CRISPR SunTag-p65-HSF1 Aktivasyon Sistemi Kullanılarak Bej Yağ Biyolojisi ve Metabolizmasının İncelenmesi

Özet

Bu protokol, bej yağ biyolojisini araştırmak için adeno ilişkili virüse (AAV) alternatif bir strateji olarak adipositlerde (AdipoSPH) CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) kullanımını sunmaktadır. Endojen Prdm16 genini hedef alan AAV taşıyan sgRNA'nın in vivo enjeksiyonu, bej yağ gelişimini indüklemek ve termojenik gen programını geliştirmek için yeterlidir.

Özet

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) teknolojisi biyolojide bir devrim yarattı ve yeni araçlar orijinal olarak tarif edilen gen düzenlemesinin çok ötesinde uygulandı. CRISPR aktivasyonu (CRISPRa) sistemi, endojen gen ekspresyonunu indüklemek için katalitik olarak inaktif Cas9 (dCas9) proteinini farklı transkripsiyon modülleri ile birleştirir. SunTag-p65-HSF1 (SPH), sinerjik aktivasyon mediatörlerinin (SAM) bileşenlerini SunTag aktivatörleri ile birleştiren yakın zamanda geliştirilmiş bir CRISPRa teknolojisidir. Bu sistem, özelleştirilmiş bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) tasarlayarak tek veya çoklu genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir. Bu çalışmada, AdipoSPH adı verilen adipositlerde (adiponektin Cre soyundan) SPH eksprese eden koşullu bir fare oluşturmak için daha önce geliştirilmiş bir SPH faresi kullanılmıştır. Beyaz-bej yağ (kahverengileşme) fenotipini indüklemek için, endojen Prdm16 genini (kahverengi ve bej yağ gelişimi ile ilgili iyi kurulmuş bir transkripsiyon faktörü) hedef alan sgRNA taşıyan adeno ilişkili bir virüs (AAV), inguinal beyaz yağ dokusuna (iWAT) enjekte edildi. Bu fare modeli, endojen Prdm16 ekspresyonunu indükledi ve termojenik gen programını aktive etti. Ayrıca, in vitro SPH kaynaklı Prdm16 aşırı ekspresyonu, bej adipositlerin oksijen tüketimini arttırdı ve önceki bir Prdm16 transgenik fare modelinin sonuçlarını fenotopkopyaladı. Bu nedenle, bu protokol yağ dokusu biyolojisini araştırmak için çok yönlü, uygun maliyetli ve zaman etkili bir fare modelini tanımlar.

Giriş

Bej (veya brite) adipositler, beyaz yağ dokusu (WAT) depolarında bulunan protein 1 (UCP1) eksprese edici ve mitokondriyal bakımından zengin adipositleri ayırır. Bej yağ, soğuğa maruz kalma ve diğer uyaranlara yanıt olarak adiposit progenitörlerinin veya olgun beyaz adipositlerin bir alt kümesinden ortaya çıkar ^1,2. Bej adipositler, enerjiyi UCP1'e bağımlı veya bağımsız bir şekilde ısıya dönüştürebilir³. Termojenik işlevinden bağımsız olarak, bej yağ, adipokinlerin salgılanması ve anti-enflamatuar ve anti-fibrotik aktiviteler gibi diğer yollarla metabolik sağlığı da iyileştirebilir. Farelerde ve insanlarda yapılan çalışmalar, bej yağın indüksiyonunun tüm vücut glikozunu ve lipit homeostazını iyileştirdiğini göstermiştir³. Bununla birlikte, bej yağ biyolojisi hakkındaki bilgimiz son yıllarda hızla gelişmesine rağmen, metabolik faydalarının çoğu ve ilgili mekanizmaları hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ilk olarak ökaryotik hücrelerde, Cas9 proteini ^4,5'in nükleaz aktivitesi yoluyla genomdaki belirli bir bölgede çift iplikçik kırılması (DSB) üretebilen bir araç olarak tanımlanmıştır. Cas9, belirli bir genomik bölgeyi hedeflemek için sentetik bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) tarafından yönlendirilir ve bir DNA DSB'ye yol açar. Nükleaz Cas9'u düzenleme amacıyla kullanmanın yanı sıra, CRISPR-Cas9 teknolojisi, diziye özgü bir gen düzenleme aracı⁶ olarak kullanılmak üzere gelişmiştir. Katalitik olarak inaktif bir Cas9 proteininin (dCas9) geliştirilmesi ve gen ekspresyonunu artırabilen transkripsiyonel modüllerin ilişkisi, CRISPR aktivasyonu (CRISPRa) araçlarına yol açmıştır. SAM ve SunTag aktivatörlerinin bileşenlerini birleştiren VP64^7,8, sinerjik aktivasyon aracısı (SAM)⁹, SunTag^10,11, VPR^12,13 ve SunTag-p65-HSF1 (SPH)¹⁴ gibi çeşitli CRISPRa sistemleri ortaya çıkmıştır. Son zamanlarda, N2a nöroblastlarında ve primer astrositlerde nörojenik genlerin indüklenmiş ekspresyonunun, diğer CRISPRa sistemlerine kıyasla SPH kullanılarak daha yüksek olduğu gösterilmiştir¹⁴, SPH'yi umut verici bir CRISPRa aracı olarak göstermektedir.

Burada, adiponektin Cre soyunu (AdipoSPH) kullanarak SPH'yi özellikle adipositlerde ifade eden koşullu bir fare modeli oluşturmak için daha önce geliştirilmiş bir SPH fare^14'ten yararlandık. Endojen Prdm16 genini hedef alan gRNA'yı taşıyan adeno ilişkili bir virüs (AAV) kullanılarak, termojenik gen programının ekspresyonunu arttırmak için inguinal WAT'ın (iWAT) kahverengileşmesi (beyazdan bej dönüşümüne) indüklendi. Ayrıca, in vitro Prdm16 aşırı ekspresyonu oksijen tüketimini arttırdı. Bu nedenle, bu protokol yağ dokusunda bej yağ gelişimi mekanizmalarını keşfetmek için çok yönlü bir SPH fare modeli sağlar.

Protokol

Hayvan çalışmaları, Campinas Üniversitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (protokol CEUA #5810-1/2021) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Moleküler klonlama

1. Tek kılavuzlu RNA'ların (sgRNA'lar) tasarımı
   1. https://chopchop.cbu.uib.no/'de mevcut olan CHOPCHOP'u veya başka bir uygun aracı kullanarak CRISPR aktivasyonu için sgRNA'lar tasarlayın. Prdm16 genini hedefleyen sgRNA'yı tasarlamak için aşağıdaki parametreleri kullanın: Hedef: Prdm16; İçinde: Muş musculus; Kullanım: Crispr/Cas9; İçin: Etkinleştirme.
      NOT: 200 bp yukarı akış transkripsiyon başlangıç bölgesi (TSS) bölgesine yayılmış her bir ilgi alanı için sgRNA'lar tasarlayın. Örneğin, bu çalışmada kullanılan Prdm16'yı hedefleyen sgRNA, TSS'nin 154 bp yukarı akışını bağlar.
   2. vektör omurgası pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry'deki SacI kısıtlama bölgesini eşleştirmek için sgRNA'ya çıkıntılar ekleyin (bkz. İçindekiler: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nükleotidler). Örneğin, Prdm16 genini hedefleyen dizi 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3' ve çıkıntılarla 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'tür.
   3. https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html'de bulunan aracı kullanarak 3' sgRNA ters kompleman dizisini elde edin. Örneğin, Prdm16 genini hedefleyen 3' sgRNA dizisi 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'tir.
2. Tek sarmallı tamamlayıcı oligonükleotidlerin tavlanması
   1. Her 5' ve 3' tek sarmallı oligonükleotidden 1 μL (stok konsantrasyonu: 100 μM), 1 μL T4 ligaz tamponu, 0.5 μL T4 polinükleotid kinaz (PNK) (1 × 10⁴ ünite / mL) ve 6.5 μL_H2O 10 μL'lik bir son reaksiyon hacmine ekleyin. Aşağıdaki koşullar altında bir termosiklet kullanarak tamamlayıcı tek sarmallı oligonükleotidleri tavlayın: 30 dakika boyunca 37 °C ve 5 dakika boyunca 95 °C, ardından 5 °C / dak rampa düşürme hızı.
      NOT: PNK enzimi PNK tamponu ile birlikte verilir ve fosforilasyon reaksiyonu için gereken yeterli ATP içermez (bkz. Reaksiyonu basitleştirmek için, T4 ligaz tamponunu kullanın (PNK tamponu yerine). T4 ligaz tamponu, fosforilasyon reaksiyonu için uygun miktarda (1 mM ATP) fosfat sağlar. PNK enzimi, sonraki ligasyon reaksiyonu için oligonükleotidlerin 5' uç fosforilasyonunu sağlar.
3. Tavlanmış sgRNA oligonükleotidlerin ligasyonu
   1. 2 μL tavlanmış sgRNA oligonükleotidlerine, 1 μL SacI enzimine, 2 μL 10x T4 DNA ligaz tamponuna, 1 μL T4 DNA ligaz tamponuna, 1 μL T4 DNA ligazına (1-3 u / μL) 25 ng plazmid pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry ekleyin (bkz.
   2. Aşağıdaki koşullar altında bir termosiklet kullanarak reaksiyon karışımını inkübe ederek ligasyon gerçekleştirin: 5 dakika boyunca 37 ° C'lik 15 döngü ve 5 dakika boyunca 25 ° C'lik döngü, ardından 4 ° C'de tutma.
4. Transformasyon ve ardından koloni polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
   1. Yetkili E. coli DH10B hücrelerini (bakınız Malzeme Tablosu) 4 μL ligasyon ürünü ile ısı şoku kullanarak (45 s için 42 °C) dönüştürün ve 100 μg / mL ampisilin içeren bir agar plakasına yayın.
   2. PCR ana karışımını kullanarak koloni PCR ile dönüştürülmüş kolonileri onaylayın (bkz. Koloni seçin ve 5 μL ana karışım, 0,1 μL üniversal astar (stok konsantrasyonu: 100 μM), 0,1 μL sgRNA ters astar (stok konsantrasyonu: 100 μM) (Tablo 1) ve 5 μL_H2O ile karıştırın. PCR'yi aşağıdaki koşullar altında bir termosiklet kullanarak çalıştırın: ilk denatürasyon (2 dakika boyunca 94 °C), bunu 35 döngü denatürasyon (20 s için 94 °C), tavlama (30 s için 60 °C), uzatma (30 s için 72 °C) ve son uzama adımı (5 dakika için 72 °C) izler. DNA'yı agaroz (% 1.5) jel elektroforezi kullanarak 90 V'ta 0.5x TAE tamponunda 30 dakika boyunca çözün.
      NOT: Pozitif klonlar ~ 280 bp'lik bir bant verir.
   3. Evrensel astar kullanarak Sanger dizilemesi için pozitif örnekler gönderin (Tablo 1, Ek Dosya 1).
5. Plazmid saflaştırma
   1. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir plazmid saflaştırma kiti kullanarak plazmidi pozitif bir klondan arındırın (bkz.
      NOT: Plazmidi anyon değişim reçinesi veya hücre transfeksiyonunda kullanıma uygun başka bir kit kullanarak saflaştırın.
   2. 100 μg / mL ampisilin içeren standart bir bakteri büyüme ortamı kullanarak pozitif klonu (200 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de 12 saat) inkübe edin.
   3. Bakteri hücrelerini 6.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Üreticinin kit talimatlarına göre sonraki adımları izleyin.

2. AAV paketleme

NOT: AAV paketlemesi önceki yayınlara göre^15,16 küçük değişikliklerle gerçekleştirilmiştir.

1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) içeren 25 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) kullanılarak 175^{cm2'lik bir} şişede (şişe başına 5 ×^{10 6} hücrenin tohumlanması) plaka 293T hücreleri (bkz. Hücreler% 50 -% 70 birleşime ulaşana kadar 37 ° C,% 5 CO₂ ve% 95 nemde inkübe edin.
2. 14 μL polietilenimin (1 μg/μL) ile 1 mL 150 mM NaCl karıştırın. AAV üretimi için gerekli üç plazmidi 1:1:1 molar oranında (yani, 17.7 μg pAdDeltaF6, 7.9 μg AAV2/8 (bakınız Malzeme Tablosu) ve 150 mM NaCl'nin 1 mL'sinde 1. adımdan 5.9 μg klonlanmış sgRNA'yı karıştırın. Polietilenimin:NaCl karışımını DNA'yı (plazmidlerin karışımı) içeren tüpe damla damla aktarın ve 25 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
   NOT: pAdDeltaF6 bir Yardımcı plazmiddir ve pCapsid pAAV2/8, Replikasyon (Rep) ve Kapsid (kapak) genlerini eksprese eden bir ambalaj plazmididir. Her iki plazmid de AAV üretmek için gereklidir.
3. Transfeksiyondan önce, hücre büyüme ortamını% 1 FBS ve L-alanil-L-glutamin (0.5 g / L) içeren 18 mL DMEM ile değiştirin. Her kültür şişesine 2 mL polietilenimin:DNA karışımı ekleyin ve hücreleri bir CO 2 inkübatöründe inkübe edin (37 ° C,% 5 CO₂,% 95 nem).
4. 5 saat sonra,% 10 FBS ve L-alanil-L-glutamin (0.5g / L) ile desteklenmiş 5 mL DMEM ekleyin.
5. 3 günlük inkübasyondan sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kültür şişesinden ayırın. 293T hücrelerini 10 (175^cm2) hücre kültürü şişesinden 50 mL konik tüplere toplayın ve 30 mL'ye kadar DMEM ekleyin (bkz.
6. 293T hücrelerini içeren her 50 mL konik tüpe 3 mL kloroform ekleyin ve 5 dakika boyunca yüksek hızda bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın. 7.6 mL 5 M NaCl ve kısaca vorteks ekleyerek hücreleri yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca 3.000 × g ve 4 ° C'de santrifüj.
7. Sulu fazı yeni bir konik tüpe aktarın ve 9.4 mL% 50 (v / v) polietilen glikol (PEG) 8000 ekleyin. Bir vorteks karıştırıcı ile 10 s boyunca yüksek hızda karıştırın ve numuneleri 1 saat boyunca buz üzerine koyun.
8. 30 dakika boyunca 4 °C'de 3.000 × g'da santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve peletin 10 dakika kurumasını bekleyin.
9. 1,4 mL HEPES (50 mM, pH 8) ekleyin ve yüksek hızda bir vorteks karıştırıcı kullanarak 5 dakika boyunca karıştırın. 3.5 μL 1 M MgCl₂, 14 μL DNaz I (20 birim / μL) ve 1.4 μL RNaz A (10 μg / μL) ekleyin. 37 ° C'lik bir su banyosunda 20 dakika boyunca inkübe edin ve ardından numuneleri yeni 1,5 mL tüplere aktarın (her tüpte 700 μL).
10. Her 1,5 mL'lik tüpe 700 μL kloroform ekleyin ve 10 sn boyunca yüksek hızda bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 3.000 × g'da santrifüj yapın ve sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Bu adımı 3x tekrarlayın.
11. Kloroformu bir biyogüvenlik kabininde 30 dakika buharlaştırın. Daha sonra, sulu fazın 300 μL'sini 0,5 mL'lik bir ultra santrifüjleme tüpüne aktarın ( bkz. Filtreyi 25 °C'de 14.000 × g'da 5 dakika döndürün. Akışı çıkarın ve tüm ses seviyesi filtreden geçene kadar filtreyi tekrar döndürün.
12. Filtreyi 300 μL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) ekleyerek yıkayın ve çözeltileri pipetleme ile karıştırın. Filtreyi 25 °C'de 14.000 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin. Bu yıkama adımını 4x tekrarlayın.
13. Filtreyi 25 °C'de 14.000 × g'da 8 dakika boyunca santrifüjleyin. Filtreyi yeni bir tüpe baş aşağı yerleştirin ve 25 ° C'de 1.000 × g'da 2 dakika döndürün.

3. AAV'nin qPCR ile titrasyonunun yapılması

1. AAV titrasyonu için standart bir eğri hazırlayın ve Fripont ve ^ark.15 tarafından yapılan orijinal çalışmaya göre AAV titresini belirleyin.

4. AAV'nin inguinal beyaz yağ dokusuna (iWAT) in vivo enjeksiyonu

1. Ameliyat için gerekli cerrahi aletleri ve malzemeleri ayırın ve her bir malzeme için önerilen şekilde sterilize edin.
2. İntraperitoneal enjeksiyonla fareyi 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin ile uyuşturun. Pençe ve kuyruk üzerinde kuvvetli bir baskı uygulayarak ve bir refleks olup olmadığını kontrol ederek anesteziyi onaylayın. Ameliyat sırasında göz kuruluğunu önlemek için farenin gözlerine merhem sürün.
3. Anestezi uygulanan fareyi sırtüstü pozisyona yerleştirin ve bir tıraş makinesi ile iWAT enjeksiyonları için kalça eklemlerine yakın, yanlarda küçük bir alanı tıraş edin. 5 dakika boyunca tüy dökücü krem sürün. Cilt yanmasını önlemek için artık kremi suyla çıkarın.
4. Cildin üzerine üç alternatif antiseptik çözelti (povidon-iyot) uygulayarak cildi temiz bir gazlı bez ve% 70 alkol ile dezenfekte edin. Her kullanımdan sonra gazlı bezi atın.
5. Cilde antiseptik bir çözeltinin son uygulamasını yapın. Daha sonra, eklemlerin proksimal bölgesinde sterilize edilmiş makasla 1-2 cm'lik bir kesi yapın ve yağ deposunu açığa çıkarmak için forseps kullanarak cildi açık tutun. WAT, her iki taraftaki cilde bağlı olarak, başlangıçtan itibaren sırtta ve testislere doğru uzanır.
   NOT: Ameliyat veya dikiş prosedürleri sırasında kontaminasyonu önlemek için perdeler kullanın.
6. Forseps kullanarak, insizyon boyunca, enjeksiyonun doğru yerde ve derinlikte olduğundan emin olmak için yağ deposunu yavaşça yukarı doğru çekin.
   NOT: Dokuyu orijinal konumundan çıkarmamaya dikkat edin.
7. Mikrolitre şırıngasını (gösterge: 33; nokta stili: 4; açı: 12; uzunluk: 10) (bakınız Malzeme Tablosu) AAV'nin 2.5 μL (5.6 ×^{10 10} viral genomu [VG]/μL) ile doldurun (endojen Prdm16 genini hedef alan sgRNA'yı içerir). İğneyi iWAT'a 30°-45° açıyla dikkatlice yerleştirin. Tüm iWAT yağ yastığını homojen bir şekilde enfekte etmek için enjeksiyonu dokunun farklı yerlerine 5 kez tekrarlayın. iWAT'ı enfekte etmek için toplam 15 μL'lik bir hacim önerilir.
   NOT: Şırınganın yerleştirilme derinliği, yağ yastığı birikintisinin kalınlığına bağlıdır. Enjeksiyonu hazırlamak için dokunma tekniğini kullanın.
8. Tıraş edilen cilt insizyonunu 4/0 monofilament sütürler kullanarak kapatın. Bilinç yeniden kazanılana kadar fareyi bir ısı yastığına yerleştirin. Tamamen iyileşene kadar hayvanı her 10-15 dakikada bir izleyin. Hayvan bilincini yeniden kazandıktan sonra, doğrusal olması gereken ve sıkıntı veya ağrı belirtisi olmayan lokomotor profillemesini gözlemleyin.
9. Ameliyattan sonraki 48 saat içinde tramadol hidroklorür (5 mg/kg) intraperitoneal olarak 3 gün (2x/gün) süreyle uygulanarak postoperatif ağrı kontrolü yapın.
   NOT: Sıkıntı ve rahatsızlık belirtilerini izleyin ve su ve yiyecek alımını izleyin. Önleyici bir şekilde, tercihen ameliyattan önce veya ameliyatın başında etkili bir analjezik dozu verin.
10. İyileşme döneminde fareyi yiyecek ve suya serbest erişimi olan bir kafeste tutun. İyileşme süresinden sonra, fareyi ötenazi yapmaya devam edin. Bu çalışmada ötenazi, indükleyici dozun 3 katından (300-360 mg / kg ketamin hidroklorür + 30-40 mg / kg ksilazin hidroklorür) aşırı dozda enjekte edilebilir anestezik (intraperitoneal) ve ardından kafa kesme ile gerçekleştirildi.
    NOT: Anesteziden tamamen iyileşene kadar hayvanların ayrı kafeslerde tutulması şiddetle tavsiye edilir.

5. Stromal vasküler hücrelerin (SVF'ler) bej adipositlere in vitro farklılaşması

1. Aune ve ^ark.17'ye göre, AdipoSPH farelerinin iWAT'ından birincil SVF'lerin izolasyonunu ve kaplanmasını gerçekleştirin. AdipoSPH fareleri iWAT'tan türetilen tohum SVF'leri, 1-2 saat boyunca tam ortam (3.1 g / L glikoz, 0.5 g / L L-alanil-L-glutamin,% 10 FBS ve% 2.5 P / S içeren DMEM) içeren 6 delikli bir plakaya türetilmiştir.
   NOT: SVF fraksiyonu farklı hücre tiplerinin bir karışımını içerir. Bu aşamada, adipositlere yol açan tohumlanmış progenitör hücrelerin sayısını tanımlamak mümkün değildir.
2. Ortamı aspire edin, fosfat tamponlu salin (1x PBS) kullanarak kuyuyu 2x yıkayın ve taze komple ortamla değiştirin. Hücreleri% 70 -% 80 akıcılığa ulaşana kadar hücreleri 37 ° C,% 5 CO₂,% 95 nemde inkübe edin.
3. Hücreleri indüksiyon ortamı ile tedavi ederek farklılaşmayı (gün 0) indükleyin (Tablo 2).
   NOT: İndüksiyon ortamının ilaç kokteyli, bej adiposit farklılaşmasını arttırmak ve termojenik gen programı^17'nin ekspresyonu için gereklidir.
4. 2 gün sonra (2. gün), indüksiyon ortamını bakım ortamıyla değiştirin (Tablo 2).
5. 2 gün sonra (4. gün), bakım ortamını 2 ila 3 gün boyunca taze bakım ortamıyla (Tablo 2) değiştirin.
6. Preadipositler adipositlere tamamen farklılaşana kadar (tipik olarak indüksiyon ortamının eklenmesinden 6 gün sonra) bakım ortamını her 48 saatte bir değiştirin. Olgun adipositler ışık mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir, çünkü farklılaşmış hücreler lipit damlacıkları ile yüklü gibi görünmektedir.

6. SVF'lerin in vitro AAV enfeksiyonu

NOT: AdipoSPH fareleri iWAT'tan türetilen SVF'ler, Wang ve ^ark.18 tarafından daha önce birkaç modifikasyonla tarif edildiği gibi AAV taşıyan sgRNA-Prdm16 ile enfekte olmuştur.

1. Hücreleri, daha önce 5.1-5.3 adımlarında tarif edildiği gibi, hücreler% 70-80 birleşmeye ulaşana kadar tam ortamla 6 delikli bir kültür plakası üzerinde büyütün.
2. 5.6 ×^{10 10} VG/μL AAV taşıyan sgRNA-Prdm16'yı 2 mL tam ortam ve hekzadimetrin bromür (8 μg/mL) ile karıştırın (bkz. Tam ortamı değiştirerek ve AAV içeren tam ortamı ekleyerek hücreleri dönüştürün. Dönüştürülen hücreleri 37 ° C'de,% 95 nem ve% 5 CO'da 12 saat boyunca inkübe edin_.
3. Hücre proliferasyonu ve bej adipositlere farklılaşma için adım 5'te açıklandığı gibi hücreleri bölün ve tohumlayın.
   NOT: Oksijen tüketimi testi için, tohum 4.0, 24 delikli bir hücre kültürü plakasında indüksiyon ortamı ile kuyu başına 10⁴ hücreye (adım 6.2'den itibaren) ×. Hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının sonraki adımları, adım 5'te açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Oksijen tüketimi testi, hücreler% 80-100 birleşmeye ulaştığında ve daha önce bildirildiği gibi tamamen farklılaştığında gerçekleştirilir¹⁹.

Sonuçlar

AdipoSPH fareleri, SPH ve Adipoq-Cre fare suşlarının üremesiyle geliştirilmiştir. Her iki fare suşu da hibrit bir C57BL6J-DBA / 2J arka planındaydı (ticari tedarikçiye göre; bkz. SPH fare soyu başlangıçta Zhou ve ^ark.14 tarafından tanımlanmıştır.

AdipoSPH aracılı Prdm16 aşırı ekspresyonu yoluyla in vivo bej adiposit gelişimi
Bu çalışmada açıklanan modelin in vivo bej a...

Tartışmalar

CRISPR teknolojisinin en kullanışlı düzenleme dışı uygulamalarından biri, CRISPRa sistemleri⁶ kullanılarak endojen genlerin aktivasyonu yoluyla gen fonksiyonunun sorgulanmasıdır. SPH, başlangıçta birkaç nörojenik geni hedef alarak astrositlerin aktif nöronlara dönüşümünü indüklediği açıklanan güçlü bir CRISPRa'dır¹⁴. Bu çalışmada, AdipoSPH'nin adipositlerde endojen Prdm16 ekspresyonunu aktive ederek bej yağ biyolojisini araştırmak için ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma-Aldrich	T2877
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879
AAVpro 293T Cell Line	Takarabio	632273
Amicon Ultra Centrifugal Filter	Merckmillipore	UFC510008	100 KDa
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Corning	10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement	Gibco	10565-018	high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Excelta Self-Opening Micro Scissors	Fisher Scientific	17-467-496
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)	Fisher Scientific	08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-940
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278
LigaFast Rapid DNA Ligation System	Promega	M8225
Maxiprep purification kit	Qiagen	12162
Microliter syringe	Hamilton	80308	Model 701
NEB 10-beta/Stable	New England Biolabs	C3019H	E. coli competent cells
pAAV2/8	Addgene	112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry	Addgene	91947
pAdDeltaF6	Addgene	112867
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Polyethylenimine	Sigma-Aldrich	23966	Linear, MW 25000
Povidone-iodine	Rioquímica	510101303	Antiseptic
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
SacI enzyme	New England Biolabs	R0156
Surgical Design Premier Adson Forceps	Fisher Scientific	22-079-741
Syringe	Hamilton	475-40417
T4 DNA Ligase	Promega	M180B
T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
T4 PNK enzyme kit	New England Biolabs	M0201S
Tramadol Hydrochloride	SEM	43930
Vidisic Gel	Bausch + Lomb	99620