JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Методология описывает генерацию дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота (MoDC), и их применение для оценки in vitro антигенных кандидатов при разработке потенциальных ветеринарных вакцин для крупного рогатого скота.

Аннотация

Дендритные клетки (ДК) являются наиболее мощными антигенпрезентирующими клетками (АПК) в иммунной системе. Они патрулируют организм в поисках патогенов и играют уникальную роль в иммунной системе, связывая врожденные и адаптивные иммунные реакции. Эти клетки могут фагоцитировать, а затем представлять захваченные антигены эффекторным иммунным клеткам, вызывая широкий спектр иммунных реакций. В этой статье демонстрируется стандартизированный метод получения in vitro дендритных клеток (MoDC) из моноцитов крупного рогатого скота, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови крупного рогатого скота (PBMC), и их применение для оценки иммуногенности вакцины.

Магнитная сортировка клеток использовалась для выделения моноцитов CD14+ из PBMC, а добавление полной питательной среды интерлейкином (IL)-4 и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) использовалось для индукции дифференцировки моноцитов CD14+ в наивные MoDC. Генерация незрелых MoDC была подтверждена детекцией экспрессии основных маркеров клеточной поверхности комплекса гистосовместимости II (MHC II), CD86 и CD40. Коммерчески доступная вакцина против бешенства использовалась для импульсирования незрелых MoDC, которые впоследствии культивировались совместно с наивными лимфоцитами.

Анализ проточной цитометрии антиген-импульсных MoDC и кокультуры лимфоцитов выявил стимуляцию пролиферации Т-лимфоцитов за счет экспрессии маркеров Ki-67, CD25, CD4 и CD8. Анализ экспрессии мРНК ИФН-γ и Ki-67 с помощью количественной ПЦР показал, что MoDC могут индуцировать антиген-специфический прайминг лимфоцитов в этой системе кокультурирования in vitro . Кроме того, секреция ИФН-γ, оцененная с помощью ИФА, показала значительно более высокий титр (**p < 0,01) в кокультуре MoDC-лимфоцитов с импульсной вакциной против бешенства, чем в кокультуре неантиген-импульсных MoDC-лимфоцитов. Эти результаты показывают достоверность этого анализа in vitro MoDC для измерения иммуногенности вакцины, что означает, что этот анализ может быть использован для выявления потенциальных кандидатов на вакцину для крупного рогатого скота, прежде чем приступить к испытаниям in vivo , а также при оценке иммуногенности вакцин коммерческих вакцин.

Введение

Ветеринарная вакцинация представляет собой важнейший аспект животноводства и здравоохранения, поскольку она способствует повышению продовольственной безопасности и благополучия животных, обеспечивая защиту от болезней, поражающих животноводческий сектор во всем мире1. Эффективный метод in vitro для оценки иммуногенности возможных вакцин-кандидатов поможет ускорить процесс разработки и производства вакцины. Поэтому необходимо расширить область иммунных анализов инновационными методологиями, основанными на исследованиях in vitro , поскольку это поможет раскрыть сложность иммунных процессов, связанных с иммунизацией и патогенной инфекцией. В настоящее время для измерения иммуногенности вакцин-кандидатов и адъювантов используются иммунизация животных in vivo , которые требуют периодического отбора проб (например, крови и селезенки). Эти анализы являются дорогостоящими, трудоемкими и имеют этические последствия, потому что в большинстве случаев эвтаназия животных проводится к концу испытаний.

В качестве альтернативы анализам in vivo мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) использовались для оценки иммунных реакций, индуцированных вакциной, in vitro2. PBMC представляют собой гетерогенную популяцию клеток, состоящую из 70-90% лимфоцитов, 10-20% моноцитов и ограниченного числа дендритных клеток (DC, 1-2%)3. PBMC содержат антигенпрезентирующие клетки (APC), такие как В-клетки, моноциты и ДК, которые постоянно патрулируют организм в поисках признаков инфекции или повреждения тканей. Локально секретируемые хемокины облегчают рекрутирование и активацию APC в этих участках путем связывания с рецепторами клеточной поверхности. В случае моноцитов хемокины направляют свою судьбу либо на дифференцировку в ДК, либо на макрофаги4. Как только ДК сталкиваются с патогеном и захватывают его, они мигрируют во вторичные лимфоидные органы, где они могут представить обработанные пептидные антигены патогена с использованием поверхностных белков основного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II CD8+ Т-клеткам CD8+ или CD4+ Т-клеткам, соответственно, вызывая иммунный ответ 5,6.

Ключевая роль, которую играют ДК в организации защитного иммунного ответа против различных патогенов, делает их интересной исследовательской мишенью для понимания внутриклеточных иммунных механизмов, особенно при разработке вакцин и адъювантов против инфекционных агентов7. Поскольку доля ДК, которые могут быть получены из PBMC, довольно мала (1% -2%), моноциты вместо этого использовались для генерации ДК in vitro8. Эти моноцитарные ДК (MoDC) были первоначально разработаны в качестве возможной стратегии лечения в иммунотерапии рака9. Совсем недавно MoDC использовались для исследований вакцин 10,11,12, а классические моноциты являются преобладающим подтипом (89%) для производства MoDC 13. Продуцирование MoDC in vitro ранее достигалось путем добавления гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), вводимого в сочетании с другими цитокинами, такими как интерлейкин-4 (IL-4), фактор некроза опухоли α (TNF-α) или IL-1314,15,16.

Успех анализа MoDC in vitro зависит от способности стимулированных антигеном зрелых MoDC модулировать степень и тип иммунного ответа, специфичного для типа обнаруженного антигена17. Тип патогена, распознаваемый и представленный MoDC, определяет дифференцировку CD4+ Т-хелперных (Th) клеток в эффекторные клетки Th1, Th2 или Th17 и характеризуется патоген-специфическим секреторным цитокиновым профилем. Ответ Th1 вызывается против внутриклеточных патогенов и приводит к секреции интерферона-гамма (ИФН-γ) и фактора некроза опухоли бета (ФНО-β), который модулирует фагоцитарно-зависимую защиту. Ответ Th2 запускается против паразитических организмов и характеризуется секрецией IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13, которая инициирует фагоцитарно-независимую гуморальную защиту. Th17 обеспечивает нейтрофил-зависимую защиту от внеклеточных бактериальных и грибковых инфекций, опосредованных секрецией IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 и TNF-α 18,19,20,21. Основываясь на предыдущих исследованиях, было отмечено, что не все патогены попадают в ожидаемый цитокиновый профиль. Например, кожные МДК в ответ на паразитарную инфекцию лейшмании стимулируют секрецию ИФН-γ из CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток, тем самым индуцируя защитный провоспалительный ответ Th122.

Также было показано, что у куриных МДК, заправленных липополисахаридом сальмонеллы (ЛПС), может индуцировать переменный ответ против Salmonella typhimurium, активируя как Th1, так и Th2 ответы, тогда как Salmonella gallinarum индуцирует только ответ Th2, что может объяснить более высокую резистентность последних к клиренсуMoDC 23. Активация MoDC против Brucella canis (B. canis) также была зарегистрирована как у собак, так и у человека, что означает, что это может представлять собой механизм зоонозной инфекции24. MoDC человека, примированные B. canis, индуцируют сильный ответ Th1, который придает устойчивость к тяжелой инфекции, тогда как MoDC собак индуцируют доминирующий ответ Th17 со сниженным ответом Th1, что впоследствии приводит к установлению хронической инфекции25. MoDC крупного рогатого скота демонстрируют повышенное сродство к вирусу ящура (FMDV), конъюгированному с иммуноглобулином G (IgG), по сравнению с одним неконъюгированным ящуром, поскольку MoDC образуют комплекс вирус-антитело в ответ на первые10. Взятые вместе, эти исследования показывают, как MoDC использовались для анализа сложности иммунных реакций во время патогенной инфекции. Адаптивные иммунные реакции могут быть оценены путем количественного определения специфических маркеров, связанных с пролиферацией лимфоцитов. Ki-67, внутриклеточный белок, обнаруживаемый только в делящихся клетках, рассматривается как надежный маркер для исследований пролиферации26, и аналогичным образом CD25, экспрессируемый на поверхности Т-клеток во время поздней фазы активации, соответствует пролиферации лимфоцитов27,28.

В этом исследовании демонстрируется стандартизированный метод получения МДК крупного рогатого скота in vitro с последующим их применением в иммуноанализе in vitro, используемом для тестирования иммуногенности вакцин. Коммерчески доступная вакцина против бешенства (RV) использовалась для подтверждения эффективности этого анализа. Активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов измеряли с помощью проточной цитометрии, количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) путем анализа хорошо известных маркеров активации клеток, таких как Ki-67 и CD25, и секреции ИФН-γ 28,29,30,31. Во время анализа MoDC экспериментальные испытания на животных или людях не проводятся.

протокол

Забор крови осуществляется сертифицированной ветеринарной службой в соответствии с этическими принципами Австрийского агентства по здравоохранению и безопасности пищевых продуктов (AGES) и в соответствии с принятыми стандартами благополучия животных32. Исследование получило этическое одобрение Министерства сельского хозяйства Австрии. Экспериментальный план генерации МРЦ и его последующее применение проиллюстрированы на рисунке 1.

1. Производство наивных МДК

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы цельной крови были получены от одного теленка, не содержащего патогенов, путем пункции яремной вены гепаринизированными вакутейнерами (для этого исследования использовались восемь пробирок с кровью по 9 мл). Транспортируйте кровь в ящике со льдом. Храните образцы при температуре 2-4 °C для последующего использования или немедленно обрабатывайте их. Следите за тем, чтобы кровь вращалась, чтобы избежать свертывания крови. Стерилизуйте вакуумеры 70% этанолом. Все последующие эксперименты проводились с одним биологическим образцом и шестью техническими репликами.

  1. Центрифугирование в градиенте плотности для выделения PBMC из гепаринизированной крови
    1. Хорошо перемешайте кровь, перевернув ее в 10 раз.
    2. С помощью пипетки объемом 10 мл переведите 20 мл гепаринизированной крови в стерильную пробирку объемом 50 мл и разбавьте ее 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
    3. Пипеткой 15 мл выделительной среды лимфоцитов в стерильную пробирку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте среде, изолирующей лимфоциты, достичь комнатной температуры перед пипеткой.
    4. Наклоните пробирку объемом 50 мл, содержащую среду для выделения лимфоцитов, в положение 45°. Направьте кончик пипетки объемом 25 мл перпендикулярно и аккуратно наложите 30 мл PBS крови поверх среды для выделения лимфоцитов, не смешивая их. Очень медленно верните пробирку объемом 50 мл в вертикальное положение.
    5. Центрифуга при 800 × g в течение 35 мин при 20 °C с максимальным ускорением и без торможения (функция замедления отключена).
    6. Используйте пипетку Пастера, чтобы собрать слой PBMC (тонкий белый слой сразу после первого слоя плазмы) и перенести его в новую пробирку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование с градиентом плотности разделяет цельную кровь на разные слои. В результате эритроциты оседают на дне в виде гранулы, мононуклеарные клетки (PBMC) оседают на границе раздела слоев, а плазма образует верхний слой. Гранулоциты находятся между гранулой и слоем PBMC.
    7. Вымойте собранные PBMC 2 раза, добавив PBS до объема 40 мл и тщательно перемешав, пипеткой вверх и вниз. Затем центрифугу при 500 × g при 4 °C в течение 7 мин с максимальным ускорением и максимальным замедлением.
    8. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации, ресуспендируйте гранулу в 15 мл 1x буфера из хлорида аммония и калия (ACK) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10-15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не инкубируйте более 15 минут. Коммерчески доступный буфер ACK используется для обеспечения лизиса остаточных эритроцитов (эритроцитов), присутствующих во фракции PBMC.
    9. Добавьте PBS до объема 40 мл, а затем центрифугу при 500 × g и 4 °C в течение 7 мин с максимальным ускорением и замедлением.
    10. Удалите надосадочную жидкость путем декантации и повторите шаг 1.1.9.
    11. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 10 мл полной питательной среды (при комнатной температуре).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полная питательная среда состоит из среды для культивирования клеток RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина.
  2. Магнитная сепарация клеток CD14+/- из популяции PBMC с использованием CD14-сопряженных магнитных шариков
    1. Подсчитайте клетки с помощью чистого счетчика клеток гемоцитометра, используя 10 мкл клеточной суспензии, смешанной с 10 мкл раствора трипанового синего (0,4%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель трипановый синий является токсичным химическим веществом и потенциальным канцерогеном. С ним следует обращаться в средствах индивидуальной защиты (СИЗ), чтобы избежать контакта, а отходы следует выбрасывать в герметичный специализированный контейнер для токсичных отходов. Мертвые клетки будут казаться синими, тогда как живые клетки будут казаться прозрачными под микроскопом.
    2. Центрифуга в течение 7 мин по 500 × г.
    3. Откажитесь от надосадочной жидкости с помощью пипетки и ресуспендируйте гранулу в буфере для сортировки клеток, активированном флуоресценцией (FACS), используя объем 40 мкл на каждые 1 × 107 клеток. Тщательно перемешайте с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS состоит из 2% FBS и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), растворенных в PBS.
    4. Добавьте 5 мкл буфера для микрогранул CD14 на 1 ×10-7 клеток и тщательно перемешайте с помощью пипетки.
    5. Инкубировать в течение 30 мин при 4-8 °C для положительного отбора CD14+ моноцитов крупного рогатого скота33. Вихрь каждые 15 мин в течение инкубационного периода.
    6. Необязательный этап (для проточного цитометрического анализа): Добавьте 10 мкл антитела для окрашивания CD14-FITC (флуоресцеинизотиоцианат) с последующей инкубацией в течение 15 мин при 4-8 °C. Подробности см. в анализе проточной цитометрии на шаге 5.
    7. Добавьте 1 мл буфера FACS и центрифугу в течение 7 мин при 500 × г.
    8. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл буфера FACS на 1 × 108 клеток.
    9. Вставьте колонку для разделения иммуномагнитных клеток в сепаратор (держатель магнитной колонки) и поместите пробирку для сбора объемом 15 мл под выходное отверстие колонки для сбора проточного потока.
    10. Промойте колонку 1 мл дегазированного буфера FACS. После полоскания замените использованную пробирку объемом 15 мл на новую.
    11. Дайте суспензии клеток (из шага 1.2.8) пройти через колонку, пипетируя 1 × 108 клеток в 500 мкл буфера за раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на то, чтобы не образовывались пузырьки воздуха при смешивании ячеек, прежде чем пропускать их через колонку.
    12. Каждый раз промывайте колонку 3 раза 3 мл дегазированного буфера FACS.
    13. Соберите проточный слой и пометьте эту первую элюированную фракцию как фракцию клеток CD14- (PBMC минус моноциты CD14+ ); Это также называется наивной фракцией лимфоцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки CD14- выдерживают в полной питательной среде до тех пор, пока не будут получены импульсные антигенные MoDC.
    14. Снимите колонну с разделителя.
    15. Поместите новую стерильную пробирку объемом 15 мл под колонку для сбора сточных вод.
    16. Пипеткой 5 мл буфера FACS введите в колонку и сразу же протолкните ее с помощью поршня.
    17. Соберите проточную часть и пометьте эту вторую элюированную фракцию как клеточную фракцию CD14+ ; Это также называется наивной фракцией моноцитов.
    18. Добавьте полную питательную среду к собранным моноцитам CD14+ , чтобы получить 1 × 106 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте живые клетки в элюированной клеточной фракции CD14+ , чтобы оценить объем полной питательной среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток.
    19. Возьмите стерильную 24-луночную пластину и добавьте 1 мл клеточной суспензии (1 × 106 клеток/мл) в каждую лунку.
  3. Дифференцировка CD14+ наивных моноцитов в наивные MoDC путем добавления 3% мас./в. цитокинового коктейля (GM-CSF + IL-4) в общей сложности 5 дней инкубации
    1. Дополните каждую лунку, содержащую моноциты CD14+ , 40 мкл (3% мас./об.) цитокинового коктейля, входящего в комплект.
    2. Инкубируйте планшет в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 и при 37 ° C в течение 48 часов.
    3. На 2-й день перенесите половину содержимого каждой лунки (500 мкл) с помощью пипетки в отдельные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугу при 500 × г при 4 ° C в течение 7 мин.
    4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл свежей полной питательной среды.
    5. Перенесите 500 мкл этой клеточной суспензии с этапа 1.3.4 обратно в каждую назначенную лунку так, чтобы конечный объем составил 1 мл.
    6. Обогатите каждую лунку 20 мкл цитокинового коктейля.
    7. Инкубируют культуру в течение 72 ч в увлажненном инкубаторе с 5%СО2 и при 37 °C.
    8. После инкубации на 5 день достаньте тарелку из инкубатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лунка будет содержать 1 мл клеточной суспензии наивных MoDC. Количество MoDC будет составлять процент (~ 20%) от исходных моноцитов (1 × 106 / мл).

2. Анализ эндоцитарной активности MoDC

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ поглощения антигена или анализ эндоцитарной активности измеряет способность наивных MoDC усваивать чужеродный материал. Проводят анализ с использованием наивных MoDC, культивируемых с 3% коктейлем цитокинов по массе и с 5-дневной инкубацией, как описаноранее 34.

  1. Соберите наивную клеточную суспензию MoDC с 24-луночной пластины и перенесите ее в пробирку объемом 15 мл; также соберите остатки ячеек, промыв лунки PBS.
  2. Центрифуга по 500 × г в течение 7 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл питательной среды с добавлением 1% FBS.
  3. Подсчитайте живые клетки MoDC, чтобы оценить объем среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток (2 × 10,5 клеток/мл).
  4. Культивируйте наивные МОДы в 100 мкл полной питательной среды в 24-луночном планшете с конечной концентрацией клеток 2 × 10,5 клеток/мл.
  5. Дополните каждую лунку 1 мг / мл FITC-конъюгированного декстрана (флуоресцентный зонд, используемый в качестве индикатора эндоцитоза).
    ПРИМЕЧАНИЕ: FITC-декстран действует как флуоресцентный зонд и используется в качестве индикатора эндоцитоза.
  6. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте в темноте при 5%CO2 и 37 °C в течение 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для фонового контроля инкубируйте дополнительные клетки MoDC (2 × 105 клеток / мл) с 1 мг / мл FITC-декстрана на льду, так как этот тип инкубации предотвращает проникновение молекулы-индикатора (FITC-декстран) в клетки.
  7. После инкубации немедленно перенесите 24-луночную пластину на лед, чтобы остановить эндоцитоз FITC-декстрана.
  8. Промойте ячейки ледяным буфером FACS.
  9. Соберите, центрифугу и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл буфера FACS.
  10. Проанализируйте интенсивность флуоресценции FITC-декстрана в клетках с помощью проточной цитометрии. Подробности см. в анализе проточной цитометрии на шаге 5.2.

3. Генерация антиген-импульсных МОД

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступная и клинически одобренная вакцина против вируса бешенства (RV) может индуцировать дифференцировку наивных MoDC в зрелые антигенпрезентирующие MoDC. Используйте 0,1% (~ 1 мкл) одной дозы вакцины против автофургона для получения импульсных антигенных МОДК. Кроме того, предпочтительно производить RV-импульсные MoDC на той же культуральной пластине, которая использовалась (на этапе 1.3.8) для генерации наивных MoDC, поскольку перенос наивных MoDC на новую 24-луночную пластину отрицательно повлияет на них.

  1. Начиная с шага 1.3.8) Добавьте 1 мкл/мл суспензии RV к 1 мл наивной культуры MoDC в 24-луночном планшете и инкубируйте в течение 48 ч при 5%CO2 и 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наивные MoDC, культивируемые без стимуляции RV, используются в качестве фонового контроля (и в качестве неспецифической стимуляции для совместного культивирования с лимфоцитами на следующих этапах).
  2. После инкубации, на 7-й день, держите 24-луночную пластину, содержащую антиген-импульсные MoDC, на льду в течение 10 минут.
  3. Добавьте 1 мл ледяного PBS на лунку. Тщательно перемешайте каждый из них с помощью пипетки и перелейте суспензию в пробирку объемом 15 мл.
  4. Промойте лунки 2 мл ледяного PBS, чтобы собрать остаточные клетки, оставшиеся в каждой лунке.
  5. Переложите содержимое в соответствующие пробирки и центрифугируйте клеточную суспензию при 500 × г в течение 7 мин.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клеточную гранулу (антиген-импульсные MoDC) в полной питательной среде и отрегулируйте объем до конечной клеточной концентрации 1 × 10-5 клеток / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте живые клетки, чтобы оценить объем среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток. Используйте RV-импульсные MoDC с 7-го дня для системы совместного культивирования MoDC-лимфоцитов.

4. Кокультура MoDC-лимфоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Система совместного культивирования MoDC-лимфоцитов in vitro определяет способность MoDC праймировать антиген-специфические лимфоциты. Различные группы лечения клеток после 16 дней совместного культивирования включают специфические, неспецифические и контрольные. Специфическая группа определяется как лимфоциты, культивируемые совместно с RV-импульсными MoDC; неспецифическая группа определяется как лимфоциты, культивируемые совместно с неантиген-импульсными MoDC; а контрольная группа определяется как лимфоциты, культивируемые без MoDC.

  1. Добавьте полную питательную среду к элюированной фракции наивных лимфоцитов (CD14-клетки) для достижения клеточной концентрации 2 × 106 клеток / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте живые клетки в культуре клеток CD14-, которые поддерживались в полной питательной среде в 24-луночном планшете с момента их сбора, чтобы оценить объем среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток.
  2. На 7-й день возьмите стерильную 24-луночную пластину и засейте лунки 1 мл наивной клеточной суспензии лимфоцитов (2 × 106 клеток / мл) плюс 1 мл антиген-импульсной или неантиген-импульсной суспензии MoDC (1 × 105 клеток / мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем в каждой лунке составит 2 мл с соотношением MoDCs 1:20 к лимфоцитам на лунку.
  3. Инкубировать пластину в течение 48 ч при 37 °C и 5%CO2.
  4. Обогащение культуры и рестимуляция антиген-импульсными МОДК
    1. После инкубации кокультуры антиген-импульсных MoDC-лимфоцитов на 9-й день дополните каждую лунку 20 нг/мл рекомбинантного IL-2 и продолжайте инкубацию еще 120 ч (5-дневная инкубация).
    2. На 14-й день переносят 1 мл сокультуры в стерильную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугу при дозе 500 × г в течение 7 мин.
    3. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клеточную гранулу 1 мл антиген-импульсных или неимпульсных MoDC (1 ×10,5 клеток/мл). Аккуратно перемешайте пипеткой и перенесите клеточные суспензии обратно в назначенные лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе общий объем в каждой лунке составляет 2 мл.
    4. Продолжайте инкубацию при 5% CO2 и 37 ° C в течение 48 часов. После инкубации на 16-й день совместная культура готова к анализу с помощью проточной цитометрии, кПЦР и ИФА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На каждые 2 мл в каждой лунке кокультуры MoDC-лимфоцитов 1 мл ресуспендированных клеток окрашивают для проточной цитометрии, 1 мл используют для экстракции РНК, а надосадочные жидкости из обоих используют для ИФА.

5. Проточный цитометрический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивайте клетки соответствующими маркерами / mAb перед запуском образцов на проточном цитометре. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о реагентах (окрашивание mAb и контроль изотипа), наборе, инструменте и программном обеспечении, используемых для анализа проточной цитометрии.

  1. Протокол окрашивания проточного цитометра
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните окрашивание клеточной поверхности для PBMC и наивных лимфоцитов и моноцитов с использованием анти-CD14 mAb (этап 1.2.6). Для окрашивания клеточной поверхности наивных MoDC используйте анти-CD86-специфический, анти-CD40-специфический и анти-MHC II-специфический mAb. Для окрашивания клеточной поверхности клеток с 16-го дня кокультур используют анти-CD4, анти-CD8, анти-CD25 mAbs; для внутриклеточного окрашивания используют анти-Ki-67 mAb. Кроме того, окрашивайте клетки либо с отрицательным контролем изотипа mAb, либо без mAb (FMO: флуоресцентный минус один). Основное различие при окрашивании на поверхностные и внутриклеточные маркеры заключается в том, что для маркеров клеточной поверхности клетки должны быть окрашены специфическим поверхностным mAb перед окрашиванием живых/мертвых (L/D) или любыми другими процессами. Однако внутриклеточное окрашивание выполняется после окрашивания L/D и требует фиксации плюс этап пермеабилизации, чтобы обеспечить внутриклеточное проникновение.
    1. 1 мл клеточной суспензии переносят в стерильную пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки и центрифугу в течение 10 мин при дозе 500 × г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования при обработке клеток из кокультуры MoDC-лимфоцитов сохраняют надосадочную жидкость для ИФА-анализа.
    2. Ресуспендируют гранулу в 1 мл PBS и переносят ее в пробирку объемом 15 мл. Соберите остаточные клетки, используя 1 мл PBS, и объедините его с ресуспендированными гранулами.
    3. Добавьте 10 мл PBS в пробирку объемом 15 мл, содержащую клетки, перемешайте пипеткой и центрифугу в течение 7 мин при 850 x g.
    4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите шаг 5.1.3.
    5. Выбросьте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу с остаточной суспензией (примерно 180 мкл), оставшейся после декантации надосадочной жидкости.
    6. Перенесите суспензию ячейки на пластину с V-образным дном на 96 лунок и загерметизируйте лунки, чтобы избежать просыпания.
    7. Центрифугируйте пластину при дозе 1 400 × г в течение 5 мин. После центрифугирования проведите тарелкой по контейнеру для отходов, чтобы опорожнить лунки с жидкостью, и постучите пластиной по впитывающей бумаге, чтобы обеспечить удаление лишней жидкости.
    8. Добавьте 25 мкл мастер-смеси для окрашивания поверхности на лунку и аккуратно перемешайте с помощью пипетки с последующей инкубацией при 4 ° C в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить мастер-смесь для окрашивания поверхности для одной лунки, добавьте 2,5 мкл поверхностного mAb к 20 мкл буфера FACS.
    9. Добавьте 200 мкл буфера FACS на лунку и центрифугу при 1,400 × г в течение 5 мин. После центрифугирования опорожните лунки от жидкости путем декантации и постучите пластиной по впитывающей бумаге, чтобы удалить лишнюю жидкость.
    10. Добавьте 100 мкл раствора для окрашивания L/D на лунку. Тщательно перемешать с помощью пипетки с последующей инкубацией при 4 °C в течение 15 мин в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для одной лунки растворите 0,25 мкл красителя L/D в 100 мкл буфера FACS. Краситель L/D помогает различать живые и мертвые клетки.
    11. Добавьте 100 мкл буфера FACS. Накройте лунки крышкой и центрифугируйте тарелку на 1 400 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите тарелкой по впитывающей бумаге.
    12. Повторите шаг 5.1.11.
    13. Добавьте 50 мкл фиксирующего раствора на лунку (входит в комплект) и перемешайте пипеткой перед инкубацией пластины при комнатной температуре в темноте в течение 10 мин.
    14. Добавьте 150 мкл 1x буфера для пермеабилизации-промывки (PW), входящего в комплект, и накройте лунки крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить 10 мл буфера 1x PW, разбавьте 1 мл 10x буфера для химической завивки в 10 мл dH2O.
    15. Центрифугируют планшет при концентрации 1 400 × г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите тарелкой по впитывающей бумаге.
    16. Добавьте 200 мкл 1x PW с последующим центрифугированием при 1,400 × г в течение 5 мин при 4 ° C. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите тарелкой по впитывающей бумаге.
    17. Для внутриклеточного окрашивания добавьте 25 мкл мастер-смеси для внутриклеточного окрашивания (античеловеческий Ki-67 mAb) на лунку. Хорошо перемешайте и выдержите тарелку в течение 30 минут при температуре 4 °C или на льду в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить мастер-смесь для внутриклеточного окрашивания для одной лунки, добавьте 1 мкл Ki-67 mAb к 24 мкл 1x PW. Маркер внутриклеточного окрашивания используется только при обработке клеток с 16-го дня совместной культуры. Внутриклеточное окрашивание не проводится при обработке PBMC, наивных лимфоцитов, моноцитов и наивных MoDC.
    18. После инкубации добавьте 200 мкл 1x PW в каждую лунку. Смешайте пипеткой и центрифугой по 1 400 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите тарелкой по впитывающей бумаге.
    19. Добавляют 200 мкл буфера FACS с последующим центрифугированием при 1 400 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, сцедив ее, и постучите тарелкой по впитывающей бумаге.
    20. Ресуспендируют клеточную гранулу в 200 мкл буфера FACS и переносят содержимое каждой лунки в отдельные стерильные проточные проточные пробирки. Используйте 300 мкл буфера FACS на лунку для сбора остаточных ячеек. Теперь клетки готовы к анализу проточной цитометрии.
  2. Прогон образца на проточный цитометр
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы были обработаны на проточном цитометре (с использованием лазеров 488 нм, 638 нм и 405 нм) в соответствии с руководством производителя35. Обратитесь к руководству для получения подробной информации, устранения неполадок и настройки протокола.
    1. Выполняйте обычные процедуры очистки до и после считывания образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пропускайте позицию при загрузке трубок в прибор.
      1. Для цикла очистки используйте в общей сложности четыре трубки, первая из которых содержит реагент для очистки потока, а остальные три трубки содержат dH2O; каждая пробирка будет иметь 3 мл. Во время очистки собирайте данные со средним расходом в течение примерно 1 минуты , фиксируя 100 000 событий на трубку при напряжении до 330 В для прямого рассеяния (FSC) против 265 В для бокового рассеяния (SSC).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Во время очистки не следует сообщать о мусоре или клеточных событиях; В этом случае повторите этап очистки. Перед получением данных убедитесь, что все образцы находятся в однородной суспензии, поскольку это обеспечивает точное считывание.
    2. Чтобы подключить цитометр и включить его, нажмите кнопку «Приложение», расположенную в левом углу строки заголовка. В раскрывающемся меню приложения выберите параметр « Цитометрия» и нажмите на параметр «Включить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: В раскрывающемся меню приложения опция « Открыть » позволяет пользователям просматривать предварительно запрограммированные анализы, а опция «Новый протокол » позволяет пользователям создавать новые протоколы.
    3. Первоначально загрузите отрицательный контрольный образец в многотрубный держатель. Выберите «Новый протокол» и просмотрите рабочий список в левой части рабочей области/экрана.
    4. В рабочем списке определите положение образца в многопробирочном держателе и дайте имя образцу и протокол идентификации.
    5. На панели оборудования , расположенной в левой части рабочего пространства, отрегулируйте и выберите несколько параметров, таких как детекторы (FSC, SSC и 10 диапазонов флуоресценции), напряжения (V ) и коэффициенты усиления фотоумножителей, а также высота-ширина области (AHW) сигнала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие настройки детекторов были выбраны на основе эксперимента и используемого прибора: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. На панели управления приборами, расположенной под строкой заголовка, отрегулируйте параметры расхода (средний), времени (5 мин) и событий (см. этап 5.2.8), которые необходимо обнаружить. Нажмите на опцию «Получить одиночный», чтобы позволить инструменту нарисовать/запустить сэмпл и показать предварительный просмотр обнаруженных событий в реальном времени.
    7. В режиме предварительного просмотра в реальном времени отрегулируйте порог флуоресценции (напряжение и усиление) и размер ячейки , чтобы в конечном итоге нарисовать ворота вокруг желаемой популяции клеток, исключив при этом любой клеточный мусор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FSC помогает различать клетки по размеру, тем самым позволяя пользователям различать клетки иммунной системы, такие как моноциты и лимфоциты; моноциты крупнее и показывают более высокую интенсивность FSC по сравнению с лимфоцитами.
    8. Получите в общей сложности 5 000 живых MoDC, 50 000 живых лимфоцитов и 50 000 живых моноцитов.
    9. После того, как все параметры настроены в соответствии с отрицательным контрольным образцом, нажмите « Стоп» и сохраните протокол.
    10. Теперь загрузите все образцы на многотрубный погрузчик. Определите каждый образец в рабочем списке и примените параметры, скорректированные по отношению к отрицательному контролю, ко всем образцам в эксперименте. Нажмите на опцию Получить , чтобы разрешить последовательный запуск всех образцов в эксперименте.
    11. После того, как данные из всех образцов получены, сохраните и преобразуйте их в читаемые данные с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа данных, которое позволяет создавать последовательные бипараметрические и монопараметрические гистограммы.

6. Анализ экспрессии матричной РНК (мРНК)

  1. Выделение РНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките общую РНК из антиген-импульсной кокультуры MoDC-лимфоцитов (специфической), неантиген-импульсной кокультуры MoDC-лимфоцитов (неспецифической), культуры лимфоцитов без MoDC (контроль) и из наивных лимфоцитов (CD14-клетки, выделенные до совместного культивирования). Для экстракции РНК приготовьте этанол с использованием воды, не содержащей РНКазы. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о наборе для экстракции и реагентах.
    1. Перенесите 1 мл клеточной суспензии из пластины для совместной культуры MoDC-лимфоцитов (~1 × 106 клеток/мл) в стерильную стерильную пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки и центрифугу в течение 10 мин при 500 × г.
    2. Сохраните надосадочную жидкость для ИФА. Ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл PBS и переносят ее в пробирку объемом 15 мл. Соберите все остаточные клетки, используя 1 мл PBS.
    3. Центрифугу в течение 10 мин по 500 × г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Со всеми образцами следует обращаться деликатно как с живыми клетками до тех пор, пока лизис клеток не будет проведен с использованием буфера лизиса, входящего в комплект. Гибель клеток высвобождает РНКазы, которые быстро гидролизуют матрицы РНК, необходимые для количественного определения ниже по течению. Буфер RLT лизирует клетки в растворе, который ингибирует РНКазы.
    4. Добавьте 350 мкл лизисного буфера в каждую пустую лунку и инкубируйте в течение 2-3 минут, чтобы лизировать адгезивные клетки, которые не были собраны на предыдущих этапах.
    5. После завершения центрифугирования на этапе 6.1.3 откажитесь от надосадочной жидкости и объедините гранулу ячейки с 350 мкл лизисного буфера, добавленного на этапе 6.1.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно хранить пробирки при температуре -80 ° C или приступить к экстракции РНК (следующие этапы).
    6. Пипетка 350 мкл 70% этанола до лизата на этапе 6.1.5. Конечный объем образца составляет 700 мкл.
    7. Вставьте экстракционную колонку в пробирку объемом 2 мл (входит в комплект).
    8. Перенесите 700 мкл образца на экстракционную колонну и центрифугу при 10 000 × г в течение 15 с. Откажитесь от проточной трубки в сборной трубе и поместите ее обратно в спиновую колонну.
    9. В экстракционную колонну добавьте 350 мкл строгого буфера для промывки (входит в комплект) и центрифугу при концентрации более 10 000 × г в течение 15 с. Откажитесь от проточной части.
    10. Добавьте 80 мкл инкубационной смеси ДНКазы I на образец на мембрану экстракционной колонны и дайте ей застыть в течение 15 мин при 20-30 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить инкубационную смесь ДНКазы I на образец, добавьте 10 мкл исходного раствора ДНКазы I к 70 мкл буфера ДНКазы для конечного объема 80 мкл. Тщательно перемешайте, несколько раз перевернув пробирку, после чего выполните короткое вращение в центрифуге.
    11. Промывайте экстракционную колонну 350 мкл строгого буфера для промывки с последующим центрифугированием при 10 000 × г в течение 15 мин. Откажитесь от проточного потока в сборной трубке после центрифугирования.
    12. Промывают экстракционную колонну 2 раза 500 мкл мягкого промывочного буфера каждый раз и центрифугированием при 10 000 × г в течение 15 с и второй раз в течение 2 мин. Отбрасывайте проточный канал после каждого центрифугирования.
    13. Центрифугируйте колонну на максимальной скорости в течение 1 мин, чтобы высушить мембрану, и выбросьте сборную пробирку.
    14. Поместите экстракционную колонку в новую пробирку для сбора объемом 1,5 мл.
    15. Пипеткой нанесите 50 мкл воды, не содержащей РНКазы, на мембрану колонки и инкубируйте в течение 3-5 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При концентрациях РНК ниже 100 нг уменьшите объем элюирования до 30 мкл и повторно элюируйте мембрану экстракционной колонки, используя продукт из первого элюирования для концентрирования конечного продукта.
    16. Центрифугу при 10 000 × г в течение 1 мин для элюции РНК.
    17. Измерьте концентрацию РНК, обнаружив поглощение на длине волны 260 нм, используя 0,5-2 мкл образца. Отрегулируйте конечную концентрацию РНК до 0,1-1 мкг/мкл с использованием воды, не содержащей РНКазы.
    18. Храните аликвоты РНК при температуре -80 ° C для последующего использования.
  2. Синтез комплементарной ДНК
    1. Синтезировать комплементарную ДНК (кДНК) из выделенной матричной РНК в соответствии с протоколом производителя, поставляемым с набором (подробности см. в Таблице материалов ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сводная информация об используемых реагентах и объемах приведена в Таблице 1 и Таблице 2. Полный протокол подробно описан в дополнительном файле 1.
  3. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени
    1. Для кПЦР запустите образцы кДНК в трех экземплярах. Количественно определите уровни транскрипта мРНК крупного рогатого скота для Ki-67 и ИФН-γ с использованием специфических наборов праймеров по отношению к гену GAPDH , как показано в таблице 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полный протокол подробно описан в дополнительном файле 1.

7. Иммуноферментный анализ

  1. Обработайте собранную культуру надосадочной жидкостью, богатой секреторными белками, для количественного определения ИФН-γ с помощью ИФА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации об использовании комплекта. Полный протокол подробно описан в дополнительном файле 1.

8. Статистический анализ

  1. Проанализируйте данные и сделайте графические иллюстрации экспериментального дизайна с использованием коммерческого программного обеспечения. Для сравнительного анализа используйте непарный непараметрический тест. Считайте, что значения P < 0,05 являются статистически значимыми.

Результаты

Эта методология описывает генерацию in vitro MoDC крупного рогатого скота для оценки антигенов-кандидатов вакцины перед проведением исследований in vivo. На рисунке 1 показана экспериментальная схема генерации MoDC крупного рогатого скота и применение MoDC для анализа

Обсуждение

Это исследование демонстрирует стандартизированный метод in vitro для получения и фенотипирования МО крупного рогатого скота и их последующего использования для измерения иммуногенности вакцины коммерческой вакцины (например, RV). MoDC крупного рогатого скота можно использовать в кач...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Эвелин Водак и д-ра Анжелику Лойстч (AGES) за их поддержку в определении состояния здоровья животных и за предоставление BTV, д-ра Бернхарда Райнелта за предоставление крови крупного рогатого скота, а также д-ра Бхарани Сеттипалли и д-ра Уильяма Дандона из МАГАТЭ за полезные советы по экспериментам с ПЦР в реальном времени и редактированию языка, соответственно.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ACK Lysing BufferGibco, Thermo FisherA1049201Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin TubesBecton, Dickinson (BD) and Company36648010 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth KitBio-Rad, UKPBP015KZZCytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA KitBio-RadMCA5638KZZKit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 AntibodyBio-RadMCA2678FMouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 AntibodyBio-RadMCA2430PEMouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 AntibodyBio-RadMCA1653A647Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 AntibodyBio-RadMCA2431FMouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 AntibodyBio-RadMCA837FMouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 AntibodyBio-RadMCA2437PEMouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad-Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge TubeFalcon Corning 352096 & 35207015 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm PlusBD Bio Sciences555028Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
EthanolSigma Aldrich1009832500Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher10500064Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUSGE Health care Life Sciences, USA341691Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning AgentBeckman Coulter, Life SciencesA64669500 mL
FlowJoFlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA-Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) TubeFalcon Corning 3522355 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-DextranSigma Aldrich, Germany60842-46-8FITC-dextran MW
Gallios Flow CytometerBeckman Coulter-Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR PlatesBio-RadHSP960196 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeadsMiltenyi Bioteck, Germany130-050-2012 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
KaluzaBeckman Coulter, Germany-Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS ColumnMiltenyi Bioteck, Germany130-042-401Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic AntibodyBio-RadMCA2228FMouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge TubeSigma AldrichHS43251.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power PointMicrosoft-The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 AntibodyBio-RadMCA928FIsotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 AntibodyBio-RadMCA928PEIsotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 AntibodyBio-RadMCA928PEIsotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II AntibodyBio-RadMCA929FIsotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac RabiesMSD Animal Health, UK-1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical sealsBi0-RadTCS08030.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-StreptomycinGibco, Thermo Fisher15140122100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS)Gibco, Thermo Fisher10010023pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software Dotmatics-Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibodyBiolegend, USA350501Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl AntibodyBiolegend400101Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium IodideBD Bio Sciences1351101Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 ProteinR&D System, USA202-IL-010/CFInterleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini KitQiagen74106Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 MediumSigma AldrichR8758Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art Les Laboratories Servier-Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-52702x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemInvitrogen, Thermo Fisher18080051Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24TPP, Switzerland9202424 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue SolutionGibco, Thermo Fisher152500610.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen, Thermo Fisher109770230.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection TubesThermo Fisher Scientific15206067VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
WaterSigma AldrichW3500-1LSterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

Ссылки

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R., Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. , 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. , 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -. J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -. R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118 Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005)
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  36. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
  37. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  38. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  39. Cho, K. -. J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
  40. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  41. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  42. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  43. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  44. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  45. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  46. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  47. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  48. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
  49. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены