Untersuchung der Biologie und des Stoffwechsels von beigefarbenem Fett mit dem CRISPR SunTag-p65-HSF1 Aktivierungssystem

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die Verwendung von CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) in Adipozyten (AdipoSPH) als alternative Strategie zum Adeno-assoziierten Virus (AAV) zur Untersuchung der Biologie von beigem Fett dar. Die In-vivo-Injektion von AAV-tragender sgRNA, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt, reicht aus, um die Entwicklung von beigem Fett zu induzieren und das thermogene Genprogramm zu verbessern.

Zusammenfassung

Die CRISPR-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) hat eine Revolution in der Biologie ausgelöst, und neuere Werkzeuge wurden weit über die ursprünglich beschriebene Genom-Editierung hinaus eingesetzt. Das CRISPR-Aktivierungssystem (CRISPRa) kombiniert das katalytisch inaktive Cas9 (dCas9)-Protein mit verschiedenen Transkriptionsmodulen, um eine endogene Genexpression zu induzieren. SunTag-p65-HSF1 (SPH) ist eine neu entwickelte CRISPRa-Technologie, die Komponenten von synergistischen Aktivierungsmediatoren (SAMs) mit den SunTag-Aktivatoren kombiniert. Dieses System ermöglicht die Überexpression einzelner oder mehrerer Gene durch das Design einer maßgeschneiderten Single-Guide-RNA (sgRNA). In dieser Studie wurde eine zuvor entwickelte SPH-Maus verwendet, um eine bedingte Maus zu erzeugen, die SPH in Adipozyten exprimiert (Adiponektin-Cre-Linie), genannt AdipoSPH. Um einen Phänotyp von weißem bis beigem Fett (Bräunung) zu induzieren, wurde ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV), das sgRNA trägt, das auf das endogene Prdm16-Gen (ein gut etablierter Transkriptionsfaktor, der mit der Entwicklung von braunem und beigem Fett in Verbindung steht) abzielt, in das weiße Leistenfettgewebe (iWAT) injiziert. Dieses Mausmodell induzierte die Expression von endogenem Prdm16 und aktivierte das thermogene Genprogramm. Darüber hinaus erhöhte die in vitro SPH-induzierte Prdm16-Überexpression den Sauerstoffverbrauch von beigen Adipozyten und phänokopierte damit die Ergebnisse eines früheren transgenen Prdm16-Mausmodells. Somit beschreibt dieses Protokoll ein vielseitiges, kostengünstiges und zeiteffektives Mausmodell zur Untersuchung der Fettgewebebiologie.

Einleitung

Beige (oder Brite) Adipozyten sind entkoppelnde Protein 1 (UCP1)-exprimierende und mitochondriale Adipozyten, die sich in Depots für weißes Fettgewebe (WAT) befinden. Beigefett entsteht aus einer Untergruppe von Adipozyten-Vorläuferzellen oder reifen weißen Adipozyten als Reaktion auf Kälteeinwirkung und andere Reize ^1,2. Beige Adipozyten können UCP1-abhängig oder unabhängig Energie in Wärme umwandeln³. Unabhängig von seiner thermogenen Funktion kann beigefarbenes Fett auch auf andere Weise die Stoffwechselgesundheit verbessern, z. B. durch die Sekretion von Adipokinen und entzündungshemmende und antifibrotische Aktivitäten. Studien an Mäusen und Menschen haben gezeigt, dass die Induktion von beigem Fett die Glukose- und Lipidhomöostase des ganzen Körpers verbessert³. Obwohl sich unser Wissen über die Biologie von beigem Fett in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt hat, sind die meisten seiner metabolischen Vorteile und die damit verbundenen Mechanismen immer noch nicht vollständig verstanden.

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) wurden erstmals in eukaryotischen Zellen als ein Werkzeug beschrieben, das in der Lage ist, durch die Nukleaseaktivität des Cas9-Proteins einen Doppelstrangbruch (DSB) an einer bestimmten Stelle im Genom zu erzeugen ^4,5. Cas9 wird von einer synthetischen Single-Guide-RNA (sgRNA) gesteuert, um auf eine bestimmte genomische Region abzuzielen, was zu einem DNA-DSB führt. Neben der Verwendung der Nuklease Cas9 für die Editierung hat sich die CRISPR-Cas9-Technologie weiterentwickelt, um als sequenzspezifisches Genregulationswerkzeug eingesetzt zu werden⁶. Die Entwicklung eines katalytisch inaktiven Cas9-Proteins (dCas9) und die Assoziation von Transkriptionsmodulen, die in der Lage sind, die Genexpression zu verbessern, haben zu CRISPR-Aktivierungswerkzeugen (CRISPRa) geführt. Es sind mehrere CRISPRa-Systeme entstanden, wie z. B. VP64^7,8, synergistischer Aktivierungsmediator (SAM)⁹, SunTag^10,11, VPR^12,13 und SunTag-p65-HSF1 (SPH)^14, das die Komponenten von SAM- und SunTag-Aktivatoren kombiniert. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die induzierte Expression neurogener Gene in N2a-Neuroblasten und primären Astrozyten mit SPH im Vergleich zu anderen CRISPRa-Systemen höher ist¹⁴, was SPH als vielversprechendes CRISPRa-Werkzeug demonstriert.

In dieser Arbeit nutzten wir eine zuvor entwickelte SPH-Maus¹⁴ , um ein bedingtes Mausmodell zu generieren, das SPH spezifisch in Adipozyten exprimiert, indem wir die Adiponektin-Cre-Linie (AdipoSPH) verwenden. Mit Hilfe eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), das die gRNA trägt, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt, wurde die Bräunung (Umwandlung von weiß in beige) von inguinalem WAT (iWAT) induziert, um die Expression des thermogenen Genprogramms zu erhöhen. Darüber hinaus erhöhte die in vitro Überexpression von Prdm16 den Sauerstoffverbrauch. Daher stellt dieses Protokoll ein vielseitiges SPH-Mausmodell zur Verfügung, um die Mechanismen der beigen Fettentwicklung im Fettgewebe zu erforschen.

Protokoll

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden der Universität Campinas für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Protokoll CEUA #5810-1/2021) durchgeführt.

1. Molekulare Klonierung

1. Design von Single-Guide-RNAs (sgRNAs)
   1. Entwerfen Sie sgRNAs für die CRISPR-Aktivierung mit CHOPCHOP, das bei https://chopchop.cbu.uib.no/ erhältlich ist, oder einem anderen geeigneten Werkzeug. Verwenden Sie die folgenden Parameter, um sgRNA zu entwerfen, die auf das Prdm16-Gen abzielt: Ziel: Prdm16; In: Mus musculus; Verwendung: Crispr/Cas9; Für: Aktivierung.
      HINWEIS: Entwerfen Sie sgRNAs für jede Region von Interesse, die über eine 200 bp stromaufwärts gelegene TSS-Region (Transcription Start Site) verteilt ist. Zum Beispiel bindet die in dieser Studie verwendete sgRNA, die auf Prdm16 abzielt, 154 bp stromaufwärts von TSS.
   2. Fügen Sie der sgRNA Überhänge hinzu, die mit der SacI-Restriktionsstelle im Vektor-Rückgrat pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry übereinstimmen (siehe Materialtabelle). Dazu gehören: 5'- (N20)AGCT-3' (N = Nukleotide). Zum Beispiel ist die Sequenz, die auf das Prdm16-Gen abzielt, 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', und mit Überhängen ist 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
   3. Erhalten Sie die 3'-sgRNA-Reverse-Komplement-Sequenz mit dem unter https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html verfügbaren Werkzeug. Zum Beispiel ist die 3'-sgRNA-Sequenz, die auf das Prdm16-Gen abzielt, 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
2. Annealing von einzelsträngigen komplementären Oligonukleotiden
   1. Fügen Sie je 1 μl 5' und 3' einzelsträngiges Oligonukleotid (Stammkonzentration: 100 μM), 1 μl T4-Ligasepuffer, 0,5 μl T4-Polynukleotidkinase (PNK) (1 × 10⁴ Einheiten/ml) und 6,5 μl_H2Ozu einem endgültigen Reaktionsvolumen von 10 μl hinzu. Die komplementären einzelsträngigen Oligonukleotide werden unter folgenden Bedingungen mit einem Thermocycler geglüht: 37 °C für 30 min und 95 °C für 5 min, gefolgt von einer Ramp-Down-Rate von 5 °C/min.
      HINWEIS: Das PNK-Enzym wird mit PNK-Puffer versorgt und enthält nicht genügend ATP, das für die Phosphorylierungsreaktion benötigt wird (siehe Materialtabelle). Um die Reaktion zu vereinfachen, verwenden Sie den T4-Ligase-Puffer (anstelle des PNK-Puffers). T4-Ligasepuffer liefert die geeignete Menge (1 mM ATP) Phosphat für die Phosphorylierungsreaktion. Das PNK-Enzym sorgt für die 5'-Endphosphorylierung von Oligonukleotiden für die nachfolgende Ligationsreaktion.
3. Ligation von getemperten sgRNA-Oligonukleotiden
   1. Fügen Sie 25 ng Plasmid pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry zu 2 μl getemperten sgRNA-Oligonukleotiden, 1 μl SacI-Enzym, 2 μl 10x T4-DNA-Ligasepuffer, 1 μl T4-DNA-Ligase (1-3 u/μl) (siehe Materialtabelle) und_H2Ohinzu, um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 10 μl zu erhalten.
   2. Führen Sie die Ligation durch, indem Sie das Reaktionsgemisch mit einem Thermocycler unter den folgenden Bedingungen inkubieren: 15 Zyklen bei 37 °C für 5 min und 25 °C für 5 min, gefolgt von Warmhalten bei 4 °C.
4. Transformation mit anschließender Koloniepolymerase-Kettenreaktion (PCR)
   1. Die kompetenten E. coli DH10B-Zellen (siehe Materialtabelle) werden mittels Hitzeschock (42 °C für 45 s) mit 4 μL des Ligationsprodukts transformiert und auf einer Agarplatte mit 100 μg/ml Ampicillin verteilt.
   2. Bestätigen Sie transformierte Kolonien durch Kolonie-PCR unter Verwendung des PCR-Mastermixes (siehe Materialtabelle). Wählen Sie die Kolonie und mischen Sie sie mit 5 μl Mastermix, 0,1 μl Universalprimer (Stammkonzentration: 100 μM), 0,1 μl sgRNA-Reverse-Primer (Stammkonzentration: 100 μM) (Tabelle 1) und 5 μl_H2O. Führen Sie die PCR mit einem Thermocycler unter folgenden Bedingungen durch: anfängliche Denaturierung (94 °C für 2 min), gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung (94 °C für 20 s), des Glühens (60 °C für 30 s), des Ausdehnens (72 °C für 30 s) und eines abschließenden Dehnungsschritts (72 °C für 5 min). Lösen Sie die DNA mit Agarose (1,5%) Gelelektrophorese in 0,5x TAE-Puffer bei 90 V für 30 min.
      HINWEIS: Positive Klone ergeben eine Bandbreite von ~280 bp.
   3. Reichen Sie positive Proben für die Sanger-Sequenzierung mit dem Universalprimer ein (Tabelle 1, Supplemental File 1).
5. Plasmid-Aufreinigung
   1. Reinigen Sie das Plasmid von einem positiven Klon mit einem Plasmid-Aufreinigungskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      Anmerkungen: Reinigen Sie das Plasmid mit Anionenaustauscherharz oder einem anderen Kit, das für die Verwendung in der Zelltransfektion geeignet ist.
   2. Inkubieren Sie den positiven Klon (12 h bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min) unter Verwendung eines standardmäßigen bakteriellen Nährmediums, das 100 μg/ml Ampicillin enthält.
   3. Zentrifugieren Sie die Bakterienzellen bei 6.000 × g für 10 min bei 4 °C. Befolgen Sie die nächsten Schritte gemäß den Anweisungen des Herstellers.

2. AAV-Verpackungen

HINWEIS: Die AAV-Verpackung wurde gemäß früheren Veröffentlichungen^15,16 mit geringfügigen Änderungen durchgeführt.

1. Platte 293T-Zellen (siehe Materialtabelle) in einem 175-cm-2-Kolben (Aussaat 5 ×¹⁰ 6 Zellen pro Kolben) unter Verwendung von 25 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S). Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit, bis die Zellen eine Konfluenz von 50 % bis 70 % erreichen.
2. Mischen Sie 14 μl Polyethylenimin (1 μg/μl) mit 1 ml 150 mM NaCl. Mischen Sie die drei für die AAV-Produktion erforderlichen Plasmide in einem molaren Verhältnis von 1:1:1 (d. h. 17,7 μg pAdDeltaF6, 7,9 μg AAV2/8 (siehe Materialtabelle) und 5,9 μg klonierte sgRNA aus Schritt 1 in 1 ml 150 mM NaCl. Das Polyethylenimin:NaCl-Gemisch tröpfchenweise in das Röhrchen mit der DNA (Plasmidgemisch) überführen und 20 min bei 25 °C inkubieren.
   HINWEIS: pAdDeltaF6 ist ein Helferplasmid und pKapsid pAAV2/8 ist ein Verpackungsplasmid, das Replikations- (Rep) und Kapsidgene (cap) exprimiert. Beide Plasmide sind notwendig, um AAV zu produzieren.
3. Vor der Transfektion wird das Zellwachstumsmedium durch 18 ml DMEM ersetzt, das 1 % FBS und L-Alanyl-L-Glutamin (0,5 g/l) enthält. Geben Sie 2 ml des Polyethylenimin:DNA-Gemisches in jeden Kulturkolben und inkubieren Sie die Zellen in einem CO 2 -Inkubator (37 °C, 5 % CO_2, 95 % Luftfeuchtigkeit).
4. Nach 5 h 5 ml DMEM mit 10 % FBS und L-Alanyl-L-Glutamin (0,5 g/l) hinzufügen.
5. Nach 3 Tagen Inkubation lösen Sie die Zellen mit einem Zellschaber aus dem Kulturkolben. Sammeln Sie die 293T-Zellen aus 10 (175 cm²) Zellkulturflaschen in konische 50-ml-Röhrchen und fügen Sie DMEM (siehe Materialtabelle) bis zu 30 ml hinzu.
6. Geben Sie 3 ml Chloroform in jedes konische 50-ml-Röhrchen, das die 293T-Zellen enthält, und mischen Sie es 5 Minuten lang mit einem Wirbelmischer bei hoher Geschwindigkeit. Resuspendieren Sie die Zellen durch Zugabe von 7,6 mL 5 M NaCl und wirbeln Sie kurz vortex. Bei 3.000 × g und 4 °C für 5 min zentrifugieren.
7. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues konisches Röhrchen und fügen Sie 9,4 ml 50% (v/v) Polyethylenglykol (PEG) 8000 hinzu. Mischen Sie mit einem Vortex-Mischer bei hoher Geschwindigkeit für 10 s und legen Sie die Proben für 1 h auf Eis.
8. 30 min bei 3.000 × g bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet 10 Minuten trocknen.
9. Fügen Sie 1,4 ml HEPES (50 mM, pH 8) hinzu und mischen Sie 5 Minuten lang mit einem Wirbelmischer bei hoher Geschwindigkeit. Fügen Sie 3,5 μl 1 M MgCl₂, 14 μl DNase I (20 Einheiten/μl) und 1,4 μl RNase A (10 μg/μl) hinzu. Inkubieren Sie 20 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad und übertragen Sie die Proben dann in neue 1,5-ml-Röhrchen (700 μl in jedem Röhrchen).
10. 700 μl Chloroform in jedes 1,5-ml-Röhrchen geben und mit einem Wirbelmischer bei hoher Geschwindigkeit 10 s lang mischen. Bei 3.000 × g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren und die wässrige Phase in ein neues Röhrchen überführen. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
11. Verdampfen Sie das Chloroform für 30 Minuten in einer Biosicherheitswerkbank. Anschließend werden 300 μl der wässrigen Phase in ein 0,5-ml-Ultrazentrifugationsröhrchen überführt (siehe Materialtabelle). Drehen Sie den Filter bei 14.000 × g bei 25 °C für 5 min. Entfernen Sie den Durchfluss und drehen Sie den Filter erneut, bis das gesamte Volumen durch den Filter geflossen ist.
12. Waschen Sie den Filter, indem Sie 300 μl der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco hinzufügen, und mischen Sie die Lösungen durch Pipettieren. Zentrifugieren Sie den Filter 5 min lang bei 14.000 × g bei 25 °C. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 4x.
13. Zentrifugieren Sie den Filter 8 min lang bei 14.000 × g bei 25 °C. Setzen Sie den Filter verkehrt herum in ein neues Röhrchen ein und schleudern Sie ihn 2 Minuten lang bei 1.000 × g bei 25 °C.

3. Titration der AAV mittels qPCR

1. Bereiten Sie eine Standardkurve für die AAV-Titration vor und bestimmen Sie den AAV-Titer gemäß der Originalstudie von Fripont et ^al.15.

4. In-vivo-Injektion von AAV in das inguinale weiße Fettgewebe (iWAT)

1. Trennen Sie die chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien, die für die Operation benötigt werden, und sterilisieren Sie sie wie für jedes spezifische Material empfohlen.
2. Betäubung der Maus mit 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin durch intraperitoneale Injektion. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie kräftigen Druck auf Pfote und Schwanz ausüben und auf einen Reflex achten. Tragen Sie Salbe auf die Augen der Maus auf, um Augentrockenheit während der Operation zu vermeiden.
3. Legen Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage und rasieren Sie einen kleinen Bereich an den Flanken, proximal zu den Hüftgelenken für iWAT-Injektionen, mit einem Rasierer. Enthaarungscreme 5 Minuten lang auftragen. Entfernen Sie die restliche Creme mit Wasser, um Hautverbrennungen zu vermeiden.
4. Desinfizieren Sie die Haut, indem Sie dreimal abwechselnd eine antiseptische Lösung (Povidon-Jod) mit einer sauberen Gaze und 70% Alkohol auf die Haut auftragen. Entsorgen Sie die Gaze nach jedem Gebrauch.
5. Tragen Sie zum Schluss eine antiseptische Lösung auf die Haut auf. Machen Sie dann mit einer sterilisierten Schere einen 1-2 cm großen Schnitt im proximalen Bereich der Gelenke und halten Sie die Haut mit einer Pinzette offen, um das Fettdepot freizulegen. Das WAT ist beidseitig an der Haut befestigt und erstreckt sich von Anfang an über den Rücken bis hinunter zum Hoden.
   Anmerkungen: Verwenden Sie Abdeckungen, um eine Kontamination während der Operation oder des Nahtverfahrens zu vermeiden.
6. Ziehen Sie das Fettdepot mit einer Pinzette sanft durch den Schnitt nach oben, um sicherzustellen, dass sich die Injektion an der richtigen Stelle und in der richtigen Tiefe befindet.
   Anmerkungen: Achten Sie darauf, das Gewebe nicht von seiner ursprünglichen Position zu entfernen.
7. Füllen Sie die Mikroliterspritze (Stärke: 33; Spitzenform: 4; Winkel: 12; Länge: 10) (siehe Materialtabelle) mit 2,5 μL (5,6 × 10¹⁰ virale Genome [VG]/μl) des AAV (mit der sgRNA, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt). Führen Sie die Nadel vorsichtig in einem Winkel von 30°-45° in den iWAT ein. Wiederholen Sie die Injektion 5x an verschiedenen Stellen des Gewebes, um das gesamte iWAT-Fettpolster homogen zu infizieren. Für die Infektion des iWAT wird ein Gesamtvolumen von 15 μL empfohlen.
   Anmerkungen: Die Einführtiefe der Spritze hängt von der Dicke des Fettpolsters ab. Verwenden Sie die berührungslose Technik, um die Injektion zu ziehen.
8. Verschließen Sie den rasierten Hautschnitt mit 4/0-Monofilament-Nähten. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Überwachen Sie das Tier alle 10-15 Minuten, bis es sich vollständig erholt hat. Nachdem das Tier das Bewusstsein wiedererlangt hat, beobachten Sie das Bewegungsprofil, das linear sein sollte und keine Anzeichen von Stress oder Schmerzen aufweisen sollte.
9. Führen Sie innerhalb von 48 Stunden nach der Operation eine postoperative Schmerzkontrolle durch, indem Sie Tramadolhydrochlorid (5 mg/kg) intraperitoneal über 3 Tage (2x/Tag) verabreichen.
   Anmerkungen: Achten Sie auf Anzeichen von Stress und Unwohlsein und überwachen Sie die Wasser- und Nahrungsaufnahme. Verabreichen Sie präventiv eine wirksame Dosis des Analgetikums, vorzugsweise vor oder zu Beginn der Operation.
10. Halten Sie die Maus während der Heilungsphase in einem Käfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Fahren Sie nach der Heilungsphase mit der Euthanasie der Maus fort. In dieser Studie wurde die Euthanasie durch eine Überdosis injizierbarer Anästhetika (intraperitoneal) ab dem 3-fachen der induzierenden Dosis (300-360 mg/kg Ketaminhydrochlorid + 30-40 mg/kg Xylazinhydrochlorid) mit anschließender Enthauptung durchgeführt.
    HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, die Tiere in Einzelkäfigen zu halten, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt haben.

5. In-vitro-Differenzierung von stromalen Gefäßzellen (SVFs) in beige Adipozyten

1. Isolierung und Plattierung von primären SVFs aus dem iWAT von AdipoSPH-Mäusen gemäß Aune et ^al.17. Samen-SVFs von AdipoSPH-Mäusen iWAT in eine 6-Well-Platte mit komplettem Medium (DMEM mit 3,1 g/L Glukose, 0,5 g/L L-Alanyl-L-Glutamin, 10% FBS und 2,5% P/S) für 1-2 h.
   HINWEIS: Die SVF-Fraktion enthält eine Mischung aus verschiedenen Zelltypen. In diesem Schritt ist es nicht möglich, die Anzahl der ausgesäten Vorläuferzellen zu definieren, aus denen Adipozyten entstehen.
2. Saugen Sie das Medium ab, waschen Sie die Vertiefung 2x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) und ersetzen Sie es durch frisches komplettes Medium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂, 95 % Feuchtigkeit, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen.
3. Induzieren Sie die Differenzierung (Tag 0), indem Sie die Zellen mit dem Induktionsmedium behandeln (Tabelle 2).
   ANMERKUNG: Der Wirkstoffcocktail des Induktionsmediums ist notwendig, um die Differenzierung der beigen Adipozyten zu verbessern und um das thermogene Genprogramm¹⁷ zu exprimieren.
4. Ersetzen Sie nach 2 Tagen (Tag 2) das Induktionsmedium durch das Wartungsmedium (Tabelle 2).
5. Ersetzen Sie nach 2 Tagen (Tag 4) das Pflegemedium für 2 bis 3 Tage durch frisches Pflegemedium (Tabelle 2).
6. Wechseln Sie das Erhaltungsmedium alle 48 h, bis die Präadipozyten vollständig in Adipozyten differenziert sind (typischerweise 6 Tage nach Zugabe von Induktionsmedium). Reife Adipozyten können lichtmikroskopisch beobachtet werden, da die differenzierten Zellen mit Lipidtröpfchen beladen zu sein scheinen.

6. In-vitro-AAV-Infektion von SVFs

HINWEIS: SVFs, die von AdipoSPH-Mäusen iWAT stammten, wurden mit AAV-tragender sgRNA-Prdm16 infiziert, wie bereits von Wang et ^al.18 beschrieben, mit einigen Modifikationen.

1. Züchten Sie die Zellen auf einer 6-Well-Kulturplatte mit komplettem Medium, bis die Zellen eine Konfluenz von 70%-80% erreichen, wie zuvor in den Schritten 5.1-5.3 beschrieben.
2. Mischen Sie 5,6 × 10¹⁰ VG/μl AAV-tragende sgRNA-Prdm16 mit 2 ml Komplettmedium und Hexadimethrinbromid (8 μg/ml) (siehe Materialtabelle). Transduzieren Sie die Zellen, indem Sie das komplette Medium ersetzen und das komplette Medium hinzufügen, das AAV enthält. Inkubieren Sie die transduzierten Zellen 12 h lang bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO_2.
3. Teilen und säen Sie die Zellen wie in Schritt 5 beschrieben für die Zellproliferation und -differenzierung in beige Adipozyten.
   HINWEIS: Für den Sauerstoffverbrauchs-Assay werden 4,0 × 10⁴ Zellen (aus Schritt 6.2) pro Well mit Induktionsmedium in einer 24-Well-Zellkulturplatte gesät. Die nachfolgenden Schritte der Zellproliferation und -differenzierung werden wie in Schritt 5 beschrieben durchgeführt. Der Sauerstoffverbrauchstest wird durchgeführt, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 100 % erreichen und vollständig differenziert sind, wie bereits berichtet¹⁹.

Ergebnisse

AdipoSPH-Mäuse wurden durch die Züchtung von SPH- und Adipoq-Cre-Mausstämmen entwickelt. Beide Mausstämme befanden sich in einem hybriden C57BL6J-DBA/2J-Hintergrund (nach Angaben des kommerziellen Anbieters; siehe Materialtabelle). Die SPH-Mauslinie wurde ursprünglich von Zhou et ^al.14 beschrieben.

In vivo beige Adipozytenentwicklung durch AdipoSPH-vermittelte Prdm16-Überexpression
Um die Fähigkeit de...

Diskussion

Eine der nützlichsten Nicht-Editing-Anwendungen der CRISPR-Technologie ist die Abfrage der Genfunktion durch die Aktivierung endogener Gene mit Hilfe von CRISPRa-Systemen⁶. SPH ist ein starkes CRISPRa, von dem ursprünglich beschrieben wurde, dass es die Umwandlung von Astrozyten in aktive Neuronen induziert, indem es auf mehrere neurogene Gene abzielt¹⁴. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass AdipoSPH ein geeignetes Werkzeug zur Untersuchung der Biologie von beigem ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma-Aldrich	T2877
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879
AAVpro 293T Cell Line	Takarabio	632273
Amicon Ultra Centrifugal Filter	Merckmillipore	UFC510008	100 KDa
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Corning	10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement	Gibco	10565-018	high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Excelta Self-Opening Micro Scissors	Fisher Scientific	17-467-496
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)	Fisher Scientific	08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-940
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278
LigaFast Rapid DNA Ligation System	Promega	M8225
Maxiprep purification kit	Qiagen	12162
Microliter syringe	Hamilton	80308	Model 701
NEB 10-beta/Stable	New England Biolabs	C3019H	E. coli competent cells
pAAV2/8	Addgene	112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry	Addgene	91947
pAdDeltaF6	Addgene	112867
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Polyethylenimine	Sigma-Aldrich	23966	Linear, MW 25000
Povidone-iodine	Rioquímica	510101303	Antiseptic
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
SacI enzyme	New England Biolabs	R0156
Surgical Design Premier Adson Forceps	Fisher Scientific	22-079-741
Syringe	Hamilton	475-40417
T4 DNA Ligase	Promega	M180B
T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
T4 PNK enzyme kit	New England Biolabs	M0201S
Tramadol Hydrochloride	SEM	43930
Vidisic Gel	Bausch + Lomb	99620