使用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学和代谢

摘要

该协议提出了在脂肪细胞（AdipoSPH）中使用CRISPR SunTag-p65-HSF1（SPH）作为腺相关病毒（AAV）的替代策略来研究米色脂肪生物学。 体内 注射靶向内源性Prdm16基因的携带AAV的sgRNA足以诱导米色脂肪发育并增强产热基因程序。

摘要

成簇规则间隔短回文重复（CRISPR）技术引发了生物学的革命，最近的工具已经远远超出了最初描述的基因编辑。CRISPR活化（CRISPRa）系统将催化无活性的Cas9（dCas9）蛋白与不同的转录模块相结合，以诱导内源性基因表达。SunTag-p65-HSF1（SPH）是最近开发的一种CRISPRa技术，它将协同激活介质（SAM）的成分与SunTag激活剂相结合。该系统通过设计定制的单向导RNA（sgRNA）允许单个或多个基因的过表达。在这项研究中，先前开发的SPH小鼠用于在脂肪细胞（脂联素Cre谱系）中产生表达SPH的条件小鼠，称为AdipoSPH。为了诱导白色至米色脂肪（褐变）表型，将携带靶向内源性Prdm16基因（一种与棕色和米色脂肪发育相关的成熟转录因子）的sgRNA的腺相关病毒（AAV）注射到腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中。该小鼠模型诱导内源性Prdm16的表达并激活产热基因程序。此外， 体外 SPH诱导的Prdm16过表达增强了米色脂肪细胞的耗氧量，表型复制了先前Prdm16转基因小鼠模型的结果。因此，该协议描述了一种用于研究脂肪组织生物学的多功能，经济高效且具有时间效率的小鼠模型。

引言

米色（或卤状）脂肪细胞是解偶联表达蛋白 1 （UCP1） 和富含线粒体的脂肪细胞，位于白色脂肪组织 （WAT） 库中。米色脂肪来自脂肪细胞祖细胞或成熟白色脂肪细胞的亚群，以响应寒冷暴露和其他刺激1^，2。米色脂肪细胞可以以UCP1依赖性或独立的方式将能量转化为热量³。除了产热功能如何，米色脂肪还可以通过其他方式改善代谢健康，例如脂肪因子的分泌和抗炎和抗纤维化活性。对小鼠和人类的研究表明，米色脂肪的诱导改善全身葡萄糖和脂质稳态³。然而，尽管近年来我们对米色脂肪生物学的了解发展迅速，但其大部分代谢益处和相关机制仍未完全了解。

簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）首先在真核细胞中被描述为能够通过Cas9^蛋白4，5的核酸酶活性在基因组的特定位点产生双链断裂（DSB）的工具。Cas9由合成的单向导RNA（sgRNA）引导，靶向特定的基因组区域，从而产生DNA DSB。除了使用核酸酶Cas9进行编辑外，CRISPR-Cas9技术还发展成为序列特异性基因调控工具⁶。催化无活性Cas9蛋白（dCas9）的发展和能够增强基因表达的转录模块的结合产生了CRISPR激活（CRISPRa）工具。已经出现了几种CRISPRa系统，例如VP64⁷，⁸，协同激活介质（SAM）⁹，SunTag¹⁰，11，VPR 12，13和SunTag-p65-HSF1（SPH）^14，它们结合了SAM和SunTag激活剂的组件。最近已经证明，与其他CRISPRa系统相比，使用SPH诱导的N2a神经母细胞和原代星形胶质细胞中神经源性基因的表达更高¹⁴，这表明SPH是一种有前途的CRISPRa工具。

在这里，我们利用先前开发的SPH小鼠¹⁴ ，使用脂联素Cre谱系（AdipoSPH）生成在脂肪细胞中特异性表达SPH的条件小鼠模型。使用携带靶向内源性Prdm16基因的gRNA的腺相关病毒（AAV），诱导腹股沟WAT（iWAT）的褐变（白色到米色转换）以增加产热基因程序的表达。此外， 体外 Prdm16过表达增加了耗氧量。因此，该协议提供了一种多功能的SPH小鼠模型，用于探索脂肪组织内米色脂肪发育的机制。

研究方案

动物研究是根据坎皮纳斯大学实验动物护理和使用指南（协议CEUA #5810-1/2021）进行的。

1. 分子克隆

1. 单向导RNA（sgRNA）的设计
   1. 使用CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/ 提供）或任何其他合适的工具设计用于CRISPR激活的sgRNA。使用以下参数设计靶向Prdm16基因的sgRNA:靶标:Prdm16;在:肌肉肌肉;使用:Crispr/Cas9;对于:激活。
      注意:为每个感兴趣的区域设计sgRNA，分布在200 bp上游转录起始位点（TSS）区域。例如，本研究中使用的靶向Prdm16的sgRNA结合TSS上游的154 bp。
   2. 向sgRNA添加突出部分以匹配载体骨架pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry中的SacI限制性位点（参见 材料表）。包括:5'-（N20）AGCT-3'（N =核苷酸）。例如，靶向Prdm16基因的序列是5'-CGAGCTGCGCTGAAAAAGGGG-3'，悬垂是5'-CGAGCTGCGCTGAAAAAGGGAGCT-3'。
   3. 使用 https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html 提供的工具获取 3' sgRNA 逆转补体序列。例如，靶向Prdm16基因的3'sgRNA序列是3'-TCGAGCTCGACGCGACTTTTTCCCC-5'。
2. 单链互补寡核苷酸的退火
   1. 加入 1 μL 各 5' 和 3' 单链寡核苷酸（储备浓度:100 μM）、1 μL T4 连接酶缓冲液、0.5 μL T4 多核苷酸激酶 （PNK）（1 × 10⁴ 单位/mL）和 6.5 μL H₂O 至最终反应体积为 10 μL。 在以下条件下使用热循环仪对互补的单链寡核苷酸进行退火: 37°C30分钟和95°C5分钟，然后以5°C / min的斜坡速率下降。
      注意:PNK酶与PNK缓冲液一起提供，并且不含磷酸化反应所需的足够ATP（参见 材料表）。为了简化反应，请使用T4连接酶缓冲液（而不是PNK缓冲液）。T4连接酶缓冲液为磷酸化反应提供适量的磷酸盐（1mM ATP）。PNK酶为随后的连接反应提供寡核苷酸的5'末端磷酸化。
3. 退火的sgRNA寡核苷酸的连接
   1. 将 25 ng 质粒 pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry 加入 2 μL 退火的 sgRNA 寡核苷酸、1 μL SacI 酶、2 μL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、1 μL T4 DNA 连接酶 （1-3 u/μL）（参见 材料表）和 H₂O 至最终反应体积 10 μL。
   2. 通过在以下条件下使用热循环仪孵育反应混合物来进行连接:37°C的15个循环5分钟和25°C的5分钟，然后在4°C下保持。
4. 转化后进行集落聚合酶链反应（PCR）
   1. 使用热休克（42°C45秒）用4μL连接产物转化感受态 大肠杆菌 DH10B细胞（参见 材料表），并铺展在含有100μg/ mL氨苄青霉素的琼脂平板上。
   2. 使用PCR预混液通过菌落PCR确认转化的菌落（参见 材料表）。挑选菌落并与 5 μL 预混液、0.1 μL 通用引物（储备浓度:100 μM）、0.1 μL sgRNA 反向引物（储备浓度:100 μM）（表 1）和 5 μL H₂O 混合。 在以下条件下使用热循环仪运行PCR:初始变性（94°C2分钟）， 然后进行35个变性循环（94°C持续20秒），退火（60°C持续30秒），延伸（72°C持续30秒）和最终伸长步骤（72°C持续5分钟）。使用琼脂糖（1.5%）凝胶电泳在90 V的0.5x TAE缓冲液中分离DNA30分钟。
      注意:阳性克隆给出~280 bp的条带。
   3. 使用通用引物提交阳性样品进行Sanger测序（表1，补充文件1）。
5. 质粒纯化
   1. 按照制造商的说明，使用质粒纯化试剂盒（参见 材料表）从阳性克隆中纯化质粒。
      注意:使用阴离子交换树脂或其他适合细胞转染的试剂盒纯化质粒。
   2. 使用含有100μg/ mL氨苄青霉素的标准细菌生长培养基孵育阳性克隆（在37°C下以200rpm振荡12小时）。
   3. 在4°C下以6，000× g 离心细菌细胞10分钟。 根据制造商的套件说明执行后续步骤。

2. AAV包装

注意:AAV包装是根据以前的出版物^15，16 进行的，略有修改。

1. 使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P / S）的25mL Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）在175cm²烧瓶中（每个烧瓶接种5×10⁶个细胞）中板293T细胞（参见材料表）。在37°C，5%CO₂和95%湿度下孵育，直到细胞达到50%-70%汇合。
2. 将 14 μL 聚乙烯亚胺 （1 μg/μL） 与 1 mL 150 mM NaCl 混合。将AAV生产所需的三种质粒以1:1:1摩尔比混合（即17.7μgpAdDeltaF6，7.9μgAAV2 / 8（参见 材料表）和5.9μg来自步骤1的克隆sgRNA，1 mL 150 mM NaCl。将聚乙烯亚胺:NaCl混合物逐滴转移到含有DNA（质粒混合物）的管中，并在25°C下孵育20分钟。
   注意:pAdDeltaF6是辅助质粒，p衣壳pAAV2 / 8是表达复制（Rep）和衣壳（帽）基因的包装质粒。两种质粒都是产生AAV所必需的。
3. 转染前，用含有1%FBS和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（0.5 g/L）的18 mL DMEM替换细胞生长培养基。向每个培养瓶中加入 2 mL 聚乙烯亚胺:DNA 混合物，并将细胞在 CO 2 培养箱（37 °C、5% CO₂、95% 湿度）中孵育。
4. 5小时后，加入5mL补充有10%FBS和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（0.5g / L）的DMEM。
5. 孵育3天后，使用细胞刮刀将细胞从培养瓶中分离。将 293T 细胞从 10 （175 cm²） 细胞培养瓶中收集到 50 mL 锥形管中，并加入高达 30 mL 的 DMEM（参见材料表）。
6. 向含有293T细胞的每个50 mL锥形管中加入3 mL氯仿，并使用涡旋混合器高速混合5分钟。通过加入 7.6 mL 的 5 M NaCl 重悬细胞并短暂涡旋。在3，000× g 和4°C下离心5分钟。
7. 将水相转移到新的锥形管中，加入 9.4 mL 的 50% （v/v） 聚乙二醇 （PEG） 8000。用涡旋混合器高速混合10秒，然后将样品放在冰上1小时。
8. 在4°C下以3，000× g 离心30分钟。除去上清液，让沉淀干燥10分钟。
9. 加入 1.4 mL HEPES（50 mM，pH 8），并使用涡旋混合器高速混合 5 分钟。加入 3.5 μL 的 1 M MgCl₂、14 μL 的 DNase I（20 单位/μL）和 1.4 μL 的 RNase A（10 μg/μL）。在37°C水浴中孵育20分钟，然后将样品转移到新的1.5 mL管中（每个管中700μL）。
10. 向每个 1.5 mL 管中加入 700 μL 氯仿，并使用涡旋混合器高速混合 10 秒。在4°C下以3，000× g 离心5分钟，并将水相转移到新管中。重复此步骤 3 次。
11. 在生物安全柜中蒸发氯仿30分钟。然后，将 300 μL 水相转移到 0.5 mL 超速离心管中（参见 材料表）。在25°C下以14，000 ×g 旋转过滤器5分钟。取出流通物并再次旋转过滤器，直到整个体积通过过滤器。
12. 通过加入 300 μL Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 清洗过滤器，并通过移液混合溶液。在25°C下以14，000× g 离心过滤器5分钟。 重复此洗涤步骤4x。
13. 在25°C下以14，000× g 离心过滤器8分钟。 将过滤器倒置到新管中，并在25°C下以1，000× g 旋转2分钟。

3. 通过 qPCR 滴定 AAV

1. 准备AAV滴定的标准曲线，并根据Fripont等人的原始研究确定AAV滴度¹⁵。

4. 体内 将AAV注射到腹股沟白色脂肪组织（iWAT）

1. 分离手术所需的手术工具和用品，并按照每种特定材料的建议对其进行消毒。
2. 通过腹膜内注射用100mg / kg氯胺酮和10mg / kg甲苯噻嗪麻醉小鼠。通过对爪子和尾巴施加剧烈的压力并检查反射来确认麻醉。在小鼠的眼睛上涂抹软膏，以避免在手术过程中眼睛干燥。
3. 将麻醉的小鼠置于仰卧位，并用剃须刀在侧面剃除一小块区域，靠近髋关节进行iWAT注射。涂抹脱毛膏5分钟。用水去除残留的乳霜，以免皮肤灼伤。
4. 用干净的纱布和70%的酒精在皮肤上交替涂抹三轮消毒液（聚维酮碘）对皮肤进行消毒。每次使用后丢弃纱布。
5. 在皮肤上最后一次涂抹防腐溶液。然后，用消毒剪刀在关节的近端区域做一个1-2厘米的切口，并用镊子保持皮肤打开，露出脂肪库。WAT可以附着在两侧的皮肤上，从背部开始向下延伸到睾丸。
   注意:在手术或缝合过程中使用窗帘以避免污染。
6. 使用镊子，通过切口，轻轻向上拉脂肪库，以确保注射处于正确的位置和深度。
   注意:注意不要将组织从其原始位置取出。
7. 用 2.5 μL（5.6 ×^{10 10} 病毒基因组 [VG]/μL）的 AAV（包含靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA）填充微升注射器（规格:33;点样式:4;角度:12;长度:10）（参见材料表）。小心地将针头以 30°-45° 角插入 iWAT。将注射5次重复注射到组织的不同位置，以均匀地感染整个iWAT脂肪垫。建议总体积为 15 μL 以感染 iWAT。
   注意:注射器的插入深度取决于脂肪垫沉积物的厚度。使用非接触技术进行注射。
8. 使用4/0单丝缝合线关闭剃光的皮肤切口。将鼠标放在加热垫上，直到恢复意识。每10-15分钟监测一次动物，直到它完全恢复。动物恢复意识后，观察运动轮廓，该轮廓应该是线性的，没有痛苦或疼痛的迹象。
9. 通过腹膜内给予盐酸曲马多（5mg / kg）3天（2x /天），在手术后48小时内进行术后疼痛控制。
   注意:注意痛苦和不适的迹象，并监测水和食物的摄入量。以先发制人的方式给予有效剂量的镇痛药，优选在手术前或手术开始时。
10. 在愈合期间将鼠标放在笼子里，可以自由获取食物和水。愈合期后，继续对小鼠实施安乐死。在这项研究中，安乐死是通过过量注射麻醉剂（腹膜内）从诱导剂量（300-360mg / kg盐酸氯胺酮+ 30-40mg / kg盐酸甲苯噻嗪）的3倍进行，然后斩首。
    注意:强烈建议将动物饲养在单独的笼子中，直到从麻醉中完全恢复。

5. 基质血管细胞（SVF）体 外 分化为米色脂肪细胞

1. 根据Aune等人¹⁷，从AdipoSPH小鼠的iWAT中分离和接种初级SVF。将源自AdipoSPH小鼠iWAT的种子SVF放入含有完全培养基（含有3.1g / L葡萄糖，0.5g / L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，10%FBS和2.5%P / S）的6孔板中1-2小时。
   注意:SVF 级分包含不同细胞类型的混合物。在此步骤中，无法定义产生脂肪细胞的种子祖细胞的数量。
2. 吸出培养基，使用磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）洗涤孔2次，并用新鲜的完全培养基替换。将细胞在37°C，5%CO₂，95%湿度下孵育，直到细胞达到70%-80%汇合。
3. 通过用诱导培养基处理细胞来诱导分化（第0天）（表2）。
   注意:诱导培养基的药物混合物对于增强米色脂肪细胞分化和表达产热基因程序¹⁷是必要的。
4. 2天后（第2天），用维持培养基更换诱导培养基（表2）。
5. 2天后（第4天），用新鲜的维持培养基（表2）更换维持培养基2至3天。
6. 每48小时更换一次维持培养基，直到前脂肪细胞完全分化为脂肪细胞（通常在加入诱导培养基后6天）。可以使用光学显微镜观察成熟的脂肪细胞，因为分化的细胞似乎装有脂滴。

6. SVF的 体外 AAV感染

注意:来自AdipoSPH小鼠iWAT的SVF感染了携带AAV的sgRNA-Prdm16，如Wang等人之前描述的那样¹⁸ 进行了一些修改。

1. 如步骤5.1-5.3中所述，在具有完整培养基的6孔培养板上培养细胞，直到细胞达到70%-80%汇合。
2. 将 5.6 ×^{10 10} VG/μL 携带 AAV 的 sgRNA-Prdm16 与 2 mL 完全培养基和六二甲基溴化物 （8 μg/mL） 混合（参见 材料表）。通过更换完整培养基并加入含有AAV的完整培养基来转导细胞。将转导的细胞在37°C，95%湿度和5%CO 2下孵育12小时_。
3. 按照步骤5中所述分裂并接种细胞，以细胞增殖并分化为米色脂肪细胞。
   注意:对于耗氧测定，在24孔细胞培养板中用诱导培养基每孔接种4.0×10⁴ 个细胞（来自步骤6.2）。如步骤5所述执行细胞增殖和分化的后续步骤。当细胞达到80%-100%汇合并完全分化时进行耗氧测定，如先前报道的¹⁹。

结果

AdipoSPH小鼠是通过培育SPH和Adipoq-Cre小鼠品系开发的。两种小鼠品系均处于杂交C57BL6J-DBA / 2J背景中（根据商业供应商;见 材料表）。SPH小鼠谱系最初由Zhou等人描述¹⁴。

通过 AdipoSPH介导的Prdm16过表达实现体内米色脂肪细胞发育
为了评估本研究中描述的模型在 体内发育米色脂肪细胞的能力，将携带靶向Prdm16基...

讨论

CRISPR技术最有用的非编辑应用之一是通过使用CRISPRa系统激活内源性基因来询问基因功能⁶。SPH是一种强大的CRISPRa，最初被描述为通过靶向几个神经源性基因来诱导星形胶质细胞转化为活跃的神经元¹⁴。在这项研究中，AdipoSPH被证明是通过激活脂肪细胞中内源性Prdm16的表达来研究米色脂肪生物学的合适工具。SPH诱导的Prdm16在脂肪细胞中的过表达导致产热基因程序的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma-Aldrich	T2877
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879
AAVpro 293T Cell Line	Takarabio	632273
Amicon Ultra Centrifugal Filter	Merckmillipore	UFC510008	100 KDa
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Corning	10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement	Gibco	10565-018	high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Excelta Self-Opening Micro Scissors	Fisher Scientific	17-467-496
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)	Fisher Scientific	08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-940
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278
LigaFast Rapid DNA Ligation System	Promega	M8225
Maxiprep purification kit	Qiagen	12162
Microliter syringe	Hamilton	80308	Model 701
NEB 10-beta/Stable	New England Biolabs	C3019H	E. coli competent cells
pAAV2/8	Addgene	112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry	Addgene	91947
pAdDeltaF6	Addgene	112867
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Polyethylenimine	Sigma-Aldrich	23966	Linear, MW 25000
Povidone-iodine	Rioquímica	510101303	Antiseptic
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
SacI enzyme	New England Biolabs	R0156
Surgical Design Premier Adson Forceps	Fisher Scientific	22-079-741
Syringe	Hamilton	475-40417
T4 DNA Ligase	Promega	M180B
T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
T4 PNK enzyme kit	New England Biolabs	M0201S
Tramadol Hydrochloride	SEM	43930
Vidisic Gel	Bausch + Lomb	99620