hidratar antes de usar.
   3. Coloque uma barra de agitação no copo e cubra o copo com papel alumínio.
   4. Coloque o copo coberto sobre uma placa de agitação magnética. Ligue a placa de agitação e coloque-a para girar a 300-400 rpm.
2. Diluir um estoque tampão de ácido cítrico de 100 mM (pH 3) 10 vezes com água ultrapura para criar o tampão de ácido cítrico de 10 mM usado para diluição de mRNA.
3. Fazer C12-200 lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol, e lipid-anchored PEG (lipid-PEG) soluções estoque dissolvendo cada lipídio em 100% etanol. As concentrações dos componentes lipídicos estão detalhadas na Tabela 1.
   1. Aquecer e misturar as soluções-mãe a 37 °C para garantir que estão totalmente dissolvidas.

2. Preparação das misturas de lipídios e ácidos nucleicos

1. Calcular os volumes necessários de lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol e lipídio-PEG com base na razão molar desejada e na relação lipídio ionizável para peso de RNAm (Tabela 1). Preparar 10% de volume extra da fase orgânica para contabilizar o volume morto nas seringas durante a formulação.
   1. Combinar os volumes calculados dos diferentes componentes lipídicos em um tubo cônico.
   2. Diluir os lipídios com etanol 100% até um volume final, V, que representa 25% do volume final do LNP.
2. Calcular a quantidade de mRNA necessária para a formulação com base na relação entre o peso do lipídio ionizável e do RNAm e o volume total de mRNA-LNP necessário (Tabela 1).
   1. Descongele o mRNA codificador de luciferase de vagalume no gelo.
   2. Diluir o mRNA até um volume final, 3V, três vezes o volume da fase orgânica, em tampão ácido cítrico 10 mM.
      NOTA: Todo volume lipídico, V, deve conter lipídio ionizável suficiente para o mRNA diluído em 3 V. Isso corresponde à relação lipídio ionizável desejado para o peso do RNAm.

3. Formulação microfluídica de mRNA-LNPs

1. Borrife uma limpeza de tarefa delicada com um descontaminante de superfície para RNases e DNA e limpe completamente o interior do instrumento microfluídico.
   1. Abra um novo cartucho microfluídico e insira-o com os canais de entrada virados para baixo e para longe.
   2. Certifique-se de que o braço do tubo cônico contém dois tubos cônicos de 15 mL e está na posição mais à direita.
   3. Configure dois tubos cônicos estéreis de 15 mL no suporte com as tampas desligadas.
2. Encha uma seringa de 5 ml com a solução de mRNA que contém mRNA diluído em tampão de ácido cítrico 10 mM.
   1. Encha uma seringa de 3 mL com a solução lipídica que contém os lipídios diluídos em etanol 100% puro.
   2. Vire o suporte do cartucho no dispositivo microfluídico.
   3. Insira a seringa de 5 mL, sem a agulha, que contém mRNA na entrada esquerda do cartucho.
   4. Introduza a seringa de 3 ml, sem a agulha, que contém lípidos na entrada direita do cartucho.
   5. Vire o suporte do cartucho de volta para baixo e feche a tampa do instrumento microfluídico.
3. Ligue o instrumento microfluídico usando o interruptor localizado na parte traseira do instrumento.
   1. Selecione Execução Rápida.
   2. Selecione os tipos de seringas corretos para as seringas de 5 mL e 3 mL inseridas.
   3. Insira os parâmetros para a formulação de mRNA-LNP em uma relação de fluxo aquoso para orgânico de 3:1, conforme descrito na Tabela 2.
   4. Pressione o botão Avançar para ir para a próxima tela.
   5. Confirme se os parâmetros corretos foram inseridos.
   6. Pressione o botão Iniciar para formular os mRNA-LNPs.

4. Processamento pós-formulação e caracterização dos RNAm-LNPs

1. Carregar os RNAm-LNPs coletados no tubo cônico direito nos de diálise previamente hidratados.
   NOTA: Não puncione ou danifique a membrana do ao carregar os mRNA-LNPs. Se a membrana estiver danificada, os mRNA-LNPs serão perdidos após a carga.
   1. Coloque as de diálise contendo os mRNA-LNPs de volta no copo contendo 1x PBS e deixe-os dialisar por um mínimo de 2 h.
   2. Após a diálise, traga as de diálise contendo os mRNA-LNPs para um gabinete de biossegurança estéril e remova os mRNA-LNPs usando uma seringa com uma agulha.
   3. Filtrar estéril-os mRNA-LNPs usando um filtro de seringa de 0,22 μm e coletá-los em um tubo cônico estéril.
   4. Colocar 65 μL da solução de mRNA-LNP em um microtubo de 1,5 mL para fins de caracterização.
2. Diluir 10 μL de mRNA-LNPs 1:100 em 990 μL de 1x PBS em uma cubeta para a medição do tamanho hidrodinâmico e do índice de polidispersidade usando espalhamento dinâmico de luz.
3. Avaliar a concentração e a eficiência de encapsulação dos RNAm-LNPs usando um ensaio de fluorescência (i.e., RiboGreen).
   1. Preparar uma solução-mãe de tampão 1x TE diluindo o tampão 20x TE com água de biologia molecular.
   2. Preparar uma solução-mãe de tampão Triton X-100 a 1% diluindo Triton X-100 com 1x tampão TE.
   3. Prepare o reagente fluorescente diluindo o estoque de reagente 1:200 com 1x tampão TE.
   4. Diluir os mRNA-LNPs 1:100 em tampão TE 1x e tampão Triton X-100 1% em uma placa de fundo preto de 96 poços em 100 μL.
   5. Prepare uma curva padrão de baixo alcance diluindo o padrão de RNA de acordo com as instruções do fabricante e plaqueie a curva padrão na placa de 96 poços.
   6. Adicionar 100 μL de reagente fluorescente diluído a cada poço contendo mRNA-LNP diluído ou padrão diluído.
   7. Coloque a placa de 96 poços dentro de um leitor de placas e agite por 1 min, seguido de uma espera de 4 min.
   8. Medir a intensidade de fluorescência de cada poço de acordo com o protocolo do fabricante a uma excitação/emissão de 480 nm/520 nm.
4. Use a curva padrão para converter os valores de fluorescência em concentrações.
   1. Calcular a eficiência de encapsulação subtraindo o valor obtido da diluição de LNPs em tampão TE (mRNA não encapsulado) do valor obtido com a diluição de LNPs em 1% Triton X-100 (mRNA total) e dividindo pelo valor obtido com a diluição de LNPs em 1% Triton X-100, de acordo com a equação 4.4.
   2. Calcular a concentração de mRNA-LNP utilizada para estudos em células e animais, subtraindo o valor obtido da diluição de LNPs em tampão TE (mRNA não encapsulado) do valor obtido da diluição de LNPs em 1% Triton X-100 (mRNA total).
5. Medir o pK_a dos mRNA-LNPs realizando um ensaio de cloreto de 6-(p-toluidino)-2-naftalenosulfonila (TNS).
   1. Prepare o reagente TNS criando uma solução de 0,16 mM de TNS em água ultrapura.
      NOTA: Ao usar o reagente, certifique-se de mantê-lo no gelo e longe da luz para evitar a degradação.
   2. Preparar soluções tamponadas de cloreto de sódio 150 mM, fosfato de sódio 20 mM, citrato de amónio 25 mM e acetato de amónio 20 mM ajustados a diferentes valores de pH que variam de 2 a 12 em incrementos de 0,5.
   3. Adicionar 2,5 μL do LNP a cada solução tampão ajustada ao pH em uma placa de fundo preto de 96 poços de parede preta.
   4. Adicionar o reagente TNS a cada poço para que a concentração final de TNS seja de 6 μM.
   5. Incubar a placa de 96 poços em um local escuro por 5 min.
   6. Medir a fluorescência a uma excitação/emissão de 322 nm/431 nm usando um leitor de placas de fluorescência.
   7. Ajustar os dados a uma curva sigmoidal e calcular o pK a usando _a equação ajustada para encontrar o pH no qual 50% da intensidade máxima foi observada.
6. Resultados representativos para o tamanho hidrodinâmico do mRNA-LNP, PDI, eficiência de encapsulação e pK_a são mostrados na Tabela 3.

5. Transfecção in vitro de células HepG2

NOTA: Várias outras linhagens celulares, como células HeLa ou células HEK-293T, podem ser usadas para avaliar a eficiência de transfecção de LNPs in vitro. Todas as células devem apresentar teste negativo para micoplasma antes dos estudos de transfecção do LNP.

1. Placa de 5.000 células HepG2 em cada poço de uma placa de fundo claro de parede branca de 96 poços em 100 μL de meio de cultura celular completo (DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina)
   1. Deixe as células aderirem durante a noite em uma incubadora controlada de CO 2 a 37 °C e 5% de CO₂.
2. Diluir os RNAm-LNPs em meio de cultura celular completo para que a dose total seja administrada em 100 μL.
   1. Retire o meio completo dos poços.
   2. Tratar as células com RNAm-LNPs diluídos em meio de cultura celular completo nas doses desejadas ou meio completo (controle).
   3. Coloque a placa de 96 poços contendo as células tratadas de volta na incubadora controlada de CO₂ por 24 horas.
3. Avaliar a eficiência da transfecção realizando um ensaio de luciferase.
   1. Prepare o reagente luciferase e 1x tampão de lise celular de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Retire a placa de 96 poços contendo as células da incubadora e leve-a para um armário de biossegurança.
   3. Remova o meio de cultura celular de cada poço da placa de 96 poços.
   4. Adicionar 20 μL de tampão de lise 1x a cada poço, seguido de 100 μL do reagente de ensaio de luciferase previamente preparado.
   5. Proteja a placa da luz e coloque-a em um leitor de placas para medir o sinal bioluminescente de cada poço.
      NOTA: Resultados representativos demonstrando o tratamento de células HepG2 com C12-200 mRNA-LNPs previamente formulados são mostrados na Figura 1.

6. Avaliação in vivo de RNAm-LNPs em camundongos após injeção na veia caudal

1. Diluir a solução de mRNA-LNP com 1x PBS estéril de modo que 2 μg de mRNA total estejam presentes em um volume de injeção da veia caudal de 100 μL, o que corresponde a uma dose de peso corporal de aproximadamente 0,1 mg/kg para um camundongo de 20 g.
2. Restrinja cada rato usando um método aprovado e limpe a cauda com uma almofada umedecida com álcool a 70%.
   1. Encha uma seringa de insulina 29 G com 100 μL de mRNA-LNP (2 μg) ou 100 μL de 1x PBS. Retire as bolhas da seringa.
   2. Insira a agulha com o bisel voltado para cima na veia lateral da cauda do rato e injete lentamente os 100 μL de mRNA-LNP ou 1x PBS.
   3. Retire a agulha e aplique pressão até atingir a hemostasia.
3. Preparar uma solução-mãe de 15 mg/mL de sal de d-luciferina potássica em estéril 1x PBS 6 horas após a injeção.
   1. Ligue o sistema de imagem in vivo (IVIS) e abra o software de imagem.
   2. Pressione Inicializar para preparar o instrumento para aquisição de dados.
   3. Marque a caixa ao lado de luminescência e defina o tempo de exposição como automático. Certifique-se de que o campo de visão correto esteja selecionado para o número de ratos que estão sendo fotografados.
   4. Administrar 200 μL de d-luciferina por via intraperitoneal (150 mg de luciferina por kg de peso corporal) aos ratinhos previamente tratados.
   5. Colocar os camundongos em uma câmara de anestesia regulada para isoflurano a 2,5% e fluxo de oxigênio de 2,0 L/min.
   6. Aguarde 10 minutos para que o sinal de luciferase se estabilize antes de obter imagens dos camundongos tratados com mRNA-LNP.
   7. Certifique-se de que os camundongos estejam totalmente anestesiados e redirecione a linha anestésica para administrar isoflurano através de cones nasais dentro da câmara de imagem.
   8. Transfira os ratos para os cones nasais e certifique-se de que eles estejam de costas com o abdômen exposto.
   9. Feche a porta da câmara e clique no botão Adquirir no software para obter imagens de bioluminescência.
      NOTA: Resultados representativos para imagens de corpo inteiro de camundongos após o tratamento com mRNA-LNP ou 1X PBS são mostrados na Figura 2.

Resultados

Os mRNA-LNPs foram formulados usando um instrumento microfluídico que possuía um diâmetro hidrodinâmico médio de 76,16 nm e um índice de polidispersidade de 0,098. O pK_a dos RNAm-LNPs foi encontrado em 5,75 através da realização de um ensaio TNS¹⁸. A eficiência de encapsulação para esses mRNA-LNPs foi calculada em 92,3% usando o ensaio de fluorescência modificado e a equação 4.4. A concentração total de RNA utilizada para o tratamento celular e...

Discussão

Com esse fluxo de trabalho, uma variedade de mRNA-LNPs pode ser formulada e testada quanto à sua eficiência in vitro e in vivo. Lipídios ionizáveis e excipientes podem ser trocados e combinados em diferentes razões molares e diferentes razões de peso de lipídios ionizáveis para RNAm para produzir RNAm-LNPs com diferentes propriedades físico-químicas²². Aqui, formulamos C12-200 mRNA-LNPs com uma razão molar de 35/16/46,5/2,5 (lipídio ionizável:lipídio auxiliar:colest...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Hydrochloric Acid	Sigma	7647-01-0
0.22 μm Syringe Filters	Genesee	25-243
1 mL BD Slip Tip Syringe	BD	309659
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)	Avanti Polar Lipids	880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725P
1.5 mL Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
200 proof Ethanol	Decon Labs	2716
23G Needles	Fisher Scientific	14-826-6C
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips	Fisher Scientific	14-823-435
3 mL Dialysis Cassettes	Thermo Scientific	A52976
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Scientific	165306
Ammonium Acetate, 1 Kilogram	Research Products International	631-61-8
Ammonium Citrate dibasic	SIgma	3012-65-5
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL	BD	309646
C12-200 Ionizable Lipid	Cayman Chemical	36699
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664
Cholesterol	Sigma	57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7202
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14955129
D-Luciferin, Potassium Salt	Thermo Scientific	L2916
DMEM, high glucose	Thermofisher Scientific	11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mL	Fisher Scientific	1484132
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]	ATCC	HB-8065
HyPure Molecular Biology Grade Water	Cytiva	SH30538.03
Infinite 200 PRO Plate Reader	Tecan	N/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	N/A
Large Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-11D
Luciferase Assay Kit	Promega	E4550
NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack	Precision Nanosystems	NIN0065
NanoAssemblr Ignite Instrument	Precision Nanosystems	NIN0001
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0	Teknova	Q2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit	Thermo Scientific	R11490
Reporter Lysis 5x Buffer	Promega	E3971
RNase Away Surface Decontaminant	Thermofisher Scientific	7000TS1
Sodium Chloride	Sigma	7647-14-5
Sodium Hydroxide	Sigma	1310-73-2
Sodium Phosphate	Sigma	7601-54-9
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)	Sigma	T9792
Triton X-100	Sigma	9036-19-5
Zetasizer	Malvern Panalytical	NanoZS