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Method Article
Este protocolo apresenta o uso do CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) em adipócitos (AdipoSPH) como uma estratégia alternativa ao vírus adenoassociado (AAV) para investigar a biologia da gordura bege. A injeção in vivo de sgRNA carreador de AAV visando o gene endógeno Prdm16 é suficiente para induzir o desenvolvimento de gordura bege e melhorar o programa do gene termogênico.
A tecnologia de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) provocou uma revolução na biologia, e ferramentas recentes foram aplicadas muito além da edição genética originalmente descrita. O sistema de ativação CRISPR (CRISPRa) combina a proteína Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) com módulos de transcrição distintos para induzir a expressão gênica endógena. SunTag-p65-HSF1 (SPH) é uma tecnologia CRISPRa recentemente desenvolvida que combina componentes de mediadores de ativação sinérgica (SAMs) com os ativadores SunTag. Este sistema permite a superexpressão de genes únicos ou múltiplos através do desenho de um RNA guia único personalizado (sgRNA). Neste estudo, um camundongo com HPS previamente desenvolvido foi usado para gerar um camundongo condicional expressando HPS em adipócitos (linhagem Cre de adiponectina), denominado AdipoSPH. Para induzir um fenótipo de gordura branca a bege (escurecimento), um vírus adenoassociado (AAV) carregando sgRNA visando o gene endógeno Prdm16 (um fator de transcrição bem estabelecido relacionado ao desenvolvimento de gordura marrom e bege) foi injetado no tecido adiposo branco inguinal (iWAT). Este modelo de camundongo induziu a expressão de Prdm16 endógeno e ativou o programa de genes termogênicos. Além disso, a superexpressão in vitro de Prdm16 induzida por SPH aumentou o consumo de oxigênio dos adipócitos bege, fenocopiando os resultados de um modelo anterior de camundongos transgênicos Prdm16. Assim, este protocolo descreve um modelo versátil, custo-efetivo e tempo-efetivo em camundongos para investigar a biologia do tecido adiposo.
Os adipócitos beges (ou britos) são adipócitos que expressam a proteína 1 desacopladora (UCP1) e ricos em mitocôndrias que residem dentro dos depósitos de tecido adiposo branco (TAB). A gordura bege emerge de um subgrupo de progenitores de adipócitos ou adipócitos brancos maduros em resposta à exposição ao frio e a outros estímulos 1,2. Os adipócitos beges podem converter energia em calor de forma dependente ou independente de UCP13. Independentemente de sua função termogênica, a gordura bege também pode melhorar a saúde metabólica por outros meios, como a secreção de adipocinas e atividades anti-inflamatórias e antifibróticas. Estudos em camundongos e humanos têm demonstrado que a indução de gordura bege melhora a glicemia corporal total e a homeostase lipídica3. No entanto, embora nosso conhecimento da biologia da gordura bege tenha evoluído rapidamente nos últimos anos, a maioria de seus benefícios metabólicos e mecanismos relacionados ainda não são totalmente compreendidos.
Repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) foram descritas pela primeira vez em células eucarióticas como uma ferramenta capaz de gerar uma quebra de fita dupla (DSB) em um local específico do genoma através da atividade nuclease da proteína Cas9 4,5. Cas9 é guiado por um RNA guia único sintético (sgRNA) para atingir uma região genômica específica, levando a um DSB de DNA. Além de usar a nuclease Cas9 para fins de edição, a tecnologia CRISPR-Cas9 evoluiu para ser usada como uma ferramenta de regulação gênica específica de sequência6. O desenvolvimento de uma proteína Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) e a associação de módulos transcricionais capazes de aumentar a expressão gênica deram origem a ferramentas de ativação de CRISPR (CRISPRa). Vários sistemas CRISPRa têm surgido, como VP647,8, mediador de ativação sinérgica (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 e SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, que combina os componentes dos ativadores SAM e SunTag. Recentemente, foi demonstrado que a expressão induzida de genes neurogênicos em neuroblastos N2a e astrócitos primários é maior usando HPS em comparação com outros sistemas CRISPRa14, demonstrando a HPS como uma ferramenta CRISPRa promissora.
Aqui, aproveitamos um camundongo SPH14 previamente desenvolvido para gerar um modelo condicional de camundongo expressando HPS especificamente em adipócitos usando a linhagem de adiponectina Cre (AdipoSPH). Usando um vírus adenoassociado (AAV) carregando o gRNA visando o gene endógeno Prdm16, o escurecimento (conversão branca para bege) do WAT inguinal (iWAT) foi induzido para aumentar a expressão do programa de genes termogênicos. Além disso, a superexpressão in vitro de Prdm16 aumentou o consumo de oxigênio. Portanto, este protocolo fornece um modelo versátil de camundongos com HPS para explorar os mecanismos de desenvolvimento de gordura bege no tecido adiposo.
Os estudos em animais foram realizados de acordo com o Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório da Universidade Estadual de Campinas (protocolo CEUA #5810-1/2021).
1. Clonagem molecular
2. Embalagem AAV
OBS: O acondicionamento do AAV foi realizado de acordo com publicações anteriores15,16 com pequenas modificações.
3. Titulação do AAV por qPCR
4. Injeção in vivo de AAV no tecido adiposo branco inguinal (TABi)
5. Diferenciação in vitro de células vasculares estromais (SVFs) em adipócitos beges
6. Infecção in vitro por AAV de SVFs
NOTA: SVFs derivadas de camundongos AdipoSPH iWAT foram infectadas com sgRNA-Prdm16 portadores de AAV, conforme descrito anteriormente por Wang et al.18 com algumas modificações.
Camundongos AdipoSPH foram desenvolvidos a partir da criação de linhagens de camundongos SPH e Adipoq-Cre. Ambas as linhagens de camundongos estavam em um fundo híbrido C57BL6J-DBA/2J (de acordo com o fornecedor comercial; ver Tabela de Materiais). A linhagem de camundongos SPH foi originalmente descrita por Zhou et al.14.
Desenvolvimento de adipócitos bege in vivo através da superexpressão de Prdm16 mediada por A...
Uma das aplicações mais úteis de não-edição da tecnologia CRISPR é a interrogação da função gênica através da ativação de genes endógenos utilizando sistemas CRISPRa6. A HPS é uma poderosa CRISPRa que foi originalmente descrita para induzir a conversão de astrócitos em neurônios ativos, tendo como alvo vários genes neurogênicos14. Neste estudo, o AdipoSPH demonstrou ser uma ferramenta adequada para investigar a biologia da gordura bege ativando a expre...
Os autores não têm nada a revelar.
Os autores agradecem o apoio recebido do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, para a geração de camundongos AdipoSPH, do Laboratório de Inmmunometabolismo e Sinalização Celular e do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fotônica Aplicada à Biologia Celular (INFABIC) por todo o suporte experimental. Agradecemos o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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