JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف المنهجية توليد الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية (MoDCs) وتطبيقها للتقييم في المختبر للمرشحين المستضديين أثناء تطوير اللقاحات البيطرية المحتملة في الماشية.

Abstract

الخلايا المتغصنة (DCs) هي أقوى الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) داخل الجهاز المناعي. وهي تقوم بدوريات في الكائن الحي بحثا عن مسببات الأمراض، وتلعب دورا فريدا داخل الجهاز المناعي من خلال الربط بين الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. يمكن لهذه الخلايا أن تبتلع ثم تقدم مولدات الضد الملتقطة إلى الخلايا المناعية المستجيبة، مما يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الاستجابات المناعية. توضح هذه الورقة طريقة موحدة للتوليد في المختبر للخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأحادية البقرية (MoDCs) المعزولة من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي للماشية (PBMCs) وتطبيقها في تقييم مناعة اللقاح.

تم استخدام فرز الخلايا القائم على المغناطيسية لعزل الخلايا الوحيدة CD14 + من PBMCs ، وتم استخدام مكملات وسط الاستزراع الكامل مع الإنترلوكين (IL) -4 وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) للحث على تمايز الخلايا الوحيدة CD14 + إلى MoDCs ساذجة. تم تأكيد جيل MoDCs غير الناضجة من خلال الكشف عن التعبير عن علامات سطح الخلية الرئيسية II (MHC II) ، CD86 ، و CD40. تم استخدام لقاح داء الكلب المتاح تجاريا لنبض MoDCs غير الناضجة ، والتي تم استزراعها لاحقا مع الخلايا الليمفاوية الساذجة.

كشف تحليل قياس التدفق الخلوي ل MoDCs النبضية للمستضد والثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية عن تحفيز تكاثر الخلايا الليمفاوية التائية من خلال التعبير عن علامات Ki-67 و CD25 و CD4 و CD8. أظهر تحليل تعبير mRNA ل IFN-γ و Ki-67 ، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، أن MoDCs يمكن أن تحفز التحضير الخاص بالمستضد للخلايا الليمفاوية في نظام الاستزراع المشترك في المختبر . علاوة على ذلك ، أظهر إفراز IFN-γ الذي تم تقييمه باستخدام ELISA عيارا أعلى بكثير (** p < 0.01) في الثقافة المشتركة للخلايا اللمفاوية النابضة بلقاح داء الكلب مقارنة بالثقافة المشتركة MoDC-lymphocyte غير النابضة بالمستضد. تظهر هذه النتائج صحة اختبار MoDC في المختبر لقياس مناعة اللقاح ، مما يعني أنه يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد اللقاحات المرشحة المحتملة للماشية قبل الشروع في التجارب في الجسم الحي ، وكذلك في تقييمات مناعة اللقاح للقاحات التجارية.

Introduction

يمثل التطعيم البيطري جانبا حاسما من جوانب تربية الحيوانات وصحتها ، حيث يساهم في تحسين الأمن الغذائي ورعاية الحيوان من خلال توفير الحماية ضد الأمراض التي تؤثر على قطاع الثروة الحيوانية على مستوىالعالم 1. ومن شأن وجود طريقة فعالة في المختبر لتقييم استمناع اللقاحات المرشحة المحتملة أن يساعد في تسريع عملية تطوير اللقاح وإنتاجه. لذلك ، من الضروري توسيع مجال المقايسات المناعية بمنهجيات مبتكرة تستند إلى الدراسات المختبرية ، لأن هذا من شأنه أن يساعد في الكشف عن تعقيد العمليات المناعية المتعلقة بالتحصين والعدوى الممرضة. وفي الوقت الراهن، تستخدم دراسات التمنيع والتحدي في الحيوانات في الجسم الحي ، التي تتطلب أخذ عينات دورية (مثل الدم والطحال)، لقياس استمناع اللقاحات المرشحة والمواد المساعدة. هذه المقايسات باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا ولها آثار أخلاقية ، لأنه في معظم الحالات ، يتم تنفيذ القتل الرحيم للحيوانات بنهاية التجارب.

كبديل للمقايسات في الجسم الحي ، تم استخدام خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) لتقييم الاستجابات المناعية التي يسببها اللقاح في المختبر2. PBMCs هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا تتكون من 70٪ -90٪ خلايا ليمفاوية ، 10٪ -20٪ وحيدات ، وعدد محدود من الخلايا المتغصنة (DCs ، 1٪ -2٪) 3. تؤوي PBMCs خلايا مقدمة للمستضد (APCs) مثل الخلايا البائية ، والوحيدات ، و DCs ، والتي تقوم باستمرار بدوريات في الكائن الحي بحثا عن علامات العدوى أو تلف الأنسجة. تسهل الكيموكينات المفرزة محليا تجنيد وتفعيل ناقلات الجنود المدرعة في هذه المواقع عن طريق الارتباط بمستقبلات سطح الخلية. في حالة الوحيدات ، توجه chemokines مصيرها إما للتمايز إلى DCs أو الضامة4. بمجرد أن تواجه DCs مسببات الأمراض وتلتقطها ، فإنها تهاجر إلى الأعضاء اللمفاوية الثانوية ، حيث يمكنها تقديم مستضدات الببتيد الممرض المعالجة باستخدام البروتينات السطحية من الفئة الأولى أو الفئة الثانية من معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) إلى خلايا CD8 + T أو خلايا CD4 + T ، على التوالي ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية 5,6.

إن الدور الرئيسي الذي تلعبه البلدان النامية في تنظيم استجابة مناعية وقائية ضد مسببات الأمراض المختلفة يجعلها هدفا بحثيا مثيرا للاهتمام لفهم آليات المناعة داخل الخلايا ، خاصة عند تصميم اللقاحات والمواد المساعدة ضد العوامل المعدية7. نظرا لأن جزء DCs الذي يمكن الحصول عليه من PBMCs صغير نوعا ما (1٪ -2٪) ، فقد تم استخدام الخلايا الوحيدة بدلا من ذلك لتوليد DCs في المختبر8. تم تطوير هذه الخلايا الأحادية المشتقة من الخلايا الأحادية (MoDCs) في البداية كاستراتيجية علاج محتملة في العلاج المناعي للسرطان9. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام MoDCs لأبحاث اللقاحات10،11،12 ، والوحيدات الكلاسيكية هي النوع الفرعي السائد (89٪) لإنتاج MoDC 13. تم تحقيق إنتاج MoDCs في المختبر سابقا من خلال إضافة عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) المعطى بالاشتراك مع السيتوكينات الأخرى مثل إنترلوكين -4 (IL-4) ، عامل نخر الورم α (TNF-α) ، أو IL-1314،15،16.

يعتمد نجاح مقايسة MoDC في المختبر على قدرة MoDCs الناضجة المحفزة بالمستضد على تعديل مدى ونوع الاستجابة المناعية الخاصة بنوع المستضد المكتشف17. يحدد نوع العامل الممرض الذي تتعرف عليه وتقدمه MoDCs تمايز الخلايا المساعدة CD4 + T (Th) إلى خلايا مستجيبة Th1 أو Th2 أو Th17 وتتميز بملف تعريف السيتوكين الإفرازي الخاص بمسببات الأمراض. يتم استنباط استجابة Th1 ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا وتؤدي إلى إفراز إنترفيرون جاما (IFN-γ) وعامل نخر الورم بيتا (TNF-β) ، الذي يعدل الحماية المعتمدة على البلعمة. يتم تشغيل استجابة Th2 ضد الكائنات الطفيلية وتتميز بإفراز IL-4 و IL-5 و IL-10 و IL-13 ، والذي يبدأ الحماية الخلطية المستقلة عن البلعمة. يوفر Th17 حماية تعتمد على العدلات ضد الالتهابات البكتيرية والفطرية خارج الخلية بوساطة إفراز IL-17 و IL-17F و IL-6 و IL-22 و TNF-α18،19،20،21. بناء على الدراسات السابقة ، لوحظ أنه لا تقع جميع مسببات الأمراض ضمن ملف السيتوكين المتوقع. على سبيل المثال ، تحفز MoDCs الجلدية ، استجابة للعدوى الطفيلية الليشمانيا ، إفراز IFN-γ من الخلايا التائية CD4 + وخلايا CD8 + T ، مما يؤدي إلى استجابة Th1 وقائية للالتهابات22.

وقد تبين أيضا أنه في الدجاج MoDCs المحضرة بسكريد السالمونيلا الشحمي (LPS) ، يمكن أن تحفز استجابة متغيرة ضد السالمونيلا التيفية عن طريق تنشيط كل من استجابات Th1 و Th2 ، في حين أن السالمونيلا جاليناروم تحفز استجابة Th2 وحدها ، مما قد يفسر المقاومة العالية للأخيرة تجاه إزالة MoDC23. كما تم الإبلاغ عن تنشيط MoDCs ضد البروسيلا كانيس (B. canis) في كل من الكلاب و MoDCs البشرية ، مما يعني أن هذا يمكن أن يمثل آلية عدوى حيوانية المنشأ24. تحفز MoDCs البشرية المحضرة ب B. canis استجابة Th1 قوية تمنح مقاومة للعدوى الشديدة ، في حين أن MoDCs الكلاب تحفز استجابة Th17 المهيمنة مع استجابة Th1 منخفضة ، مما يؤدي لاحقا إلى إنشاء عدوى مزمنة25. تظهر MoDCs البقرية تقاربا معززا لفيروس مرض الحمى القلاعية (FMDV) المترافق مع الغلوبولين المناعي G (IgG) مقارنة ب FMDV غير المقترن وحده ، حيث تشكل MoDCs معقدا للأجسام المضادة الفيروسية استجابة ل10 السابقة. تظهر هذه الدراسات مجتمعة كيف تم استخدام MoDCs لتحليل تعقيد الاستجابات المناعية أثناء عدوى مسببات الأمراض. يمكن تقييم الاستجابات المناعية التكيفية عن طريق القياس الكمي لعلامات محددة مرتبطة بتكاثر الخلايا الليمفاوية. يعتبر Ki-67 ، وهو بروتين داخل الخلايا يتم اكتشافه فقط في الخلايا المنقسمة ، علامة موثوقة لدراسات الانتشار26 ، وبالمثل ، فإن CD25 المعبر عنه على سطح الخلايا التائية خلال المرحلة المتأخرة من التنشيط يتوافق مع انتشار الخلايا الليمفاوية27,28.

توضح هذه الدراسة طريقة موحدة لتوليد MoDCs في الماشية في المختبر متبوعة بتطبيقها في اختبار مناعي في المختبر يستخدم لاختبار مناعة اللقاحات. تم استخدام لقاح داء الكلب المتاح تجاريا (RV) للتحقق من فعالية هذا الفحص. تم قياس تنشيط الخلايا اللمفاوية التائية وانتشارها عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) من خلال تحليل علامات تنشيط الخلايا الراسخة مثل Ki-67 و CD25 وإفراز IFN-γ28،29،30،31. لا يتم إجراء أي تجارب تجريبية على الحيوانات أو البشر أثناء فحص MoDC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتم جمع الدم من قبل خدمة بيطرية معتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للوكالة النمساوية للصحة وسلامة الأغذية (AGES) وبما يتوافق مع معايير رعاية الحيوان المقبولة32. حصلت الدراسة على موافقة أخلاقية من وزارة الزراعة النمساوية. يوضح الشكل 1 التصميم التجريبي لتوليد MoDCs وتطبيقه اللاحق.

1. إنتاج MoDCs الساذجة

ملاحظة: تم الحصول على عينات دم كاملة من عجل واحد خال من مسببات الأمراض عن طريق ثقب الوريد الوداجي مع vacutainers الهيبارين (تم استخدام ثمانية أنابيب دم سعة 9 مل لهذه الدراسة). نقل الدم في صندوق ثلج. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 2-4 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا ، أو قم بمعالجتها على الفور. حافظ على دوران الدم لتجنب تخثر الدم. تعقيم vacutainers مع 70 ٪ من الإيثانول. أجريت جميع التجارب التالية باستخدام عينة بيولوجية واحدة وست نسخ مكررة تقنية.

  1. الطرد المركزي المتدرج الكثافة لعزل PBMCs من الدم الهيبارين
    1. امزج الدم جيدا عن طريق قلبه 10 أضعاف.
    2. باستخدام ماصة 10 مل ، انقل 20 مل من دم الهيبارين إلى أنبوب معقم سعة 50 مل ، وقم بتخفيفه ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    3. ماصة 15 مل من وسط عزل الخلايا الليمفاوية إلى أنبوب معقم سعة 50 مل.
      ملاحظة: اسمح للوسط العازل للخلايا الليمفاوية بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الماصة.
    4. قم بإمالة الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على وسط عزل الخلايا الليمفاوية إلى وضع 45 درجة. ضع طرف ماصة سعة 25 مل بشكل عمودي ، وقم بطبقة 30 مل من الدم PBS بعناية فوق وسط عزل الخلايا الليمفاوية ، دون خلط الاثنين. ببطء شديد ، أعد أنبوب 50 مل إلى الوضع الرأسي.
    5. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 35 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع أقصى تسارع وبدون فرامل (تم إيقاف تشغيل وظيفة التباطؤ).
    6. استخدم ماصة باستور لجمع طبقة PBMC (الطبقة البيضاء الرقيقة مباشرة بعد الطبقة الأولى من البلازما) ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
      ملاحظة: يفصل الطرد المركزي المتدرج الكثافة الدم الكامل إلى طبقات مختلفة. نتيجة لذلك ، تستقر كريات الدم الحمراء في القاع كحبيبات ، وتستقر الخلايا أحادية النواة (PBMCs) في طبقة الواجهة ، وتشكل البلازما الطبقة العليا. تم العثور على الخلايا المحببة بين الحبيبات وطبقة PBMC.
    7. اغسل PBMCs 2x المحصودة بإضافة PBS حتى حجم 40 مل والخلط جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ثم ، أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق مع أقصى تسارع وأقصى تباطؤ.
    8. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، وأعد تعليق الحبيبات في 15 مل من 1x مخزن مؤقت من كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم (ACK) ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: لا تحتضن لأكثر من 15 دقيقة. يستخدم المخزن المؤقت ACK المتاح تجاريا لضمان تحلل خلايا الدم الحمراء المتبقية (RBCs) الموجودة في جزء PBMC.
    9. أضف PBS حتى حجم 40 مل ، ثم جهاز طرد مركزي عند 500 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق مع أقصى تسارع وتباطؤ.
    10. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، وكرر الخطوة 1.1.9.
    11. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسط الاستزراع الكامل (في درجة حرارة الغرفة).
      ملاحظة: يتكون وسط الاستزراع الكامل من وسط زراعة الخلايا RPMI 1640 المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
  2. الفصل المغناطيسي لخلايا CD14 +/− من مجتمع PBMC باستخدام حبات مغناطيسية مترافقة CD14
    1. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا مقياس الدم النظيف باستخدام 10 ميكرولتر من تعليق الخلية الممزوج ب 10 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق (0.4٪).
      ملاحظة: صبغة تريبان الزرقاء هي مادة كيميائية سامة ومسرطنة محتملة. يجب التعامل معها أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) لتجنب الاتصال ، ويجب التخلص من النفايات في حاوية نفايات سامة متخصصة محكمة الإغلاق. ستظهر الخلايا الميتة باللون الأزرق ، بينما ستظهر الخلايا الحية واضحة تحت المجهر.
    2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 500 × جم.
    3. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق الحبيبات في مخزن فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) باستخدام حجم 40 ميكرولتر لكل 1 × 107 خلايا. تخلط جيدا باستخدام ماصة.
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت FACS من 2٪ FBS و 2 mM من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) المذاب في PBS.
    4. أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للميكروبيدات CD14 لكل 1 × 107 خلايا ، واخلطها جيدا باستخدام ماصة.
    5. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 4-8 درجة مئوية للاختيار الإيجابي للوحيدات CD14 + البقري33. دوامة كل 15 دقيقة خلال فترة الحضانة.
    6. الخطوة الاختيارية (لتحليل قياس التدفق الخلوي): أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد للتلطيخ CD14-FITC (فلوريسئين أيزوثيوسيانات) مع الحضانة اللاحقة لمدة 15 دقيقة عند 4-8 درجة مئوية. راجع تحليل قياس التدفق الخلوي في الخطوة 5 للحصول على التفاصيل.
    7. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 500 × جم.
    8. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل 1 × 108 خلايا.
    9. أدخل عمود فصل الخلايا المغناطيسية المناعية في الفاصل (حامل العمود المغناطيسي) ، وضع أنبوب تجميع سعة 15 مل أسفل مخرج العمود لتجميع التدفق.
    10. اغسل العمود ب 1 مل من المخزن المؤقت FACS المنزوع الغاز. بعد الشطف ، استبدل الأنبوب المستخدم سعة 15 مل بأنبوب جديد.
    11. اسمح لتعليق الخلية (من الخطوة 1.2.8) بالمرور عبر العمود عن طريق سحب 1 × 108 خلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت في المرة الواحدة.
      ملاحظة: انتبه إلى عدم توليد فقاعات هواء أثناء خلط الخلايا قبل السماح لها بالمرور عبر العمود.
    12. اشطف العمود 3 مرات ب 3 مل من المخزن المؤقت FACS المنزوع الغازات في كل مرة.
    13. اجمع التدفق ، وقم بتسمية هذا الجزء الأول على أنه جزء الخلية CD14− (PBMCs ناقص الخلايا الوحيدة CD14 + ) ؛ وهذا ما يسمى أيضا جزء الخلايا الليمفاوية الساذجة.
      ملاحظة: يتم الاحتفاظ بخلايا CD14− في وسط استزراع كامل حتى يتم إنتاج MoDCs النبضية للمستضد.
    14. قم بإزالة العمود من الفاصل.
    15. ضع أنبوبا معقما جديدا سعة 15 مل أسفل العمود لجمع النفايات السائلة.
    16. ماصة 5 مل من المخزن المؤقت FACS في العمود ، وادفعه على الفور باستخدام مكبس.
    17. اجمع التدفق ، وقم بتسمية هذا الجزء الثاني المستحضر على أنه جزء خلية CD14 + ؛ وهذا ما يسمى أيضا جزء الوحيدات الساذج.
    18. أضف وسط استزراع كامل إلى الخلايا الوحيدة CD14 + المحصودة لتحقيق 1 × 106 خلايا / مل.
      ملاحظة: عد الخلايا الحية في جزء خلية CD14 + المستخلصة لتقدير حجم وسط الاستزراع الكامل المطلوب لتحقيق عدد الخلايا المطلوب.
    19. خذ صفيحة معقمة من 24 بئرا ، وأضف 1 مل من معلق الخلية (1 × 106 خلايا / مل) إلى كل بئر.
  3. تمايز الخلايا الوحيدة الساذجة CD14 + إلى MoDCs ساذجة بإضافة 3٪ وزن / وزن كوكتيل سيتوكين (GM-CSF + IL-4) بإجمالي 5 أيام من الحضانة
    1. استكمل كل بئر يحتوي على حيدات CD14 + ب 40 ميكرولتر (3٪ وزن / حجم) من كوكتيل السيتوكين المقدم في المجموعة.
    2. احتضان اللوحة في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO2 وعند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    3. في اليوم الثاني ، قم بنقل نصف محتوى كل بئر (500 ميكرولتر) باستخدام ماصة إلى أنابيب فردية سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق.
    4. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل الطازج.
    5. انقل 500 ميكرولتر من معلق الخلية هذا من الخطوة 1.3.4 مرة أخرى إلى كل بئر معين بحيث يكون الحجم النهائي 1 مل.
    6. إثراء كل بئر مع 20 ميكرولتر من كوكتيل السيتوكين.
    7. احتضان الثقافة لمدة 72 ساعة في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO2 وعند 37 درجة مئوية.
    8. بعد الحضانة في اليوم 5 ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة.
      ملاحظة: سيحتوي كل بئر على 1 مل من تعليق الخلية من MoDCs الساذجة. سيكون عدد MoDCs نسبة مئوية (~ 20٪) من الخلايا الوحيدة الأصلية المطلية (1 × 106 / مل).

2. فحص النشاط الداخلي MoDC

ملاحظة: يقيس فحص امتصاص المستضد أو مقايسة النشاط الداخلي قدرة MoDCs الساذجة على استيعاب المواد الغريبة. قم بإجراء الفحص باستخدام MoDCs الساذجة المستزرعة ب 3٪ وزن / وزن كوكتيل السيتوكين ومع 5 أيام من الحضانة ، كما هو موضح سابقا34.

  1. حصاد تعليق خلية MoDC الساذج من لوحة 24 بئرا ، ونقله إلى أنبوب 15 مل ؛ أيضا جمع أي خلايا المتبقية عن طريق شطف الآبار مع برنامج تلفزيوني.
  2. جهاز طرد مركزي لمدة 500 × غرام لمدة 7 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط الاستزراع المكمل ب 1٪ FBS.
  3. عد خلايا MoDC الحية لتقدير حجم الوسط المطلوب للوصول إلى عدد الخلايا المطلوب (2 × 105 خلايا / مل).
  4. استزراع MoDCs الساذجة في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل في صفيحة 24 بئرا مع تركيز خلية نهائي يبلغ 2 × 105 خلايا / مل.
  5. استكمل كل بئر ب 1 ملغ / مل ديكستران مقترن FITC (مسبار الفلورسنت المستخدم كمقتفي للخلاء).
    ملاحظة: يعمل FITC-dextran كمسبار فلوري ويستخدم كمقتفي للخلايا.
  6. غطي الطبق واحتضنه في الظلام عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: للتحكم في الخلفية ، احتضان خلايا MoDC الإضافية (2 × 105 خلايا / مل) مع 1 مجم / مل FITC-dextran على الجليد ، لأن هذا النوع من الحضانة يمنع دخول جزيء التتبع (FITC-dextran) إلى الخلايا.
  7. بعد الحضانة ، قم على الفور بنقل اللوحة المكونة من 24 بئرا على الجليد لوقف التداخل الخلوي ل FITC-dextran.
  8. اغسل الخلايا بمحلول FACS بارد مثلج.
  9. الحصاد والطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  10. تحليل شدة مضان FITC-dextran داخل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. راجع تحليل قياس التدفق الخلوي في الخطوة 5.2 للحصول على التفاصيل.

3. توليد MoDCs النبضية بالمستضد

ملاحظة: يمكن للقاح متاح تجاريا ومعتمد سريريا ضد فيروس داء الكلب (RV) أن يحفز تمايز MoDCs الساذجة إلى MoDCs الناضجة التي تقدم المستضدات. استخدم 0.1٪ (~ 1 ميكرولتر) من جرعة تطعيم RV واحدة لتوليد MoDCs النبضية بالمستضد. علاوة على ذلك ، يفضل إنتاج MoDCs نبضية RV في نفس لوحة الاستزراع المستخدمة (في الخطوة 1.3.8) لتوليد MoDCs ساذجة لأن نقل MoDCs الساذجة إلى لوحة جديدة من 24 بئرا سيؤثر سلبا عليها.

  1. من الخطوة 1.3.8) أضف 1 ميكرولتر / مل من معلق RV إلى 1 مل من ثقافة MoDC الساذجة في لوحة 24 بئرا ، واحتضانها لمدة 48 ساعة عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم استخدام MoDCs الساذجة المزروعة بدون تحفيز RV كعنصر تحكم في الخلفية (وكتحفيز غير محدد للثقافة المشتركة مع الخلايا الليمفاوية في الخطوات التالية).
  2. بعد الحضانة ، في اليوم 7 ، احتفظ باللوحة المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على MoDCs النبضية للمستضد على الجليد لمدة 10 دقائق.
  3. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني مثلج بارد لكل بئر. امزج كل بئر جيدا عن طريق السحب ، وانقل التعليق إلى أنبوب سعة 15 مل.
  4. اغسل الآبار ب 2 مل من برنامج تلفزيوني بارد جليدي لجمع الخلايا المتبقية داخل كل بئر.
  5. نقل المحتويات إلى الأنابيب الخاصة بها ، والطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 7 دقائق.
  6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية (MoDCs النبضية للمستضد) في وسط استزراع كامل ، واضبط الحجم على تركيز الخلية النهائي من 1 × 105 خلايا / مل.
    ملاحظة: عد الخلايا الحية لتقدير حجم الوسط المطلوب للوصول إلى عدد الخلايا المطلوب. استخدم MoDCs النبضية RV من اليوم 7 لنظام الاستزراع المشترك MoDC-lymphocyte.

4. الثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC

ملاحظة: يحدد نظام الاستزراع المشترك MoDC-lymphocyte في المختبر قدرة MoDCs على الخلايا الليمفاوية الأولية الخاصة بالمستضد. تشمل مجموعات العلاج المختلفة للخلايا بعد 16 يوما من الثقافة المشتركة محددة وغير محددة ومراقبة. يتم تعريف المجموعة المحددة على أنها الخلايا الليمفاوية المستزرعة بشكل مشترك مع MoDCs النبضية RV. يتم تعريف المجموعة غير المحددة على أنها الخلايا الليمفاوية المستزرعة بشكل مشترك مع MoDCs غير النبضية للمستضد. ويتم تعريف المجموعة الضابطة على أنها الخلايا الليمفاوية المستزرعة بدون MoDCs.

  1. أضف وسط استزراع كامل إلى جزء الخلايا الليمفاوية الساذجة (خلايا CD14− ) للوصول إلى تركيز خلية يبلغ 2 × 106 خلايا / مل.
    ملاحظة: عد الخلايا الحية في زراعة الخلايا CD14− التي تم الاحتفاظ بها في وسط استزراع كامل في صفيحة 24 بئرا منذ جمعها لتقدير حجم الوسط المطلوب للوصول إلى عدد الخلايا المطلوب.
  2. في اليوم السابع ، خذ صفيحة معقمة من 24 بئرا ، وقم بزرع الآبار ب 1 مل من معلق الخلايا الليمفاوية الساذجة (2 × 106 خلية / مل) بالإضافة إلى 1 مل من معلق MoDC النبضي بالمستضد أو غير النبضي بالمستضد (1 × 105 خلية / مل).
    ملاحظة: سيكون الحجم الإجمالي في كل بئر 2 مل بنسبة 1:20 MoDCs إلى الخلايا الليمفاوية لكل بئر.
  3. احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  4. إثراء الثقافة وإعادة التحفيز باستخدام MoDCs النبضية للمستضد
    1. بعد حضانة الاستزراع المشترك للخلايا اللمفاوية MoDC النبضي بالمستضد ، في اليوم 9 ، استكمل كل بئر ب 20 نانوغرام / مل من IL-2 المؤتلف ، واستمر في الحضانة لمدة 120 ساعة أخرى (5 أيام حضانة).
    2. في اليوم 14 ، انقل 1 مل من الاستزراع المشترك إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 7 دقائق.
    3. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من MoDCs النبضية أو غير النبضية (1 × 105 خلية / مل). امزج برفق عن طريق السحب ، وانقل معلقات الخلايا مرة أخرى إلى الآبار المخصصة لها.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، يبلغ الحجم الإجمالي في كل بئر 2 مل.
    4. استمر في الحضانة عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد الحضانة في اليوم 16 ، تكون الثقافة المشتركة جاهزة للتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي و qPCR و ELISA.
      ملاحظة: لكل 2 مل في كل بئر من الثقافة المشتركة MoDC-lymphoyte ، يتم تلطيخ 1 مل من الخلايا المعلقة لقياس التدفق الخلوي ، ويتم استخدام 1 مل لاستخراج الحمض النووي الريبي ، ويتم استخدام المواد الطافية من كليهما ل ELISA.

5. تحليل التدفق الخلوي

ملاحظة: قم بتلطيخ الخلايا بعلامات مناسبة / mAb قبل تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي. ارجع إلى جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الكواشف (تلطيخ mAb وضوابط النمط المتماثل) ، والمجموعة ، والأداة ، والبرامج المستخدمة في تحليل قياس التدفق الخلوي.

  1. بروتوكول تلطيخ مقياس التدفق الخلوي
    ملاحظة: قم بإجراء تلطيخ سطح الخلية ل PBMCs والخلايا الليمفاوية الساذجة والوحيدات باستخدام مضاد CD14 mAb (الخطوة 1.2.6). لتلطيخ سطح الخلية ل MoDCs الساذجة ، استخدم mAb الخاص ب CD86 ، ومضاد CD40 ، ومضاد MHC II. لتلطيخ سطح الخلية للخلايا من الثقافات المشتركة لليوم 16 ، استخدم مضادات CD4 و anti-CD8 و anti-CD25 mAbs ؛ للتلطيخ داخل الخلايا ، استخدم مضاد Ki-67 mAb. علاوة على ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا إما بالتحكم في النمط المتماثل السلبي mAb أو بدون mAb (FMO: الفلورسنت ناقص واحد). الفرق الرئيسي عند تلطيخ العلامات السطحية وداخل الخلايا هو أنه بالنسبة لعلامات سطح الخلية ، يجب أن تكون الخلايا ملطخة بسطح mAb محدد قبل تلطيخ الأحياء / الميتين (L / D) أو أي عمليات أخرى. ومع ذلك ، يتم إجراء تلطيخ داخل الخلايا بعد تلطيخ L / D ويتطلب التثبيت بالإضافة إلى خطوة النفاذية للسماح بالاختراق داخل الخلايا.
    1. نقل 1 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب معقم 1.5 مل باستخدام ماصة ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 500 × جم.
      ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، عند معالجة الخلايا من الثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC ، احفظ المادة الطافية لتحليل ELISA.
    2. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. اجمع الخلايا المتبقية باستخدام 1 مل من PBS ، وادمجها مع الحبيبات المعلقة.
    3. أضف 10 مل من PBS إلى أنبوب 15 مل الذي يحتوي على الخلايا ، واخلطه عن طريق السحب ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 850 × جم.
    4. تخلص من المادة الطافية، وكرر الخطوة 5.1.3.
    5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية بعناية مع التعليق المتبقي (حوالي 180 ميكرولتر) المتبقي بعد صب المادة الطافية.
    6. انقل تعليق الخلية إلى لوحة 96 بئرا ذات قاع V ، وأغلق الآبار لتجنب الانسكاب.
    7. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1400 × غرام لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بنفض الغبار عن اللوحة فوق حاوية نفايات لتفريغ آبار السائل ، واضغط على اللوحة على ورق ماص لضمان إزالة السائل الزائد.
    8. أضف 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتلوين السطح لكل بئر ، واخلطه برفق باستخدام ماصة ، متبوعا بالحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: لتحضير المزيج الرئيسي لتلطيخ السطح لبئر واحد، أضف 2.5 ميكرولتر من mAb السطحي إلى 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
    9. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل بئر ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1400 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، أفرغ آبار السائل عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص لإزالة السائل الزائد.
    10. أضف 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ L / D لكل بئر. تخلط جيدا باستخدام ماصة ، تليها الحضانة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
      ملاحظة: بالنسبة لبئر واحدة، قم بإذابة 0.25 ميكرولتر من صبغة L/D في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. تساعد صبغة L / D على التمييز بين الخلايا الحية والميتة.
    11. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. قم بتغطية الآبار بالغطاء ، وطرد مركزي اللوحة لمدة 1400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
    12. كرر الخطوة 5.1.11.
    13. أضف 50 ميكرولتر من محلول التثبيت لكل بئر (مرفق مع المجموعة) ، واخلطه مع ماصة قبل احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق.
    14. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية والغسيل (PW) المرفق مع المجموعة ، وقم بتغطية الآبار بالغطاء.
      ملاحظة: لتحضير 10 مل من 1x PW buffer ، قم بتخفيف 1 مل من المخزن المؤقت 10x perm في 10 مل من dH2O.
    15. جهاز طرد مركزي على اللوحة عند 1400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
    16. أضف 200 ميكرولتر من 1x PW ، متبوعا بالطرد المركزي عند 1400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
    17. للتلطيخ داخل الخلايا ، أضف 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتلطيخ داخل الخلايا (Ki-67 mAb المضاد للإنسان) لكل بئر. تخلط جيدا ، واحتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية أو على الجليد في الظلام.
      ملاحظة: لتحضير مزيج رئيسي للتلطيخ داخل الخلايا لبئر واحد ، أضف 1 ميكرولتر من Ki-67 mAb إلى 24 ميكرولتر من 1x PW. يتم استخدام علامة تلطيخ داخل الخلايا فقط عند معالجة الخلايا من اليوم 16 الثقافة المشتركة. لا يتم التلوين داخل الخلايا أثناء معالجة PBMCs ، والخلايا الليمفاوية الساذجة ، والوحيدات ، و MoDCs الساذجة.
    18. بعد الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من 1x PW إلى كل بئر. تخلط مع ماصة ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1400 × غرام لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
    19. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، متبوعا بالطرد المركزي عند 1400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
    20. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، ونقل محتويات كل بئر لفصل أنابيب مقياس التدفق الخلوي المعقمة. استخدم 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل بئر لجمع الخلايا المتبقية. الخلايا جاهزة الآن لتحليل قياس التدفق الخلوي.
  2. تشغيل العينة على مقياس التدفق الخلوي
    ملاحظة: تم تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي (باستخدام ليزر 488 نانومتر و 638 نانومتر و 405 نانومتر) وفقا لدليل الشركة المصنعة35. راجع الدليل للحصول على التفاصيل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتخصيص البروتوكول.
    1. قم بإجراء إجراءات التنظيف الروتينية قبل وبعد قراءة العينات.
      ملاحظة: لا تخطي موضع أثناء تحميل الأنابيب في الجهاز.
      1. بالنسبة لدورة التنظيف ، استخدم ما مجموعه أربعة أنابيب ، حيث يحتوي الأنبوب الأول على كاشف تنظيف التدفق والأنابيب الثلاثة المتبقية التي تحتوي على dH2O ؛ سيكون لكل أنبوب 3 مل. أثناء عملية التنظيف ، احصل على بيانات بمعدل تدفق متوسط لمدة 1 دقيقة تقريبا عن طريق التقاط 100000 حدث لكل أنبوب أقل من 330 فولت للتشتت الأمامي (FSC) مقابل 265 فولت للتشتت الجانبي (SSC).
        ملاحظة: لا ينبغي الإبلاغ عن أي حطام أو أحداث خلوية أثناء التنظيف ؛ إذا حدث هذا ، فقم بإجراء خطوة التنظيف مرة أخرى. لتشغيل العينات ، تأكد من أن جميع العينات في تعليق متجانس قبل الحصول على البيانات لأن هذا يضمن قراءة دقيقة.
    2. للاتصال وتشغيل مقياس الخلايا ، انقر فوق زر التطبيق الموجود في الزاوية اليسرى من شريط العنوان. من القائمة المنسدلة للتطبيق ، حدد الخيار قياس الخلايا، وانقر على الخيار تشغيل.
      ملاحظة: من القائمة المنسدلة للتطبيق ، يتيح الخيار Open للمستخدمين تصفح المقايسات المبرمجة مسبقا ، بينما يسمح الخيار New Protocol للمستخدمين بإنشاء بروتوكولات جديدة.
    3. قم في البداية بتحميل عينة التحكم السلبية في حامل الأنبوب المتعدد. حدد بروتوكول جديد ، ولاحظ قائمة العمل على الجانب الأيسر من مساحة العمل / الشاشة.
    4. في قائمة العمل ، حدد موضع العينة في حامل الأنبوب المتعدد ، وقم بإعطاء اسم للعينة والبروتوكول لتحديد الهوية.
    5. من لوحة الأجهزة الموجودة على الجانب الأيسر من مساحة العمل ، اضبط وحدد معلمات متعددة مثل أجهزة الكشف (FSC و SSC و 10 نطاقات مضان) ، والفولتية (V ) ومكاسب المضاعفات الضوئية ، وعرض ارتفاع المنطقة (AHW) للإشارة.
      ملاحظة: تم اختيار الإعدادات التالية لأجهزة الكشف بناء على التجربة والأداة المستخدمة: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A ، V: 350 ، G: 10 ؛ FL1 (CD8 / FITC ديكستران) - AHW: A ، V: 400 ، G: 1 ؛ FL2 (CD25 / PE) - AHW: A ، V: 500 ، G: 1 ؛ FL6 (CD4 / أليكسا فلور 647) - AHW: A ، V: 700 ، G: 1 ؛ FL7 (كي-67/أليكسا فلور 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L / D) - AHW: A ، V: 425 ، G: 1.
    6. من لوحة التحكم في اقتناء الأدوات الموجودة أسفل شريط العنوان ، اضبط خيارات معدل التدفق (متوسط) والوقت (5 دقائق) والأحداث (انظر الخطوة 5.2.8) المطلوب اكتشافها. انقر فوق الخيار الحصول على مفرد للسماح للأداة بسحب / تشغيل العينة وإظهار المعاينة في الوقت الفعلي للأحداث المكتشفة.
    7. من المعاينة في الوقت الفعلي ، اضبط عتبة التألق (الجهد والكسب) وحجم الخلية لرسم البوابات في النهاية حول مجموعة الخلايا المطلوبة مع استبعاد أي حطام خلوي.
      ملاحظة: يساعد FSC على تمييز الخلايا على أساس الحجم ، مما يسمح للمستخدمين بالتمييز بين خلايا الجهاز المناعي ، مثل الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية ؛ الوحيدات أكبر وتظهر كثافة FSC أعلى مقارنة بالخلايا الليمفاوية.
    8. احصل على ما يقرب من 5000 MoDC حي ، و 50000 خلية ليمفاوية حية ، و 50000 حدث وحيد حي.
    9. بمجرد ضبط جميع المعلمات بالإشارة إلى عينة التحكم السلبية ، انقر فوق إيقاف ، واحفظ البروتوكول.
    10. الآن قم بتحميل جميع العينات على اللودر متعدد الأنابيب. حدد كل عينة في قائمة العمل، وقم بتطبيق المعلمات المعدلة بالرجوع إلى عنصر التحكم السلبي على جميع العينات داخل التجربة. انقر فوق الخيار اكتساب للسماح بتشغيل جميع العينات في التجربة على التوالي.
    11. بمجرد الحصول على البيانات من جميع العينات ، احفظها وتحويلها إلى بيانات قابلة للقراءة باستخدام برنامج تحليل بيانات مناسب يسمح بإنشاء رسوم بيانية متسلسلة ثنائية المعلمات وأحادية المعلمات.

6. تحليل تعبير الحمض النووي الريبي رسول (mRNA)

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    ملاحظة: استخرج الحمض النووي الريبي الكلي من المزرعة المشتركة MoDC-lymphocyte النبضية للمستضد (محددة) ، والاستزراع المشترك MoDC-lymphocyte غير النبضي للمستضد (غير محدد) ، وثقافة الخلايا الليمفاوية بدون MoDCs (التحكم) ، ومن الخلايا الليمفاوية الساذجة (خلايا CD14− المعزولة قبل الزراعة المشتركة). لاستخراج الحمض النووي الريبي ، قم بإعداد الإيثانول باستخدام الماء الخالي من RNase. ارجع إلى جدول المواد للحصول على تفاصيل حول مجموعة الاستخراج والكواشف.
    1. نقل 1 مل من تعليق الخلية من لوحة الاستزراع المشترك MoDC-lymphocyte (~ 1 × 106 خلايا / مل) إلى أنبوب معقم معقم 1.5 مل باستخدام ماصة ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 500 × جم.
    2. احفظ الطافي ل ELISA. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من PBS ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. اجمع أي خلايا متبقية باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 500 × غرام.
      ملاحظة: يجب التعامل مع جميع العينات بدقة كخلايا حية حتى يتم إجراء تحلل الخلية باستخدام المخزن المؤقت للتحلل الموجود في المجموعة. يطلق موت الخلايا RNases التي تحلل بسرعة قوالب الحمض النووي الريبي اللازمة للقياس الكمي في اتجاه مجرى النهر. يقوم المخزن المؤقت RLT بتحليل الخلايا في محلول يثبط RNases.
    4. أضف 350 ميكرولتر من محلول التحلل إلى كل بئر فارغ ، واحتضنها لمدة 2-3 دقائق لتحلل الخلايا الملتصقة التي لم يتم حصادها في الخطوات السابقة.
    5. بمجرد اكتمال الطرد المركزي في الخطوة 6.1.3 ، تخلص من المادة الطافية ، وادمج حبيبات الخلية مع 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المضاف في الخطوة 6.1.4.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، من الممكن تخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية أو متابعة استخراج الحمض النووي الريبي (الخطوات التالية).
    6. ماصة 350 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ إلى المحللة في الخطوة 6.1.5. الحجم النهائي لكل عينة هو 700 ميكرولتر.
    7. أدخل عمود الاستخراج داخل أنبوب تجميع سعة 2 مل (مرفق مع المجموعة).
    8. نقل 700 ميكرولتر من العينة لكل عمود استخراج ، وأجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 15 ثانية. تخلص من التدفق في أنبوب التجميع ، وضعه مرة أخرى في عمود الدوران.
    9. في عمود الاستخراج ، أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت الصارم للغسيل (متوفر في المجموعة) ، وأجهزة الطرد المركزي بأكثر من 10000 × جم لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق.
    10. أضف 80 ميكرولتر من مزيج حضانة DNase I لكل عينة على غشاء عمود الاستخراج ، واتركه يتماسك لمدة 15 دقيقة عند 20-30 درجة مئوية.
      ملاحظة: لتحضير مزيج حضانة DNase I لكل عينة ، أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون DNase I إلى 70 ميكرولتر من المخزن المؤقت DNase لحجم نهائي يبلغ 80 ميكرولتر. تخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات ، متبوعا بدوران قصير في جهاز الطرد المركزي.
    11. اغسل عمود الاستخراج ب 350 ميكرولتر من محلول الغسيل الصارم ، متبوعا بالطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 15 دقيقة. تخلص من التدفق في أنبوب التجميع بعد الطرد المركزي.
    12. اغسل عمود الاستخراج 2x ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المعتدل في كل مرة وبالطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 15 ثانية ومرة ثانية لمدة دقيقتين. تخلص من التدفق بعد كل طرد مركزي.
    13. أجهزة الطرد المركزي العمود بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة لتجفيف الغشاء ، وتجاهل أنبوب التجميع.
    14. ضع عمود الاستخراج في أنبوب تجميع جديد سعة 1.5 مل.
    15. ماصة 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase على غشاء العمود ، واحتضانها لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: بالنسبة لتركيزات الحمض النووي الريبي التي تقل عن 100 نانوغرام ، قم بتقليل حجم الشطف إلى 30 ميكرولتر ، وأعد إزالة غشاء عمود الاستخراج باستخدام المنتج من الشطف الأول لتركيز المنتج النهائي.
    16. أجهزة الطرد المركزي في 10000 × غرام لمدة 1 دقيقة لاستئصال الحمض النووي الريبي.
    17. قياس تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق الكشف عن الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام 0.5-2 ميكرولتر من العينة. اضبط تركيز الحمض النووي الريبي النهائي على 0.1-1 ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام الماء الخالي من RNase.
    18. قم بتخزين حصص الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  2. تخليق الحمض النووي التكميلي
    1. توليف الحمض النووي التكميلي (cDNA) من قالب الحمض النووي الريبي المستخرج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة المرفق مع المجموعة (راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل).
      ملاحظة: يرد ملخص للكواشف والأحجام المستخدمة في الجدول 1 والجدول 2. ويرد بروتوكول كامل بالتفصيل في الملف التكميلي 1.
  3. تفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الحقيقي
    1. بالنسبة إلى qPCR ، قم بتشغيل عينات cDNA في ثلاث نسخ. تحديد مستويات نسخ mRNA البقري ل Ki-67 و IFN-γ باستخدام مجموعات أولية محددة في إشارة إلى جين GAPDH ، كما هو موضح في الجدول 3.
      ملاحظة: تم تفصيل بروتوكول كامل في الملف التكميلي 1.

7. مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم

  1. معالجة طافات الاستزراع المجمعة الغنية بالبروتينات الإفرازية لتحديد كمية IFN-γ من خلال ELISA.
    ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على تفاصيل حول استخدام المجموعة. ويرد بروتوكول كامل بالتفصيل في الملف التكميلي 1.

8. التحليل الإحصائي

  1. تحليل البيانات ، وجعل الرسوم التوضيحية الرسومية للتصميم التجريبي باستخدام البرامج التجارية. استخدم اختبارا غير معلمي غير مزاوج للتحليل المقارن. ضع في اعتبارك أن قيم P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تصف هذه المنهجية الجيل المختبري من MoDCs الماشية لتقييم مستضدات اللقاح المرشحة قبل إجراء الدراسات في الجسم الحي. يوضح الشكل 1 المخطط التجريبي لتوليد MoDC البقري وتطبيق MoDCs للفحص في المختبر. باستخدام تقنية فرز الخلايا القائمة على المغناطيسية ، كان من الممكن جمع م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

توضح هذه الدراسة طريقة موحدة في المختبر لتوليد وتنميط MoDCs البقري واستخدامها لاحقا في قياس مناعة اللقاح للقاح تجاري (على سبيل المثال ، RV). يمكن استخدام MoDCs البقرية كأداة لفحص مستضدات اللقاح المحتملة ضد أمراض الماشية والتنبؤ بتأثيرها السريري المحتمل بناء على الاستجابات المناعية قبل ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

ونشكر الدكتورة إيفلين ووداك والدكتورة أنجيليكا لويستش (AGES) على دعمهما في تحديد الحالة الصحية للحيوانات وعلى توفير لقاح BTV، والدكتور برنارد رينيلت على توفير دم الأبقار، والدكتور بهاراني سيتيبالي والدكتور ويليام دندون من الوكالة على المشورة المفيدة بشأن تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي وتحرير اللغة، على التوالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ACK Lysing BufferGibco, Thermo FisherA1049201Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin TubesBecton, Dickinson (BD) and Company36648010 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth KitBio-Rad, UKPBP015KZZCytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA KitBio-RadMCA5638KZZKit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 AntibodyBio-RadMCA2678FMouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 AntibodyBio-RadMCA2430PEMouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 AntibodyBio-RadMCA1653A647Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 AntibodyBio-RadMCA2431FMouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 AntibodyBio-RadMCA837FMouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 AntibodyBio-RadMCA2437PEMouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad-Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge TubeFalcon Corning 352096 & 35207015 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm PlusBD Bio Sciences555028Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
EthanolSigma Aldrich1009832500Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher10500064Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUSGE Health care Life Sciences, USA341691Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning AgentBeckman Coulter, Life SciencesA64669500 mL
FlowJoFlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA-Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) TubeFalcon Corning 3522355 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-DextranSigma Aldrich, Germany60842-46-8FITC-dextran MW
Gallios Flow CytometerBeckman Coulter-Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR PlatesBio-RadHSP960196 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeadsMiltenyi Bioteck, Germany130-050-2012 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
KaluzaBeckman Coulter, Germany-Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS ColumnMiltenyi Bioteck, Germany130-042-401Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic AntibodyBio-RadMCA2228FMouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge TubeSigma AldrichHS43251.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power PointMicrosoft-The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 AntibodyBio-RadMCA928FIsotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 AntibodyBio-RadMCA928PEIsotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 AntibodyBio-RadMCA928PEIsotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II AntibodyBio-RadMCA929FIsotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac RabiesMSD Animal Health, UK-1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical sealsBi0-RadTCS08030.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-StreptomycinGibco, Thermo Fisher15140122100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS)Gibco, Thermo Fisher10010023pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software Dotmatics-Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibodyBiolegend, USA350501Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl AntibodyBiolegend400101Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium IodideBD Bio Sciences1351101Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 ProteinR&D System, USA202-IL-010/CFInterleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini KitQiagen74106Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 MediumSigma AldrichR8758Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art Les Laboratories Servier-Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-52702x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemInvitrogen, Thermo Fisher18080051Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24TPP, Switzerland9202424 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue SolutionGibco, Thermo Fisher152500610.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen, Thermo Fisher109770230.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection TubesThermo Fisher Scientific15206067VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
WaterSigma AldrichW3500-1LSterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

References

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502(2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424(2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214(2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72(2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215(2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112(2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132(2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369(2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252(2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved