Исследование биологии и метаболизма бежевого жира с использованием системы активации CRISPR SunTag-p65-HSF1

Резюме

В этом протоколе представлено использование CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) в адипоцитах (AdipoSPH) в качестве альтернативной стратегии аденоассоциированному вирусу (AAV) для исследования биологии бежевого жира. Инъекция in vivo несущей AAV сгРНК, нацеленной на эндогенный ген Prdm16, достаточна для того, чтобы индуцировать развитие бежевого жира и усилить программу термогенных генов.

Аннотация

Технология кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) вызвала революцию в биологии, и последние инструменты были применены далеко за пределами первоначально описанного редактирования генов. Система активации CRISPR (CRISPRa) сочетает в себе каталитически неактивный белок Cas9 (dCas9) с различными модулями транскрипции, чтобы индуцировать экспрессию эндогенных генов. SunTag-p65-HSF1 (SPH) — это недавно разработанная технология CRISPRa, которая сочетает в себе компоненты синергетических медиаторов активации (SAM) с активаторами SunTag. Эта система обеспечивает сверхэкспрессию одного или нескольких генов путем разработки индивидуальной однонаправляющей РНК (сгРНК). В этом исследовании ранее разработанная мышь SPH была использована для создания условной мыши, экспрессирующей SPH в адипоцитах (линия адипонектина Cre), названной AdipoSPH. Чтобы индуцировать фенотип жира от белого до бежевого (потемнение), аденоассоциированный вирус (AAV), несущий sgРНК, нацеленный на эндогенный ген Prdm16 (хорошо известный фактор транскрипции, связанный с развитием коричневого и бежевого жира), вводили в паховую белую жировую ткань (iWAT). Эта мышиная модель индуцировала экспрессию эндогенного Prdm16 и активировала термогенную генную программу. Кроме того, in vitro SPH-индуцированная сверхэкспрессия Prdm16 увеличивала потребление кислорода бежевыми адипоцитами, фенокопируя результаты предыдущей модели трансгенной мыши Prdm16. Таким образом, этот протокол описывает универсальную, экономичную и эффективную по времени модель мыши для исследования биологии жировой ткани.

Введение

Бежевые (или бритовые) адипоциты представляют собой разъединяющие адипоциты, экспрессирующие белок 1 (UCP1), и богатые митохондриями адипоциты, которые находятся в депо белой жировой ткани (WAT). Бежевый жир появляется из подмножества предшественников адипоцитов или зрелых белых адипоцитов в ответ на воздействие холода и других раздражителей ^1,2. Бежевые адипоциты могут преобразовывать энергию в тепло UCP1-зависимым или независимым образом³. Независимо от своей термогенной функции, бежевый жир также может улучшить метаболическое здоровье другими средствами, такими как секреция адипокинов и противовоспалительная и антифиброзная активность. Исследования на мышах и людях показали, что индукция бежевого жира улучшает гомеостаз глюкозы и липидов всего тела³. Однако, несмотря на то, что наши знания о биологии бежевого жира быстро развивались в последние годы, большинство его метаболических преимуществ и связанных с ними механизмов до сих пор до конца не изучены.

Кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) были впервые описаны в эукариотических клетках как инструмент, способный генерировать двухцепочечный разрыв (DSB) на определенном участке генома за счет нуклеазной активности белка Cas9 ^4,5. Cas9 управляется синтетической однонаправляющей РНК (sgRNA) для нацеливания на определенную область генома, что приводит к ДНК DSB. В дополнение к использованию нуклеазы Cas9 для целей редактирования, технология CRISPR-Cas9 эволюционировала, чтобы использоваться в качестве инструмента регуляции генов, специфичного для последовательности⁶. Разработка каталитически неактивного белка Cas9 (dCas9) и ассоциация транскрипционных модулей, способных усиливать экспрессию генов, привели к появлению инструментов активации CRISPR (CRISPRa). Появилось несколько систем CRISPRa, таких как VP64^7,8, синергетический медиатор активации (SAM)⁹, SunTag^10,11, VPR^12,13 и SunTag-p65-HSF1 (SPH)^14, который сочетает в себе компоненты активаторов SAM и SunTag. Недавно было продемонстрировано, что индуцированная экспрессия нейрогенных генов в нейробластах N2a и первичных астроцитах выше при использовании SPH по сравнению с другими системами CRISPRa¹⁴, что демонстрирует SPH как перспективный инструмент CRISPRa.

Здесь мы воспользовались ранее разработанной мышью SPH¹⁴ для создания условной мышиной модели, экспрессирующей SPH специфически в адипоцитах с использованием линии адипонектина Cre (AdipoSPH). С помощью аденоассоциированного вируса (AAV), несущего гРНК, нацеленную на эндогенный ген Prdm16, было индуцировано потемнение (превращение белого в бежевое) пахового WAT (iWAT) для увеличения экспрессии программы термогенных генов. Кроме того, in vitro сверхэкспрессия Prdm16 усиливает потребление кислорода. Таким образом, этот протокол предоставляет универсальную модель SPH мыши для изучения механизмов развития бежевого жира в жировой ткани.

протокол

Исследования на животных проводились в соответствии с Руководством Университета Кампинаса по уходу и использованию лабораторных животных (протокол CEUA #5810-1/2021).

1. Молекулярное клонирование

1. Проектирование однонаправляющих РНК (сгРНК)
   1. Разрабатывайте сгРНК для активации CRISPR с помощью CHOPCHOP, доступного по адресу https://chopchop.cbu.uib.no/, или любого другого подходящего инструмента. Используйте следующие параметры для разработки sgRNA, нацеленной на ген Prdm16: Цель: Prdm16; В: Mus musculus; Использование: Crispr/Cas9; Для: Активация.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разработка сгРНК для каждого интересующего региона распространяется на область начального сайта транскрипции (TSS) с частотой 200.н. Например, сгРНК, нацеленная на Prdm16, используемая в этом исследовании, связывается на 154.н. выше по течению от TSS.
   2. Добавьте выступы к sgRNA, чтобы они соответствовали сайту рестрикции SacI в векторной цепи pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (см. Таблицу материалов). Включают: 5'- (N20)AGCT-3' (N = нуклеотиды). Например, последовательность, нацеленная на ген Prdm16, представляет собой 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAAGGG-3', а с выступами - 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
   3. Получите последовательность обратного комплемента 3'-сгРНК с помощью инструмента, доступного по адресу https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. Например, последовательность 3'sgRNA, нацеленная на ген Prdm16, представляет собой 3'-TCGAGCTCGACGGACTTTTTCCCC-5'.
2. Отжиг одноцепочечных комплементарных олигонуклеотидов
   1. Добавьте по 1 мкл каждого 5' и 3' одноцепочечного олигонуклеотида (исходная концентрация: 100 мкМ), 1 мкл буфера Т4-лигазы, 0,5 мкл Т4-полинуклеотидкиназы (PNK) (1 × 10,4 ЕД/мл) и 6,5 мкл H₂O к конечному реакционному объему 10 мкл. Отжигают комплементарные одноцепочечные олигонуклеотиды с помощью термоциклера при следующих условиях: 37 °C в течение 30 мин и 95 °C в течение 5 мин с последующим снижением скорости 5 °C/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент PNK поставляется с буфером PNK и не содержит достаточного количества АТФ, необходимого для реакции фосфорилирования (см. Таблицу материалов). Для упрощения реакции используют буфер Т4-лигазы (вместо PNK-буфера). Буфер Т4-лигазы обеспечивает соответствующее количество (1 мМ АТФ) фосфата для реакции фосфорилирования. Фермент PNK обеспечивает 5'-концевое фосфорилирование олигонуклеотидов для последующей реакции лигирования.
3. Лигирование отожженных олигонуклеотидов сгРНК
   1. Добавьте 25 нг плазмиды pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry к 2 мкл отожженных олигонуклеотидов сгРНК, 1 мкл фермента SacI, 2 мкл 10-кратного буфера ДНК-лигазы Т4, 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (1-3 ед/мкл) (см. Таблицу материалов) и H₂O к конечному реакционному объему 10 мкл.
   2. Лигирование проводят путем инкубации реакционной смеси с помощью термоциклера при следующих условиях: 15 циклов при 37 °C в течение 5 мин и 25 °C в течение 5 мин с последующей выдержкой при 4 °C.
4. Трансформация с последующей колониальной полимеразной цепной реакцией (ПЦР)
   1. Трансформируют компетентные клетки E. coli DH10B (см. Таблицу материалов) 4 мкл продукта лигирования с помощью теплового шока (42 ° C в течение 45 с) и распределяют по агаровой пластине, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.
   2. Подтвердите трансформированные колонии с помощью колонной ПЦР с использованием мастер-микса ПЦР (см. Таблицу материалов). Соберите колонию и смешайте с 5 мкл основной смеси, 0,1 мкл универсального праймера (исходная концентрация: 100 мкМ), 0,1 мкл обратного праймера сгРНК (исходная концентрация: 100 мкМ) (таблица 1) и 5 мкл H 2 O. Запустите ПЦР с помощью термоциклера при следующих условиях: начальная денатурация (94 °C в течение₂мин), затем следуют 35 циклов денатурации (94 °C в течение 20 с), отжига (60 °C в течение 30 с), удлинения (72 °C в течение 30 с) и заключительного этапа удлинения (72 °C в течение 5 мин). Рассасывают ДНК с помощью электрофореза в агарозном (1,5%) геле в 0,5-кратном буфере TAE при 90 В в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные клоны дают диапазон ~ 280 п.н.
   3. Отправьте положительные образцы для секвенирования по Сэнгеру с использованием универсального праймера (таблица 1, дополнительный файл 1).
5. Плазмидная очистка
   1. Очистите плазмиду от положительного клона с помощью набора для очистки плазмид (см. Таблицу материалов), следуя инструкциям производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите плазмиду с помощью анионообменной смолы или другого набора, подходящего для использования при трансфекции клеток.
   2. Инкубируют положительный клон (12 ч при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин) с использованием стандартной среды для роста бактерий, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.
   3. Центрифугируют бактериальные клетки при 6000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Выполните следующие действия в соответствии с инструкциями производителя.

2. Упаковка AAV

ПРИМЕЧАНИЕ: Упаковка AAV была выполнена в соответствии с предыдущими публикациями^15,16 с незначительными изменениями.

1. Планшет 293T клеток (см. Таблицу материалов) в колбе размером 175 см² (посев 5 × 10⁶ клеток в колбу) с использованием 25 мл модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S). Инкубируйте при 37 ° C, 5% CO₂ и влажности 95% до тех пор, пока клетки не достигнут слияния 50% -70%.
2. Смешайте 14 мкл полиэтиленимина (1 мкг/мкл) с 1 мл 150 мМ NaCl. Смешайте три плазмиды, необходимые для производства AAV, в молярном соотношении 1:1:1 (т.е. 17,7 мкг pAdDeltaF6, 7,9 мкг AAV2/8 (см. Таблицу материалов) и 5,9 мкг клонированной сгРНК с шага 1 в 1 мл 150 мМ NaCl. Смесь полиэтиленимина:NaCl переносят по каплям в пробирку, содержащую ДНК (смесь плазмид), и инкубируют в течение 20 мин при 25 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: pAdDeltaF6 представляет собой вспомогательную плазмиду, а pCapsid pAAV2/8 представляет собой упаковочную плазмиду, экспрессирующую гены репликации (Rep) и капсида (cap). Обе плазмиды необходимы для производства AAV.
3. Перед трансфекцией замените питательную среду для клеток 18 мл DMEM, содержащего 1% FBS и L-аланил-L-глутамина (0,5 г/л). Добавьте 2 мл смеси полиэтиленимина: ДНК в каждую колбу для культуры и инкубируйте клетки в инкубаторе CO 2 (37 ° C, 5% CO₂, влажность 95%).
4. Через 5 часов добавьте 5 мл DMEM с добавлением 10% FBS и L-аланил-L-глютамина (0,5 г / л).
5. После 3 дней инкубации отделите клетки от колбы культуры с помощью клеточного скребка. Соберите клетки 293T из 10 (175 см²) колб для клеточных культур в конические пробирки объемом 50 мл и добавьте DMEM (см. Таблицу материалов) до 30 мл.
6. Добавьте 3 мл хлороформа в каждую коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую клетки 293T, и перемешайте с помощью вихревого смесителя на высокой скорости в течение 5 минут. Ресуспендируйте клетки, добавив 7,6 мл 5 М NaCl и кратковременно вихните. Центрифуга при 3 000 × г и 4 °C в течение 5 мин.
7. Перенесите водную фазу в новую коническую пробирку и добавьте 9,4 мл 50% (об./об.) полиэтиленгликоля (ПЭГ) 8000. Перемешайте вихревым миксером на высокой скорости в течение 10 с и положите образцы на лед на 1 час.
8. Центрифуга при 3 000 × г при 4 °C в течение 30 мин. Удалите надосадочную жидкость и дайте гранулам высохнуть в течение 10 минут.
9. Добавьте 1,4 мл HEPES (50 мМ, pH 8) и перемешивайте в течение 5 минут с помощью вихревого смесителя на высокой скорости. Добавьте 3,5 мкл 1 М MgCl2, 14 мкл ДНКазы I (20 единиц/мкл) и_1,4 мкл РНКазы А (10 мкг/мкл). Инкубировать на водяной бане с температурой 37 °C в течение 20 мин, а затем переложить образцы в новые пробирки объемом 1,5 мл (700 мкл в каждой пробирке).
10. Добавьте 700 мкл хлороформа в каждую пробирку объемом 1,5 мл и перемешайте с помощью вихревого смесителя на высокой скорости в течение 10 с. Центрифугу при 3 000 × г при 4 °C в течение 5 мин и перенесите водную фазу в новую пробирку. Повторите этот шаг 3 раза.
11. Выпарить хлороформ в течение 30 мин в шкафу биобезопасности. Затем перенесите 300 мкл водной фазы в ультрацентрифугирующую пробирку объемом 0,5 мл (см. Таблицу материалов). Отжимайте фильтр при 14 000 × г при 25 °C в течение 5 мин. Снимите проточную часть и снова вращайте фильтр, пока весь объем не пройдет через фильтр.
12. Промойте фильтр, добавив 300 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS), и перемешайте растворы пипеткой. Центрифуга фильтра в течение 5 мин при 14 000 × г при 25 °C. Повторите этот шаг стирки 4 раза.
13. Центрифугируйте фильтр в течение 8 мин при 14 000 × г при 25 °C. Поместите фильтр вверх дном в новую трубку и вращайте в течение 2 минут при 1,000 × г при 25 ° C.

3. Титрование AAV методом кПЦР

1. Подготовьте стандартную кривую для титрования AAV и определите титр AAV в соответствии с оригинальным исследованием Fripont et ^al.15.

4. Инъекция AAV in vivo в паховую белую жировую ткань (iWAT)

1. Разделите хирургические инструменты и расходные материалы, необходимые для операции, и стерилизуйте их в соответствии с рекомендациями для каждого конкретного материала.
2. Обезболивают мышей 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина путем внутрибрюшинной инъекции. Подтвердите анестезию, сильно надавливая на лапу и хвост и проверяя рефлекс. Нанесите мазь на глаза мыши, чтобы избежать сухости глаз во время операции.
3. Поместите анестезированную мышь в положение лежа на спине и побрейте бритвой небольшой участок по бокам, проксимальнее тазобедренных суставов для инъекций iWAT. Нанесите крем для депиляции на 5 минут. Удалите остатки крема водой, чтобы избежать ожога кожи.
4. Продезинфицируйте кожу, используя три чередующихся раунда нанесения антисептического раствора (повидон-йод) на кожу чистой марлей и 70% спиртом. Выбрасывайте марлю после каждого использования.
5. Выполните окончательное нанесение антисептического раствора на кожу. Затем сделайте надрез 1-2 см стерилизованными ножницами в проксимальной области суставов и держите кожу открытой с помощью щипцов, чтобы обнажить жировое депо. WAT можно найти прикрепленным к коже с обеих сторон, простираясь от начала на спине и вниз к яичку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте простыни, чтобы избежать загрязнения во время операции или наложения швов.
6. Используя щипцы, через разрез осторожно потяните жировое депо вверх, чтобы убедиться, что инъекция находится в правильном месте и на правильной глубине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не удалить ткань с ее первоначального места.
7. Наполните микролитровый шприц (калибр: 33; тип точки: 4; угол: 12; длина: 10) (см. Таблицу материалов) 2,5 мкл (5,6 × 10¹⁰ вирусных геномов [VG] / мкл) AAV (содержащий sgRNA, нацеленную на эндогенный ген Prdm16). Осторожно вставьте иглу под углом 30°-45° в iWAT. Повторите инъекцию 5 раз в разные места ткани, чтобы гомогенно инфицировать всю жировую подушку iWAT. Для заражения iWAT рекомендуется общий объем 15 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина введения шприца зависит от толщины отложения жировой прокладки. Используйте технику без касания, чтобы сделать инъекцию.
8. Закройте разрез бритой кожи с помощью монофиламентных швов 4/0. Положите мышь на грелку до тех пор, пока сознание не восстановится. Наблюдайте за животным каждые 10-15 минут, пока оно полностью не выздоровеет. После того, как животное приходит в сознание, наблюдайте за профилированием опорно-двигательного аппарата, которое должно быть линейным и не иметь признаков дистресса или боли.
9. Выполните послеоперационный контроль боли в течение 48 часов после операции, вводя трамадола гидрохлорид (5 мг / кг) внутрибрюшинно в течение 3 дней (2 раза в день).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за признаками стресса и дискомфорта и контролируйте потребление воды и пищи. Дайте эффективную дозу анальгетика упреждающим образом, предпочтительно до или в начале операции.
10. Держите мышь в клетке со свободным доступом к пище и воде в период заживления. После периода заживления приступайте к эвтаназии мыши. В этом исследовании эвтаназия проводилась путем передозировки инъекционных анестетиков (внутрибрюшинных) от 3-кратной индуцирующей дозы (300-360 мг / кг гидрохлорида кетамина + 30-40 мг / кг гидрохлорида ксилазина) с последующим обезглавливанием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется содержать животных в отдельных клетках до полного восстановления после анестезии.

5. Дифференцировка стромальных сосудистых клеток (SVF) в бежевые адипоциты in vitro

1. Выполните выделение и покрытие первичных SVF из iWAT мышей AdipoSPH в соответствии с Aune et ^al.17. Семенные SVF, полученные от мышей AdipoSPH iWAT, в 6-луночную пластину, содержащую полную среду (DMEM, содержащую 3,1 г / л глюкозы, 0,5 г / л L-аланил-L-глутамина, 10% FBS и 2,5% P / S) в течение 1-2 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фракция SVF содержит смесь различных типов клеток. На этом этапе невозможно определить количество засеянных клеток-предшественников, дающих начало адипоцитам.
2. Аспирируйте среду, промойте лунку 2 раза физиологическим раствором с фосфатным буфером (1x PBS) и замените свежей полной средой. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO₂, влажности 95% до тех пор, пока клетки не достигнут слияния 70-80%.
3. Индуцируют дифференцировку (день 0), обрабатывая клетки индукционной средой (таблица 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лекарственный коктейль индукционной среды необходим для усиления дифференцировки бежевых адипоцитов и для экспрессии термогенной генной программы¹⁷.
4. Через 2 дня (2-й день) замените индукционную среду поддерживающей средой (таблица 2).
5. Через 2 дня (день 4) замените поддерживающую среду свежей поддерживающей средой (таблица 2) на 2–3 дня.
6. Меняйте поддерживающую среду каждые 48 ч до тех пор, пока преадипоциты не будут полностью дифференцированы в адипоциты (обычно через 6 дней после добавления индукционной среды). Зрелые адипоциты можно наблюдать с помощью световой микроскопии, так как дифференцированные клетки, по-видимому, загружены липидными каплями.

6. Инфекция ААВ in vitro SVF

ПРИМЕЧАНИЕ: SVF, полученные от мышей AdipoSPH iWAT, были инфицированы SAV-несущей sgRNA-Prdm16, как ранее описано Wang et ^al.18 , с некоторыми модификациями.

1. Выращивайте клетки на 6-луночной культуральной пластине с полной средой до тех пор, пока клетки не достигнут слияния 70%-80%, как описано ранее в шагах 5.1-5.3.
2. Смешайте 5,6 ×¹⁰ ВГ/мкл ААВ-несущей сгРНК-Prdm16 с 2 мл полной среды и гексадиметрина бромида (8 мкг/мл) (см. Таблицу материалов). Трансдуцируют клетки, заменяя полную среду и добавляя полную среду, содержащую AAV. Инкубируйте трансдуцированные клетки в течение 12 часов при 37 ° C, влажности 95% и 5% CO_2.
3. Расщепляют и засевают клетки, как описано на шаге 5, для пролиферации и дифференцировки клеток в бежевые адипоциты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа потребления кислорода затравка 4.0 × 10⁴ клетки (с шага 6.2) на лунку с индукционной средой в 24-луночной чашке для культивирования клеток. Последующие стадии клеточной пролиферации и дифференцировки выполняют, как описано на шаге 5. Анализ потребления кислорода проводится, когда клетки достигают слияния 80-100% и полностью дифференцированы, как сообщалось ранее¹⁹.

Результаты

Мыши AdipoSPH были выведены путем разведения штаммов мышей SPH и Adipoq-Cre. Оба штамма мышей находились на гибридном фоне C57BL6J-DBA/2J (по данным коммерческого поставщика; см. Таблицу материалов). Линия мышей SPH была первоначально описана Zhou et ^al.14.

Развитие

Обсуждение

Одним из наиболее полезных нередактируемых применений технологии CRISPR является опрос функции генов путем активации эндогенных генов с использованием систем CRISPRa⁶. SPH — это мощный CRISPRa, который первоначально был описан как индуцирующий превращение астроцитов в активные ней...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma-Aldrich	T2877
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879
AAVpro 293T Cell Line	Takarabio	632273
Amicon Ultra Centrifugal Filter	Merckmillipore	UFC510008	100 KDa
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Corning	10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement	Gibco	10565-018	high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Excelta Self-Opening Micro Scissors	Fisher Scientific	17-467-496
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)	Fisher Scientific	08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-940
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278
LigaFast Rapid DNA Ligation System	Promega	M8225
Maxiprep purification kit	Qiagen	12162
Microliter syringe	Hamilton	80308	Model 701
NEB 10-beta/Stable	New England Biolabs	C3019H	E. coli competent cells
pAAV2/8	Addgene	112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry	Addgene	91947
pAdDeltaF6	Addgene	112867
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Polyethylenimine	Sigma-Aldrich	23966	Linear, MW 25000
Povidone-iodine	Rioquímica	510101303	Antiseptic
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
SacI enzyme	New England Biolabs	R0156
Surgical Design Premier Adson Forceps	Fisher Scientific	22-079-741
Syringe	Hamilton	475-40417
T4 DNA Ligase	Promega	M180B
T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
T4 PNK enzyme kit	New England Biolabs	M0201S
Tramadol Hydrochloride	SEM	43930
Vidisic Gel	Bausch + Lomb	99620