JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول استخدام CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) في الخلايا الشحمية (AdipoSPH) كاستراتيجية بديلة للفيروس المرتبط بالغدي (AAV) للتحقيق في بيولوجيا الدهون البيج. الحقن في الجسم الحي من sgRNA الحامل ل AAV الذي يستهدف جين Prdm16 الداخلي يكفي للحث على نمو الدهون البيج وتعزيز برنامج الجينات الحرارية.

Abstract

وقد أدت تقنية التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (كريسبر) إلى ثورة في علم الأحياء، وتم تطبيق الأدوات الحديثة إلى ما هو أبعد من التحرير الجيني الموصوف أصلا. يجمع نظام تنشيط كريسبر (CRISPRa) بين بروتين Cas9 (dCas9) غير النشط تحفيزيا مع وحدات نسخ مميزة للحث على التعبير الجيني الداخلي. SunTag-p65-HSF1 (SPH) هي تقنية CRISPRa تم تطويرها مؤخرا تجمع بين مكونات وسطاء التنشيط التآزري (SAMs) مع منشطات SunTag. يسمح هذا النظام بالإفراط في التعبير عن الجينات المفردة أو المتعددة من خلال تصميم RNA أحادي التوجيه مخصص (sgRNA). في هذه الدراسة ، تم استخدام فأر SPH تم تطويره مسبقا لتوليد فأر شرطي يعبر عن SPH في الخلايا الشحمية (سلالة adiponectin Cre) ، المسماة AdipoSPH. للحث على النمط الظاهري للدهون البيضاء إلى البيج (البني) ، تم حقن فيروس مرتبط بالغدي (AAV) يحمل sgRNA يستهدف جين Prdm16 الداخلي (عامل نسخ راسخ يتعلق بتطور الدهون البنية والبيج) في الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT). حفز نموذج الفأر هذا التعبير عن Prdm16 الداخلي المنشأ ونشط برنامج الجينات الحرارية. علاوة على ذلك ، أدى التعبير المفرط ل Prdm16 الناجم عن SPH في المختبر إلى تعزيز استهلاك الأكسجين للخلايا الشحمية البيج ، مما أدى إلى نسخ نتائج نموذج الفئران المعدلة وراثيا Prdm16 السابق. وبالتالي ، يصف هذا البروتوكول نموذج ماوس متعدد الاستخدامات وفعال من حيث التكلفة وفعال من حيث الوقت للتحقيق في بيولوجيا الأنسجة الدهنية.

Introduction

الخلايا الشحمية البيج (أو البريتي) هي خلايا دهنية تفصل عن البروتين 1 (UCP1) والخلايا الشحمية الغنية بالميتوكوندريا الموجودة داخل مستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT). تظهر الدهون البيج من مجموعة فرعية من أسلاف الخلايا الشحمية أو الخلايا الشحمية البيضاء الناضجة استجابة للتعرض للبرد والمحفزات الأخرى 1,2. يمكن للخلايا الشحمية البيج تحويل الطاقة إلى حرارة بطريقة تعتمد على UCP1 أو مستقلة3. بغض النظر عن وظيفتها الحرارية ، يمكن للدهون البيج أيضا تحسين صحة التمثيل الغذائي بوسائل أخرى ، مثل إفراز الأديبوكينات والأنشطة المضادة للالتهابات والمضادة للتليف. أظهرت الدراسات التي أجريت على الفئران والبشر أن تحريض الدهون البيج يحسن توازن الجلوكوز والدهون في الجسمبالكامل 3. ومع ذلك ، على الرغم من أن معرفتنا ببيولوجيا الدهون البيج قد تطورت بسرعة في السنوات الأخيرة ، إلا أن معظم فوائدها الأيضية والآليات ذات الصلة لا تزال غير مفهومة تماما.

تم وصف التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) لأول مرة في الخلايا حقيقية النواة كأداة قادرة على توليد فاصل مزدوج الخيوط (DSB) في موقع معين في الجينوم من خلال نشاط النيوكلياز لبروتين Cas9 4,5. يتم توجيه Cas9 بواسطة الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه الاصطناعي (sgRNA) لاستهداف منطقة جينومية معينة ، مما يؤدي إلى DSB الحمض النووي. بالإضافة إلى استخدام النيوكلياز Cas9 لأغراض التحرير ، تطورت تقنية CRISPR-Cas9 لاستخدامها كأداة لتنظيم الجينات الخاصة بالتسلسل6. أدى تطوير بروتين Cas9 غير نشط تحفيزيا (dCas9) وربط وحدات النسخ القادرة على تعزيز التعبير الجيني إلى ظهور أدوات تنشيط كريسبر (CRISPRa). ظهرت العديد من أنظمة CRISPRa ، مثل VP647,8 ، وسيط التنشيط التآزري (SAM) 9 ، SunTag10,11 ، VPR12,13 ، و SunTag-p65-HSF1 (SPH) 14 ، والتي تجمع بين مكونات منشطات SAM و SunTag. لقد ثبت مؤخرا أن التعبير المستحث للجينات العصبية في الخلايا العصبية N2a والخلايا النجمية الأولية أعلى باستخدام SPH مقارنة بأنظمة CRISPRa الأخرى14 ، مما يدل على SPH كأداة CRISPRa واعدة.

هنا ، استفدنا من ماوس SPH14 الذي تم تطويره مسبقا لإنشاء نموذج فأر شرطي يعبر عن SPH على وجه التحديد في الخلايا الشحمية باستخدام سلالة adiponectin Cre (AdipoSPH). باستخدام فيروس مرتبط بالغدي (AAV) يحمل gRNA يستهدف جين Prdm16 الداخلي ، تم تحفيز اللون البني (التحويل الأبيض إلى البيج) من WAT الإربي (iWAT) لزيادة التعبير عن برنامج الجينات الحرارية. علاوة على ذلك ، في المختبر Prdm16 التعبير المفرط عزز استهلاك الأكسجين. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول نموذج ماوس SPH متعدد الاستخدامات لاستكشاف آليات تطور الدهون البيج داخل الأنسجة الدهنية.

Protocol

تم إجراء الدراسات على الحيوانات وفقا لدليل جامعة كامبيناس لرعاية واستخدام المختبر (بروتوكول CEUA # 5810-1 / 2021).

1. الاستنساخ الجزيئي

  1. تصميم الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNAs)
    1. صمم sgRNAs لتنشيط كريسبر باستخدام CHOP ، المتوفرة في https://chopchop.cbu.uib.no/ ، أو أي أداة أخرى مناسبة. استخدم المعلمات التالية لتصميم sgRNA الذي يستهدف جين Prdm16: الهدف: Prdm16; في: العضلات العضلية. باستخدام: كريسبر / كاس 9 ؛ من أجل: التنشيط.
      ملاحظة: صمم sgRNAs لكل منطقة ذات أهمية موزعة على منطقة موقع بدء النسخ المنبع (TSS) 200 نقطة أساس. على سبيل المثال ، فإن sgRNA الذي يستهدف Prdm16 المستخدم في هذه الدراسة يربط 154 نقطة أساس في المنبع من TSS.
    2. أضف الأجزاء المتدلية إلى sgRNA لمطابقة موقع تقييد SacI في العمود الفقري المتجه pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (انظر جدول المواد). تشمل: 5'- (N20) AGCT-3' (N = النيوكليوتيدات). على سبيل المثال ، التسلسل الذي يستهدف جين Prdm16 هو 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3 '، ومع النتوءات هو 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
    3. احصل على تسلسل المكمل العكسي sgRNA 3 'باستخدام الأداة المتاحة في https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. على سبيل المثال ، تسلسل sgRNA 3 'الذي يستهدف جين Prdm16 هو 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
  2. تلدين قليل النيوكليوتيدات التكميلية التي تقطعت بها السبل
    1. أضف 1 ميكرولتر من كل قليل النوكليوتيد أحادي الجديلة 5 'و 3' (تركيز المخزون: 100 ميكرومتر) ، 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت T4 ligase ، 0.5 ميكرولتر من T4 polynucleotide kinase (PNK) (1 × 104 وحدات / مل) ، و 6.5 ميكرولتر من H2O إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر. قم بتلدين قليل النيوكليوتيدات التكميلية أحادية الشريط باستخدام جهاز تدوير حراري في ظل الظروف التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، يليها معدل انحدار يبلغ 5 درجات مئوية / دقيقة.
      ملاحظة: يتم تزويد إنزيم PNK بمخزن PNK المؤقت ولا يحتوي على ما يكفي من ATP المطلوب لتفاعل الفسفرة (انظر جدول المواد). لتبسيط التفاعل ، استخدم المخزن المؤقت T4 ligase (بدلا من المخزن المؤقت PNK). يوفر المخزن المؤقت T4 ligase الكمية المناسبة (1 mM ATP) من الفوسفات لتفاعل الفسفرة. يوفر إنزيم PNK فسفرة نهاية 5 بوصات من قليل النيوكليوتيدات لتفاعل الربط اللاحق.
  3. ربط قليل النيوكليوتيدات sgRNA الملدن
    1. أضف 25 نانوغرام من البلازميد pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry إلى 2 ميكرولتر من قليل النيوكليوتيدات sgRNA الملدن ، 1 ميكرولتر من إنزيم SacI ، 2 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase buffer ، 1 μL من T4 DNA ligase (1-3 u / μL) (انظر جدول المواد) ، و H2O إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر.
    2. قم بإجراء الربط عن طريق احتضان خليط التفاعل باستخدام جهاز تدوير حراري في ظل الظروف التالية: 15 دورة من 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، تليها الاحتفاظ عند 4 درجات مئوية.
  4. التحول متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة (PCR)
    1. تحويل خلايا الإشريكية القولونية DH10B المختصة (انظر جدول المواد) مع 4 ميكرولتر من منتج الربط باستخدام صدمة حرارية (42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية) ونشرها على صفيحة أجار تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
    2. قم بتأكيد المستعمرات المحولة بواسطة مستعمرة PCR باستخدام مزيج PCR الرئيسي (انظر جدول المواد). اختر المستعمرة واخلطها مع 5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ، و 0.1 ميكرولتر من التمهيدي العالمي (تركيز المخزون: 100 ميكرومتر) ، و 0.1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي sgRNA (تركيز المخزون: 100 ميكرومتر) (الجدول 1) ، و 5 ميكرولتر من H2O. قم بتشغيل PCR باستخدام جهاز تدوير حراري في ظل الظروف التالية: تمسخ أولي (94 درجة مئوية لمدة دقيقتين) ، تليها 35 دورة من التمسخ (94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية) ، والتلدين (60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، والتمديد (72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، وخطوة استطالة نهائية (72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق). حل الحمض النووي باستخدام الأغاروز (1.5٪) هلام الكهربائي في 0.5x TAE العازلة عند 90 فولت لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: تعطي الحيوانات المستنسخة الإيجابية نطاقا من ~ 280 نقطة أساس.
    3. إرسال عينات إيجابية لتسلسل سانجر باستخدام التمهيدي العالمي (الجدول 1 ، الملف التكميلي 1).
  5. تنقية البلازميد
    1. قم بتنقية البلازميد من استنساخ إيجابي باستخدام مجموعة تنقية البلازميد (انظر جدول المواد) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: تنقية البلازميد باستخدام راتنج تبادل الأنيون أو مجموعة أخرى مناسبة للاستخدام في نقل الخلايا.
    2. احتضان المستنسخ الإيجابي (12 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 200 دورة في الدقيقة) باستخدام وسط نمو بكتيري قياسي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
    3. الطرد المركزي للخلايا البكتيرية عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اتبع الخطوات التالية وفقا لتعليمات مجموعة أدوات الشركة المصنعة.

2. تغليف AAV

ملاحظة: تم تنفيذ تغليف AAV وفقا للمنشورات السابقة15,16 مع تعديلات طفيفة.

  1. لوحة 293T الخلايا (انظر جدول المواد) في قارورة 175 سم2 (بذر 5 × 106 خلايا لكل قارورة) باستخدام 25 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S). احتضان في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 ، و 95 ٪ الرطوبة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 50 ٪ -70 ٪.
  2. امزج 14 ميكرولتر من البولي إيثيلين إنيمين (1 ميكروغرام / ميكرولتر) مع 1 مل من 150 مللي متر كلوريد الصوديوم. امزج البلازميدات الثلاثة المطلوبة لإنتاج AAV بنسبة مولية 1: 1: 1 (أي 17.7 ميكروغرام من pAdDeltaF6 ، 7.9 ميكروغرام من AAV2 / 8 (انظر جدول المواد) ، و 5.9 ميكروغرام من sgRNA المستنسخ من الخطوة 1 في 1 مل من 150 mM NaCl. نقل بولي إيثيلينيمين: خليط كلوريد الصوديوم قطرة قطرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي (خليط من البلازميدات) واحتضانه لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: pAdDeltaF6 هو بلازميد مساعد و pCapsid pAAV2 / 8 عبارة عن بلازميد تغليف يعبر عن جينات النسخ المتماثل (Rep) و Capsid (cap). كل من البلازميدات ضرورية لإنتاج AAV.
  3. قبل النقل، استبدل وسط نمو الخلايا ب 18 مل من DMEM تحتوي على 1٪ FBS و L-alanyl-L-glutamine (0.5 جم / لتر). أضف 2 مل من بولي إيثيلينيمين: خليط الحمض النووي إلى كل دورق مزرعة واحتضان الخلايا في حاضنة CO 2 (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة).
  4. بعد 5 ساعات، أضف 5 مل من DMEM المكمل ب 10٪ FBS و L-alanyl-L-glutamine (0.5 جم / لتر).
  5. بعد 3 أيام من الحضانة ، افصل الخلايا عن قارورة الثقافة باستخدام مكشطة خلوية. اجمع الخلايا التائية 293 من 10 (175 سم2) قوارير زراعة الخلايا في أنابيب مخروطية سعة 50 مل وأضف DMEM (انظر جدول المواد) حتى 30 مل.
  6. أضف 3 مل من الكلوروفورم إلى كل أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على خلايا 293T واخلطه باستخدام خلاط دوامة بسرعة عالية لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا بإضافة 7.6 مل من 5 M NaCl والدوامة لفترة وجيزة. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. انقل الطور المائي إلى أنبوب مخروطي جديد وأضف 9.4 مل من 50٪ (v / v) من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) 8000. تخلط مع خلاط دوامة بسرعة عالية لمدة 10 ثوان ووضع العينات على الجليد لمدة 1 ساعة.
  8. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية واترك الحبيبات تجف لمدة 10 دقائق.
  9. أضف 1.4 مل من HEPES (50 مللي مول ، درجة الحموضة 8) واخلطها لمدة 5 دقائق باستخدام خلاط دوامة بسرعة عالية. أضف 3.5 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، و 14 ميكرولتر من DNase I (20 وحدة / ميكرولتر) ، و 1.4 ميكرولتر من RNase A (10 ميكروغرام / ميكرولتر). احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم نقل العينات إلى أنابيب جديدة 1.5 مل (700 ميكرولتر في كل أنبوب).
  10. أضف 700 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل أنبوب سعة 1.5 مل واخلطه باستخدام خلاط دوامة بسرعة عالية لمدة 10 ثوان. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. كرر هذه الخطوة 3x.
  11. تبخر الكلوروفورم لمدة 30 دقيقة في خزانة السلامة الحيوية. بعد ذلك ، انقل 300 ميكرولتر من الطور المائي إلى أنبوب طرد مركزي فائق 0.5 مل (انظر جدول المواد). أدر الفلتر على حرارة 14000 × جم على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة التدفق من خلال تدوير المرشح مرة أخرى حتى يمر مستوى الصوت بالكامل عبر الفلتر.
  12. اغسل الفلتر بإضافة 300 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) واخلط المحاليل عن طريق الماصة. جهاز طرد مركزي الفلتر لمدة 5 دقائق عند 14000 × جم عند 25 درجة مئوية. كرر خطوة الغسيل هذه 4x.
  13. جهاز طرد مركزي المرشح لمدة 8 دقائق عند 14000 × جم عند 25 درجة مئوية. ضع المرشح رأسا على عقب في أنبوب جديد ، وقم بتدويره لمدة دقيقتين عند 1000 × جم عند 25 درجة مئوية.

3. معايرة AAV بواسطة qPCR

  1. قم بإعداد منحنى قياسي لمعايرة AAV وحدد عيار AAV وفقا للدراسة الأصلية التي أجراها Fripont et al.15.

4. الحقن في الجسم الحي من AAV في الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT)

  1. افصل بين الأدوات والمستلزمات الجراحية اللازمة للجراحة وقم بتعقيمها على النحو الموصى به لكل مادة محددة.
  2. تخدير الفأر ب 100 مغ/كغ من الكيتامين و10 ملغ/كغ من الزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق. تأكيد التخدير عن طريق الضغط القوي على المخلب والذيل والتحقق من وجود رد فعل. ضع مرهما على عيون الفأر لتجنب جفاف العين أثناء الجراحة.
  3. ضع الفأر المخدر في وضع الاستلقاء واحلق مساحة صغيرة على الأجنحة ، بالقرب من مفاصل الورك لحقن iWAT ، باستخدام ماكينة حلاقة. ضع كريم مزيل الشعر لمدة 5 دقائق. إزالة كريم المتبقية بالماء لتجنب حرق الجلد.
  4. تطهير الجلد باستخدام ثلاث جولات بالتناوب من تطبيق محلول مطهر (بوفيدون اليود) على الجلد بشاش نظيف وكحول 70٪. تخلص من الشاش بعد كل استخدام.
  5. أداء التطبيق النهائي لمحلول مطهر على الجلد. بعد ذلك ، قم بعمل شق 1-2 سم بمقص معقم في المنطقة القريبة من المفاصل ، وأمسك الجلد مفتوحا باستخدام ملقط لفضح مستودع الدهون. يمكن العثور على WAT متصلا بالجلد على كلا الجانبين ، ويمتد من البداية على الظهر ولأسفل باتجاه الخصية.
    ملاحظة: استخدم الستائر لتجنب التلوث أثناء الجراحة أو إجراءات الخياطة.
  6. باستخدام الملقط ، من خلال الشق ، اسحب مستودع الدهون برفق لأعلى للتأكد من أن الحقن في الموقع والعمق الصحيحين.
    ملاحظة: احرص على عدم إزالة الأنسجة من موقعها الأصلي.
  7. املأ حقنة الميكرولتر (المقياس: 33 ؛ نمط النقطة: 4 ؛ الزاوية: 12 ؛ الطول: 10) (انظر جدول المواد) ب 2.5 ميكرولتر (5.6 × 1010 جينومات فيروسية [VG] / μL) من AAV (تحتوي على sgRNA الذي يستهدف جين Prdm16 الداخلي). أدخل الإبرة بعناية بزاوية 30 درجة -45 درجة في iWAT. كرر الحقن 5x في مواقع مختلفة من الأنسجة لإصابة وسادة الدهون iWAT بأكملها بشكل متجانس. يوصى بحجم إجمالي قدره 15 ميكرولتر لإصابة iWAT.
    ملاحظة: يعتمد عمق إدخال المحقنة على سمك رواسب وسادة الدهون. استخدم تقنية عدم اللمس لسحب الحقن.
  8. أغلق شق الجلد المحلوق باستخدام خيوط 4/0 خيوط أحادية الشعيرات. ضع الماوس على وسادة حرارية حتى يتم استعادة الوعي. راقب الحيوان كل 10-15 دقيقة حتى يتعافى تماما. بعد أن يستعيد الحيوان وعيه ، لاحظ التنميط الحركي ، والذي يجب أن يكون خطيا وليس له أي علامات على الضيق أو الألم.
  9. يجب إجراء السيطرة على الألم بعد العملية الجراحية في غضون 48 ساعة بعد الجراحة عن طريق تطبيق ترامادول هيدروكلوريد (5 ملغ/كغ) داخل الصفاق لمدة 3 أيام (2x/يوم).
    ملاحظة: راقب علامات الضيق وعدم الراحة وراقب تناول الماء والطعام. إعطاء جرعة فعالة من المسكن بطريقة وقائية ، ويفضل قبل أو في بداية الجراحة.
  10. احتفظ بالماوس في قفص مع حرية الوصول إلى الطعام والماء خلال فترة الشفاء. بعد فترة الشفاء ، انتقل إلى القتل الرحيم للماوس. في هذه الدراسة ، تم إجراء القتل الرحيم بجرعة زائدة من التخدير عن طريق الحقن (داخل الصفاق) من 3 أضعاف الجرعة المحفزة (300-360 مجم / كجم هيدروكلوريد الكيتامين + 30-40 مجم / كجم زيلازين هيدروكلوريد) متبوعة بقطع الرأس.
    ملاحظة: يوصى بشدة بإبقاء الحيوانات في أقفاص فردية حتى تتعافى تماما من التخدير.

5. في المختبر تمايز الخلايا الوعائية اللحمية (SVFs) إلى الخلايا الشحمية البيج

  1. إجراء عزل وطلاء SVFs الأولية من iWAT لفئران AdipoSPH وفقا ل Aune et al.17. بذور SVFs المشتقة من فئران AdipoSPH iWAT في صفيحة ذات 6 آبار تحتوي على وسط كامل (DMEM يحتوي على 3.1 جم / لتر جلوكوز ، 0.5 جم / لتر L-alanyl-L-glutamine ، 10٪ FBS ، و 2.5٪ P / S) لمدة 1-2 ساعة.
    ملاحظة: يحتوي جزء SVF على خليط من أنواع الخلايا المختلفة. في هذه الخطوة ، لا يمكن تحديد عدد الخلايا السلفية المصنفة التي تؤدي إلى ظهور الخلايا الشحمية.
  2. نضح الوسط ، واغسل البئر 2x باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) ، واستبدله بوسط كامل طازج. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -80٪.
  3. تحفيز التمايز (اليوم 0) عن طريق معالجة الخلايا بوسط الحث (الجدول 2).
    ملاحظة: كوكتيل الدواء من وسط الحث ضروري لتعزيز تمايز الخلايا الشحمية البيج وللتعبير عن برنامج الجينات الحرارية17.
  4. بعد يومين (اليوم الثاني) ، استبدل وسيط الحث بوسط الصيانة (الجدول 2).
  5. بعد يومين (اليوم 4) ، استبدل وسيط الصيانة بوسيط صيانة جديد (الجدول 2) لمدة يومين إلى 3 أيام.
  6. قم بتغيير وسط الصيانة كل 48 ساعة حتى يتم تمييز الخلايا السابقة تماما إلى خلايا دهنية (عادة بعد 6 أيام من إضافة وسط الحث). يمكن ملاحظة الخلايا الشحمية الناضجة باستخدام الفحص المجهري الضوئي ، حيث يبدو أن الخلايا المتمايزة محملة بقطرات الدهون.

6. في المختبر عدوى AAV من SVFs

ملاحظة: أصيبت SVFs المشتقة من فئران AdipoSPH iWAT ب sgRNA-Prdm16 الحامل ل AAV كما وصفه سابقا Wang et al.18 مع بعض التعديلات.

  1. قم بزراعة الخلايا على صفيحة استزراع مكونة من 6 آبار بوسط كامل حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -80٪ ، كما هو موضح سابقا في الخطوات 5.1-5.3.
  2. امزج 5.6 × 1010 VG / μL من sgRNA-Prdm16 الحامل ل AAV مع 2 مل من بروميد الوسيط الكامل وسداساديثرين (8 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد). قم بتحويل الخلايا عن طريق استبدال الوسط الكامل وإضافة الوسط الكامل الذي يحتوي على AAV. احتضان الخلايا المحولة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية ، رطوبة 95٪ ، و 5٪ CO2.
  3. قم بتقسيم الخلايا وزرعها كما هو موضح في الخطوة 5 لتكاثر الخلايا والتمايز إلى خلايا دهنية بيج.
    ملاحظة: بالنسبة لفحص استهلاك الأكسجين ، البذور 4.0 × 104 خلايا (من الخطوة 6.2) لكل بئر مع وسط الحث في لوحة زراعة الخلايا 24 بئرا. يتم تنفيذ الخطوات اللاحقة لتكاثر الخلايا والتمايز كما هو موضح في الخطوة 5. يتم إجراء فحص استهلاك الأكسجين عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -100٪ وتكون متمايزة تماما ، كما ورد سابقا19.

النتائج

تم تطوير فئران AdipoSPH عن طريق تربية سلالات الفئران SPH و Adipoq-Cre. كانت كلتا سلالتي الماوس في خلفية C57BL6J-DBA / 2J هجينة (وفقا للمورد التجاري ؛ انظر جدول المواد). تم وصف سلالة فأر SPH في الأصل بواسطة Zhou et al.14.

في الجسم الحي تطور الخلايا الشحمية البيج...

Discussion

أحد أكثر التطبيقات غير التحريرية المفيدة لتقنية كريسبر هو استجواب وظيفة الجينات من خلال تنشيط الجينات الداخلية باستخدام أنظمة كريسبر6. SPH هو كريسبرا قوي تم وصفه في الأصل للحث على تحويل الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية نشطة من خلال استهداف العديد من الجينات العصبية14

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون الدعم الذي تلقوه من مركز متعدد التخصصات للبحوث البيولوجية في العلوم الطبية (Cemib) ، Unicamp ، لتوليد الفئران AdipoSPH ، ومختبر Inmmunometabolism وإشارات الخلية ، والمعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا على الضوئيات المطبقة على بيولوجيا الخلية (INFABIC) على كل الدعم التجريبي. نشكر الدعم المالي من مؤسسة أبحاث ساو باولو (FAPESP): 2019/15025-5 ؛ 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3',5-Triiodo-L-thyronineSigma-AldrichT2877
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI5879
AAVpro 293T Cell LineTakarabio632273
Amicon Ultra Centrifugal FilterMerckmilliporeUFC510008100 KDa
DexamethasoneSigma-AldrichD1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplementGibco10565-018high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Sigma-AldrichD8662
Excelta Self-Opening Micro ScissorsFisher Scientific17-467-496
Fetal bovine serumSigma-AldrichF2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)Fisher Scientific08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/ForcepsFisher Scientific12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting ScissorsFisher Scientific08-940
GlycerolSigma-AldrichG5516
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene)Sigma-AldrichH9268
IndomethacinSigma-AldrichI7378
InsulinSigma-AldrichI9278
LigaFast Rapid DNA Ligation SystemPromegaM8225
Maxiprep purification kit Qiagen12162
Microliter syringeHamilton80308Model 701
NEB 10-beta/Stable New England BiolabsC3019HE. coli competent cells
pAAV2/8 Addgene 112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherryAddgene 91947
pAdDeltaF6 Addgene 112867
PEG 8000Sigma-Aldrich89510
Penicillin/streptomycinGibco15140-122
PolyethylenimineSigma-Aldrich23966Linear, MW 25000
Povidone-iodineRioquímica510101303Antiseptic
RosiglitazoneSigma-AldrichR2408
SacI enzymeNew England BiolabsR0156
Surgical Design Premier Adson ForcepsFisher Scientific22-079-741
SyringeHamilton475-40417
T4 DNA LigasePromegaM180B
T4 DNA ligase buffer New England BiolabsB0202S
T4 PNK enzyme kitNew England BiolabsM0201S
Tramadol HydrochlorideSEM43930
Vidisic Gel Bausch + Lomb 99620

References

  1. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  9. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  10. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  13. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  14. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  15. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
  16. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
  17. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  18. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  19. Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
  20. Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
  21. Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
  22. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
  23. Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
  24. Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
  25. Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
  26. Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  27. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  28. Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
  29. Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 191

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved