Untersuchung der Biologie und des Stoffwechsels von beigefarbenem Fett mit dem CRISPR SunTag-p65-HSF1 Aktivierungssystem

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die Verwendung von CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) in Adipozyten (AdipoSPH) als alternative Strategie zum Adeno-assoziierten Virus (AAV) zur Untersuchung der Biologie von beigem Fett dar. Die In-vivo-Injektion von AAV-tragender sgRNA, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt, reicht aus, um die Entwicklung von beigem Fett zu induzieren und das thermogene Genprogramm zu verbessern.

Zusammenfassung

Die CRISPR-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) hat eine Revolution in der Biologie ausgelöst, und neuere Werkzeuge wurden weit über die ursprünglich beschriebene Genom-Editierung hinaus eingesetzt. Das CRISPR-Aktivierungssystem (CRISPRa) kombiniert das katalytisch inaktive Cas9 (dCas9)-Protein mit verschiedenen Transkriptionsmodulen, um eine endogene Genexpression zu induzieren. SunTag-p65-HSF1 (SPH) ist eine neu entwickelte CRISPRa-Technologie, die Komponenten von synergistischen Aktivierungsmediatoren (SAMs) mit den SunTag-Aktivatoren kombiniert. Dieses System ermöglicht die Überexpression einzelner oder mehrerer Gene durch das Design einer maßgeschneiderten Single-Guide-RNA (sgRNA). In dieser Studie wurde eine zuvor entwickelte SPH-Maus verwendet, um eine bedingte Maus zu erzeugen, die SPH in Adipozyten exprimiert (Adiponektin-Cre-Linie), genannt AdipoSPH. Um einen Phänotyp von weißem bis beigem Fett (Bräunung) zu induzieren, wurde ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV), das sgRNA trägt, das auf das endogene Prdm16-Gen (ein gut etablierter Transkriptionsfaktor, der mit der Entwicklung von braunem und beigem Fett in Verbindung steht) abzielt, in das weiße Leistenfettgewebe (iWAT) injiziert. Dieses Mausmodell induzierte die Expression von endogenem Prdm16 und aktivierte das thermogene Genprogramm. Darüber hinaus erhöhte die in vitro SPH-induzierte Prdm16-Überexpression den Sauerstoffverbrauch von beigen Adipozyten und phänokopierte damit die Ergebnisse eines früheren transgenen Prdm16-Mausmodells. Somit beschreibt dieses Protokoll ein vielseitiges, kostengünstiges und zeiteffektives Mausmodell zur Untersuchung der Fettgewebebiologie.

Einleitung

Beige (oder Brite) Adipozyten sind entkoppelnde Protein 1 (UCP1)-exprimierende und mitochondriale Adipozyten, die sich in Depots für weißes Fettgewebe (WAT) befinden. Beigefett entsteht aus einer Untergruppe von Adipozyten-Vorläuferzellen oder reifen weißen Adipozyten als Reaktion auf Kälteeinwirkung und andere Reize ^1,2. Beige Adipozyten können UCP1-abhängig oder unabhängig Energie in Wärme umwandeln³. Unabhängig von seiner thermogenen Funktion kann beigefarbenes Fett auch auf andere Weise die Stoffwechselgesundheit verbessern, z. B. durch die Sekretion von Adipokinen und entzündungshe....

Protokoll

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden der Universität Campinas für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Protokoll CEUA #5810-1/2021) durchgeführt.

1. Molekulare Klonierung

1. Design von Single-Guide-RNAs (sgRNAs)
   1. Entwerfen Sie sgRNAs für die CRISPR-Aktivierung mit CHOPCHOP, das bei https://chopchop.cbu.uib.no/ erhältlich ist, oder einem anderen geeigneten Werkzeug. Verwenden Sie die folgenden Parameter, um sgRNA zu entwerfen, die auf das Prdm16-Gen abzielt: Ziel: Prdm16; In: Mus musculus; Verwendung: Crispr/Cas9; Für: Aktivierung.
      HINWEIS: Entwerfen Sie sgRNAs für jede Region....

Ergebnisse

AdipoSPH-Mäuse wurden durch die Züchtung von SPH- und Adipoq-Cre-Mausstämmen entwickelt. Beide Mausstämme befanden sich in einem hybriden C57BL6J-DBA/2J-Hintergrund (nach Angaben des kommerziellen Anbieters; siehe Materialtabelle). Die SPH-Mauslinie wurde ursprünglich von Zhou et ^al.14 beschrieben.

In vivo beige Adipozytenentwicklung durch AdipoSPH-vermittelte Prdm16-Überexpression
Um die Fähigkeit de.......

Diskussion

Eine der nützlichsten Nicht-Editing-Anwendungen der CRISPR-Technologie ist die Abfrage der Genfunktion durch die Aktivierung endogener Gene mit Hilfe von CRISPRa-Systemen⁶. SPH ist ein starkes CRISPRa, von dem ursprünglich beschrieben wurde, dass es die Umwandlung von Astrozyten in aktive Neuronen induziert, indem es auf mehrere neurogene Gene abzielt¹⁴. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass AdipoSPH ein geeignetes Werkzeug zur Untersuchung der Biologie von beigem .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma-Aldrich	T2877
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879
AAVpro 293T Cell Line	Takarabio	632273
Amicon Ultra Centrifugal Filter	Merckmillipore	UFC510008	100 KDa
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Corning	10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement	Gibco	10565-018	high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Excelta Self-Opening Micro Scissors	Fisher Scientific	17-467-496
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)	Fisher Scientific	08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-940
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278
LigaFast Rapid DNA Ligation System	Promega	M8225
Maxiprep purification kit	Qiagen	12162
Microliter syringe	Hamilton	80308	Model 701
NEB 10-beta/Stable	New England Biolabs	C3019H	E. coli competent cells
pAAV2/8	Addgene	112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry	Addgene	91947
pAdDeltaF6	Addgene	112867
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Polyethylenimine	Sigma-Aldrich	23966	Linear, MW 25000
Povidone-iodine	Rioquímica	510101303	Antiseptic
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
SacI enzyme	New England Biolabs	R0156
Surgical Design Premier Adson Forceps	Fisher Scientific	22-079-741
Syringe	Hamilton	475-40417
T4 DNA Ligase	Promega	M180B
T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
T4 PNK enzyme kit	New England Biolabs	M0201S
Tramadol Hydrochloride	SEM	43930
Vidisic Gel	Bausch + Lomb	99620