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要約

このプロトコルは、ベージュ脂肪生物学を調査するためのアデノ随伴ウイルス(AAV)の代替戦略として、脂肪細胞(AdipoSPH)におけるCRISPR SunTag-p65-HSF1(SPH)の使用を示しています。内因性Prdm16遺伝子を標的とするAAV担持sgRNAの インビボ 注射は、ベージュ脂肪の発生を誘導し、熱発生遺伝子プログラムを増強するのに十分である。

要約

クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)技術は生物学の革命を引き起こし、最近のツールは最初に記述された遺伝子編集をはるかに超えて適用されています。CRISPR活性化(CRISPRa)システムは、触媒的に不活性なCas9(dCas9)タンパク質と異なる転写モジュールを組み合わせて、内因性遺伝子発現を誘導します。SunTag-p65-HSF1(SPH)は、相乗的活性化メディエーター(SAM)の成分とSunTagアクチベーターを組み合わせた最近開発されたCRISPRa技術です。このシステムは、カスタマイズされたシングルガイドRNA(sgRNA)を設計することにより、単一または複数の遺伝子の過剰発現を可能にします。本研究では、以前に開発したSPHマウスを用いて、脂肪細胞(アディポネクチンCre系統)でSPHを発現するAdipoSPHという名前の条件付きマウスを作製しました。白からベージュの脂肪(褐変)表現型を誘導するために、内因性Prdm16遺伝子(褐色およびベージュ色の脂肪の発生に関連する確立された転写因子)を標的とするsgRNAを搭載したアデノ随伴ウイルス(AAV)を鼠径部白色脂肪組織(iWAT)に注入した。このマウスモデルは、内因性Prdm16の発現を誘導し、熱発生遺伝子プログラムを活性化しました。さらに、 インビトロ SPH誘導Prdm16過剰発現は、ベージュ脂肪細胞の酸素消費を増強し、以前のPrdm16トランスジェニックマウスモデルの結果を表現コピーした。したがって、このプロトコルは、脂肪組織生物学を調査するための、用途が広く、費用効果が高く、時間効率の高いマウスモデルを記述します。

概要

ベージュ(またはブライト)脂肪細胞は、白色脂肪組織(WAT)デポー内に存在する脱共役タンパク質1(UCP1)発現およびミトコンドリアに富む脂肪細胞です。ベージュ色の脂肪は、低温曝露および他の刺激に応答して脂肪細胞前駆細胞または成熟白色脂肪細胞のサブセットから出現する1,2。ベージュ色の脂肪細胞は、UCP1依存的または独立した方法でエネルギーを熱に変換することができます3。ベージュ色の脂肪は、その熱発生機能に関係なく、アディポカインの分泌や抗炎症および抗線維化活性などの他の手段によって代謝の健康を改善することもできます。マウスとヒトでの研究では、ベージュ脂肪の誘導が全身のグルコースと脂質の恒常性を改善することが示されています3。しかし、ベージュ脂肪生物学に関する私たちの知識は近年急速に進化していますが、その代謝の利点と関連するメカニズムのほとんどはまだ完全には理解されていません。

クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)は、Cas9タンパク質4,5のヌクレアーゼ活性を介してゲノムの特定の部位に二本鎖切断(DSB)を生成できるツールとして真核細胞で最初に説明されました。Cas9は、合成シングルガイドRNA(sgRNA)によって誘導され、特定のゲノム領域を標的とし、DNA DSBにつながります。編集目的でヌクレアーゼCas9を使用することに加えて、CRISPR-Cas9技術は、配列特異的遺伝子調節ツール6として使用されるように進化した。触媒的に不活性なCas9タンパク質(dCas9)の開発と、遺伝子発現を増強することができる転写モジュールの会合により、CRISPR活性化(CRISPRa)ツールが生まれました。VP64 7,8、相乗的活性化メディエーター(SAM)9、SunTag10,11、VPR 12,13、SAMとSunTagアクチベーターのコンポーネントを組み合わせたSunTag-p65-HSF1(SPH)14など、いくつかのCRISPRaシステムが登場しました。最近、N2a神経芽細胞および初代星状細胞における神経原性遺伝子の誘導発現が、他のCRISPRaシステムと比較してSPHを使用して高いことが実証され14、SPHが有望なCRISPRaツールとして実証されています。

ここでは、先に開発したSPHマウス14 を利用して、アディポネクチンCre系統(AdipoSPH)を用いて脂肪細胞に特異的にSPHを発現する条件付きマウスモデルを作製した。内因性Prdm16遺伝子を標的とするgRNAを搭載したアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いて、鼠径WAT(iWAT)の褐変(白からベージュへの変換)を誘導し、熱発生遺伝子プログラムの発現を増加させた。さらに、 インビトロ Prdm16過剰発現は酸素消費量を増加させた。したがって、このプロトコルは、脂肪組織内のベージュ脂肪発生のメカニズムを探索するための汎用性の高いSPHマウスモデルを提供します。

プロトコル

動物実験は、実験動物の世話と使用のためのカンピーナス大学ガイド(プロトコルCEUA #5810-1 / 2021)に従って実施されました。

1. 分子クローニング

  1. シングルガイドRNA(sgRNA)の設計
    1. CRISPR活性化用のsgRNAは、https://chopchop.cbu.uib.no/ で入手可能なCHOPCHOPまたはその他の適切なツールを使用して設計します。以下のパラメータを使用して、Prdm16遺伝子を標的とするsgRNAを設計します:ターゲット:Prdm16;で:ムスムスクルス;使用: クリスパー/キャス9;対象:アクティベーション。
      注:200 bpの上流転写開始部位(TSS)領域に広がる各関心領域のsgRNAを設計します。例えば、この研究で使用されたPrdm16を標的とするsgRNAは、TSSの上流154 bpに結合します。
    2. ベクター骨格pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherryのSacI制限部位と一致するように、sgRNAにオーバーハングを追加します( 材料表を参照)。含まれるもの:5'-(N20)AGCT-3'(N =ヌクレオチド)。例えば、Prdm16遺伝子を標的とする配列は5'-CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3'であり、オーバーハングを有する配列は5'-CGAGCTGCGCTGAAAAGGGCT-3'である。
    3. https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html で入手可能なツールを使用して、3' sgRNA逆補体配列を取得します。例えば、Prdm16遺伝子を標的とする3'-sgRNA配列は、3'-TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'である。
  2. 一本鎖相補的オリゴヌクレオチドのアニーリング
    1. 各5'および3'一本鎖オリゴヌクレオチド(ストック濃度:100 μM)1 μL、T4リガーゼバッファー1 μL、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)0.5 μL(1 ×10 4 単位/mL)、および6.5 μLのH2Oを最終反応容量10 μLに加えます。 相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを以下の条件下でサーモサイクラーを用いてアニールする: 37°Cで30分間、95°Cで5分間、その後5°C/分のランプダウン速度を実現します。
      注:PNK酵素にはPNKバッファーが付属しており、リン酸化反応に必要な十分なATPが含まれていません( 材料の表を参照)。反応を単純化するために、(PNKバッファーの代わりに)T4リガーゼバッファーを使用してください。T4リガーゼバッファーは、リン酸化反応に適量(1 mM ATP)のリン酸を提供します。PNK酵素は、その後のライゲーション反応のためにオリゴヌクレオチドの5'末端リン酸化を提供します。
  3. アニーリングしたsgRNAオリゴヌクレオチドのライゲーション
    1. 25 ngのプラスミドpAAV-U6-gRNA-CBh-mCherryを2 μLのアニーリングsgRNAオリゴヌクレオチド、1 μLのSacI酵素、2 μLの10x T4 DNAリガーゼバッファー、1 μLのT4 DNAリガーゼ(1-3 u/μL)( 材料の表を参照)、およびH2Oを最終反応容量10 μLに加えます。
    2. 以下の条件でサーモサイクラーを用いて反応混合物をインキュベートしてライゲーションを行い、37°Cで5分間および25°Cで5分間の15サイクルを行い、続いて4°Cで保持した。
  4. 形質転換とそれに続くコロニーポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
    1. ヒートショック(42°Cで45秒間)を使用して、有能な 大腸菌 DH10B細胞( 材料の表を参照)を4 μLのライゲーション製品で形質転換し、100 μg/mLのアンピシリンを含む寒天プレートに広げます。
    2. PCRマスターミックスを用いたコロニーPCRにより形質転換コロニーを確認します( 材料の表を参照)。コロニーを選び、5 μLのマスターミックス、0.1 μLのユニバーサルプライマー(ストック濃度:100 μM)、0.1 μLのsgRNAリバースプライマー(ストック濃度:100 μM)(表1)、および5 μLのH 2 Oと混合します。 以下の条件下でサーモサイクラーを使用してPCRを実行します。 初期変性(94°Cで2分間)、 その後、35サイクルの変性(94°Cで20秒間)、アニーリング(60°Cで30秒間)、伸長(72°Cで30秒間)、および最終伸長ステップ(72°Cで5分間)が続きます。アガロース(1.5%)ゲル電気泳動を0.5x TAEバッファー中、90 V、30分間で分離します。
      注:正のクローンは~280 bpのバンドを与えます。
    3. ユニバーサルプライマーを使用したサンガーシーケンシングの陽性サンプルを提出します(表1、補足ファイル1)。
  5. プラスミド精製
    1. プラスミド精製キット( 材料表を参照)を使用して、製造元の指示に従って、ポジティブクローンからプラスミドを精製します。
      注:陰イオン交換樹脂または細胞トランスフェクションでの使用に適した別のキットを使用してプラスミドを精製します。
    2. 100 μg/mLのアンピシリンを含む標準的な細菌増殖培地を使用して、ポジティブクローンをインキュベートします(200 rpmで振とうしながら37°Cで12時間)。
    3. 菌体を6,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 製造元のキットの指示に従って、次の手順に従います。

2. AAVの包装

注:AAVパッケージングは、以前の出版物15,16に従って、わずかな変更を加えて実行されました。

  1. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を含む25mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用して、175cm2フラスコ(フラスコあたり5×106細胞を播種)に293T細胞(材料の表を参照)をプレートします。細胞が50%〜70%のコンフルエントに達するまで、37°C、5%CO2、および95%の湿度でインキュベートします。
  2. 14 μLのポリエチレンイミン(1 μg/μL)を1 mLの150 mM NaClと混合します。AAV産生に必要な3つのプラスミドを1:1:1のモル比で混合します(すなわち、17.7 μgのpAdDeltaF6、7.9 μgのAAV2/8( 材料の表を参照)、およびステップ1のクローニングされたsgRNAの5.9 μgを1 mLの150 mM NaClに混合します。ポリエチレンイミン:NaCl混合物をDNA(プラスミドの混合物)を含むチューブに一滴ずつ移し、25°Cで20分間インキュベートします。
    注:pAdDeltaF6はヘルパープラスミドであり、pCapsid pAAV2/8は複製(Rep)およびカプシド(cap)遺伝子を発現するパッケージングプラスミドです。両方のプラスミドはAAVを産生するのに必要である。
  3. トランスフェクションの前に、細胞増殖培地を1%FBSおよびL-アラニル-L-グルタミン(0.5 g/L)を含む18 mLのDMEMと交換します。2 mLのポリエチレンイミン:DNA混合物を各培養フラスコに加え、CO2インキュベーター(37°C、5%CO2、湿度95%)で細胞をインキュベートします。
  4. 5時間後、10%FBSとL-アラニル-L-グルタミン(0.5g / L)を添加した5 mLのDMEMを追加します。
  5. 3日間のインキュベーション後、セルスクレーパーを使用して培養フラスコから細胞を剥離する。10(175 cm2)細胞培養フラスコから293T細胞を50 mLコニカルチューブに回収し、DMEM(材料表を参照)を最大30 mLまで加えます。
  6. 293T細胞を含む各50 mLコニカルチューブに3 mLのクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーを使用して高速で5分間混合します。7.6 mLの5 M NaClとボルテックスを短時間加えて細胞を再懸濁します。3,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。
  7. 水相を新しいコニカルチューブに移し、9.4 mLの50%(v / v)ポリエチレングリコール(PEG)8000を加えます。ボルテックスミキサーで高速で10秒間混合し、サンプルを氷上に1時間置きます。
  8. 3,000 × g 、4°Cで30分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを10分間乾燥させます。
  9. 1.4 mLのHEPES(50 mM、pH 8)を加え、ボルテックスミキサーを使用して高速で5分間混合します。3.5 μLの1 M MgCl2、14 μLのDNase I(20ユニット/μL)、および1.4 μLのRNase A(10 μg/μL)を追加します。37°Cの水浴中で20分間インキュベートした後、サンプルを新しい1.5 mLチューブ(各チューブに700 μL)に移します。
  10. 各1.5 mLチューブに700 μLのクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーを使用して高速で10秒間混合します。3,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離し、水相を新しいチューブに移します。この手順を3回繰り返します。
  11. バイオセーフティキャビネットでクロロホルムを30分間蒸発させます。次に、300 μLの水相を0.5 mLの超遠心チューブに移します( 材料の表を参照)。フィルターを14,000 × g で25°Cで5分間回転させます。フロースルーを取り外し、ボリューム全体がフィルターを通過するまでフィルターを再度回転させます。
  12. 300 μLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を加えてフィルターを洗浄し、ピペッティングで溶液を混合します。フィルターを25°C、14,000 × g で5分間遠心分離します。 この洗浄ステップを4回繰り返します。
  13. フィルターを25°Cで14,000 × g で8分間遠心分離します。 フィルターを逆さまにして新しいチューブに入れ、25°Cで1,000 × g で2分間回転させます。

3. qPCRによるAAVの滴定

  1. AAV滴定の標準曲線を作成し、Fripontらによる元の研究に従ってAAV力価を決定します15。

4.鼠径部白色脂肪組織(iWAT)へのAAVの インビボ 注射

  1. 手術に必要な手術器具と消耗品を分離し、特定の材料ごとに推奨するように滅菌します。
  2. 腹腔内注射により、100 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンでマウスを麻酔します。.足と尾に強い圧力をかけ、反射をチェックして麻酔を確認します。手術中の目の乾燥を避けるために、マウスの目に軟膏を塗ります。
  3. 麻酔をかけたマウスを仰臥位に置き、iWAT注射のために股関節の近位にある脇腹の小さな領域をシェーバーで剃ります。脱毛クリームを5分間塗ります。皮膚のやけどを防ぐために、水で残留クリームを取り除きます。
  4. 清潔なガーゼと70%アルコールで消毒液(ポビドンヨード)を皮膚に塗布する3ラウンドを交互に使用して皮膚を消毒します。使用するたびにガーゼを捨ててください。
  5. 皮膚に消毒液を最終塗布します。次に、関節の近位領域で滅菌ハサミで1〜2 cmの切開を行い、鉗子を使用して皮膚を開いたままにして脂肪蓄積を露出させます。WATは両側の皮膚に付着しており、背中の最初から精巣に向かって下に伸びています。
    注意: 手術や縫合手順中の汚染を避けるために、ドレープを使用してください。
  6. 鉗子を使用して、切開を通して脂肪デポをゆっくりと上に引き上げ、注射が正しい位置と深さにあることを確認します。
    注意: ティッシュを元の場所から取り除かないように注意してください。
  7. マイクロリットルシリンジ(ゲージ:33、ポイントスタイル:4、角度:12、長さ:10)(材料の表を参照)に、AAV(内因性Prdm16遺伝子を標的とするsgRNAを含む)の2.5 μL(5.6 ×10 10 ウイルスゲノム[VG]/μL)を満たします。針を30°〜45°の角度でiWATに慎重に挿入します。組織のさまざまな場所に注射を5回繰り返して、iWAT脂肪パッド全体に均一に感染します。iWATに感染するには、総量15μLが推奨されます。
    注意: シリンジの挿入の深さは、脂肪パッド沈着物の厚さによって異なります。ノータッチテクニックを使用して注射を作成します。
  8. 4/0モノフィラメント縫合糸を使用して剃毛した皮膚切開を閉じます。意識が回復するまでマウスをヒートパッドに置きます。完全に回復するまで10〜15分ごとに動物を監視します。動物が意識を取り戻した後、線形で苦痛や痛みの兆候がないはずの自発運動プロファイリングを観察します。
  9. 塩酸トラマドール(5 mg / kg)を腹腔内に3日間投与することにより、術後48時間以内に術後の痛みの管理を実行します(2x /日)。.
    注意: 苦痛や不快感の兆候に注意し、水と食物の摂取量を監視します。鎮痛剤の有効用量を先制的に、好ましくは手術の前または開始時に投与する。
  10. 治癒期間中は、マウスをケージに入れて、食べ物や水に自由にアクセスできるようにしてください。治癒期間の後、マウスを安楽死させます。この研究では、安楽死は、誘発用量の3倍(300〜360 mg / kg塩酸ケタミン+ 30〜40 mg / kg塩酸キシラジン)からの注射可能な麻酔薬(腹腔内)の過剰投与とそれに続く断頭によって行われました。
    注:麻酔から完全に回復するまで、動物を個々のケージに収容しておくことを強くお勧めします。

5. 間質血管細胞(SVF)のベージュ脂肪細胞への in vitro 分化

  1. Auneら17に従ってAdipoSPHマウスのiWATからの一次SVFの単離およびプレーティングを行う。AdipoSPHマウスiWAT由来のSVFを完全培地(3.1 g/Lグルコース、0.5 g/L L-アラニル-L-グルタミン、10%FBS、および2.5%P/Sを含むDMEM)を含む6ウェルプレートに1〜2時間播種します。
    注:SVF画分には、異なる細胞タイプが混在しています。この段階では、脂肪細胞を生じさせる播種前駆細胞の数を定義することはできない。
  2. 培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を使用してウェルを2回洗浄し、新鮮な完全培地と交換します。細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するまで、37°C、5%CO2、95%の湿度で細胞をインキュベートします。
  3. 細胞を誘導培地で処理することにより分化を誘導する(0日目)。
    注:誘導培地の薬物カクテルは、ベージュ脂肪細胞の分化を増強し、熱発生遺伝子プログラムの発現に必要である17。
  4. 2日後(2日目)、誘導培地を維持培地と交換します(表2)。
  5. 2日後(4日目)、維持培地を新しい維持培地(表2)と2〜3日間交換します。
  6. 前駆脂肪細胞が脂肪細胞に完全に分化するまで(通常、誘導培地の添加後6日)48時間ごとに維持培地を交換します。成熟脂肪細胞は、分化した細胞に脂肪滴がロードされているように見えるため、光学顕微鏡を使用して観察できます。

6. SVFの 体外 AAV感染

注:AdipoSPHマウスiWAT由来のSVFは、Wangら18 によって前述されたように、いくつかの変更を加えてAAVを保有するsgRNA-Prdm16に感染しました。

  1. ステップ5.1〜5.3で前述したように、細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するまで、完全培地を含む6ウェル培養プレート上で細胞を増殖させます。
  2. 5.6 ×10 10 VG/μLのAAV担持sgRNA-Prdm16を2 mLの完全培地および臭化ヘキサジメトリン(8 μg/mL)と混合します(材料の表を参照)。完全な培地を交換し、AAVを含む完全な培地を添加することにより、細胞を形質導入します。形質導入した細胞を37°C、湿度95%、CO25%で12時間インキュベートします。
  3. 細胞増殖およびベージュ脂肪細胞への分化のためにステップ5に記載されるように細胞を分割および播種する。
    注:酸素消費アッセイでは、24ウェル細胞培養プレートに誘導培地を使用して、ウェルあたり4.0×104 細胞(ステップ6.2から)をシードします。細胞増殖および分化の後続のステップは、ステップ5に記載されるように実行される。酸素消費アッセイは、細胞が80%〜100%のコンフルエントに達し、以前に報告されたように完全に分化したときに実行されます19。

結果

AdipoSPHマウスは、SPHおよびAdipoq-Creマウス系統を繁殖させることによって開発された。両方のマウス系統は、ハイブリッドC57BL6J-DBA/2Jバックグラウンドにあった(商業サプライヤーによる; 材料表を参照)。SPHマウス系統は、もともとZhouらによって記載された14。

AdipoSPHを介したPrdm16過剰発現によるインビボベージ...

ディスカッション

CRISPR技術の最も有用な非編集アプリケーションの1つは、CRISPRaシステムを使用した内因性遺伝子の活性化による遺伝子機能の調査です6。SPHは強力なCRISPRaであり、いくつかの神経原性遺伝子を標的とすることによって星状細胞の活性ニューロンへの変換を誘導することが最初に記載されていました14。この研究では、AdipoSPHは、脂肪細胞における内因性Prdm16?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

著者らは、AdipoSPHマウスの作製、免疫代謝および細胞シグナル伝達研究所、および細胞生物学に適用されるフォトニクスに関する国立科学技術研究所(INFABIC)のすべての実験的支援に対して、Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório(Cemib)、Unicampから受けた支援に感謝する。サンパウロ研究財団(FAPESP)からの財政的支援に感謝します:2019 / 15025-5;2020/09308-1;2020/14725-0;2021/11841-2.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3',5-Triiodo-L-thyronineSigma-AldrichT2877
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI5879
AAVpro 293T Cell LineTakarabio632273
Amicon Ultra Centrifugal FilterMerckmilliporeUFC510008100 KDa
DexamethasoneSigma-AldrichD1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplementGibco10565-018high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Sigma-AldrichD8662
Excelta Self-Opening Micro ScissorsFisher Scientific17-467-496
Fetal bovine serumSigma-AldrichF2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)Fisher Scientific08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/ForcepsFisher Scientific12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting ScissorsFisher Scientific08-940
GlycerolSigma-AldrichG5516
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene)Sigma-AldrichH9268
IndomethacinSigma-AldrichI7378
InsulinSigma-AldrichI9278
LigaFast Rapid DNA Ligation SystemPromegaM8225
Maxiprep purification kit Qiagen12162
Microliter syringeHamilton80308Model 701
NEB 10-beta/Stable New England BiolabsC3019HE. coli competent cells
pAAV2/8 Addgene 112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherryAddgene 91947
pAdDeltaF6 Addgene 112867
PEG 8000Sigma-Aldrich89510
Penicillin/streptomycinGibco15140-122
PolyethylenimineSigma-Aldrich23966Linear, MW 25000
Povidone-iodineRioquímica510101303Antiseptic
RosiglitazoneSigma-AldrichR2408
SacI enzymeNew England BiolabsR0156
Surgical Design Premier Adson ForcepsFisher Scientific22-079-741
SyringeHamilton475-40417
T4 DNA LigasePromegaM180B
T4 DNA ligase buffer New England BiolabsB0202S
T4 PNK enzyme kitNew England BiolabsM0201S
Tramadol HydrochlorideSEM43930
Vidisic Gel Bausch + Lomb 99620

参考文献

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