Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

Resumo

A metodologia descreve a geração de células dendríticas derivadas de monócitos bovinos (MoDCs) e sua aplicação na avaliação in vitro de candidatos antigênicos durante o desenvolvimento de potenciais vacinas veterinárias em bovinos.

Resumo

As células dendríticas (DCs) são as mais potentes células apresentadoras de antígenos (APCs) dentro do sistema imunológico. Eles patrulham o organismo à procura de patógenos e desempenham um papel único dentro do sistema imunológico, ligando as respostas imunes inatas e adaptativas. Essas células podem fagocitar e, em seguida, apresentar antígenos capturados para células imunes efetoras, desencadeando uma gama diversificada de respostas imunes. Este trabalho demonstra um método padronizado para a geração in vitro de células dendríticas derivadas de monócitos bovinos (MoDCs) isoladas de células mononucleares do sangue periférico de bovinos (PBMCs) e sua aplicação na avaliação da imunogenicidade vacinal.

A triagem celular baseada em magnética foi usada para isolar monócitos CD14+ de CMSP, e a suplementação de meio de cultura completo com interleucina (IL)-4 e fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) foi usada para induzir a diferenciação de monócitos CD14⁺ em MoDCs virgens. A geração de MoDCs imaturas foi confirmada pela detecção da expressão dos marcadores de superfície celular do complexo principal de histocompatibilidade II (MHC II), CD86 e CD40. Uma vacina antirrábica comercialmente disponível foi usada para pulsar as CCMOs imaturas, que foram posteriormente co-cultivadas com linfócitos virgens.

A análise por citometria de fluxo das MoDCs antígeno-pulsadas e da co-cultura de linfócitos revelou estimulação da proliferação de linfócitos T através da expressão dos marcadores Ki-67, CD25, CD4 e CD8. A análise da expressão do RNAm de IFN-γ e Ki-67, por PCR quantitativo, mostrou que as MoDCs podem induzir o priming antígeno-específico de linfócitos neste sistema de co-cultivo in vitro . Além disso, a secreção de IFN-γ avaliada por ELISA mostrou um título significativamente maior (**p < 0,01) na co-cultura MoDC-linfócito pulsada pela vacina antirrábica do que na co-cultura de linfócitos MoDC não pulsada por antígeno. Estes resultados mostram a validade deste ensaio in vitro MoDC para medir a imunogenicidade vacinal, o que significa que este ensaio pode ser usado para identificar potenciais candidatos vacinais para bovinos antes de prosseguir com ensaios in vivo , bem como em avaliações de imunogenicidade vacinal de vacinas comerciais.

Introdução

A vacinação veterinária representa um aspecto crucial da pecuária e da saúde, pois contribui para melhorar a segurança alimentar e o bem-estar animal, conferindo proteção contra doenças que afetam o setor pecuário globalmente¹. Um método in vitro eficaz para avaliar a imunogenicidade de possíveis candidatas a vacinas ajudaria a acelerar o processo de desenvolvimento e produção de vacinas. Faz-se necessário, portanto, ampliar o campo dos ensaios imunológicos com metodologias inovadoras baseadas em estudos in vitro , pois isso ajudaria a desvendar a complexidade dos processos imunes relacionados à imunização e infecção por patógenos. Atualmente, estudos de imunização animal in vivo e estudos de desafio, que requerem amostras periódicas (por exemplo, sangue e baço), são usados para medir a imunogenicidade de vacinas candidatas e adjuvantes. Esses ensaios são caros, demorados e têm implicações éticas, pois, na maioria dos casos, a eutanásia dos animais é realizada ao final dos ensaios.

Como alternativa aos ensaios in vivo, células mononucleares do sangue periférico (CMSP) têm sido utilizadas para avaliar respostas imunes induzidas por vacinas in vitro². As CMSP são uma população heterogênea de células composta por 70%-90% de linfócitos, 10%-20% de monócitos e um número limitado de células dendríticas (DCs, 1%-2%)³. As CMSP abrigam células apresentadoras de antígenos (APCs), como células B, monócitos e DCs, que patrulham constantemente o organismo em busca de sinais de infecção ou dano tecidual. As quimiocinas secretadas localmente facilitam o recrutamento e a ativação de APCs para esses locais, ligando-se a receptores de superfície celular. No caso dos monócitos, as quimiocinas direcionam seu destino para se diferenciarem em CD ou macrófagos⁴. Assim que as DCs encontram e capturam um patógeno, migram para órgãos linfoides secundários, onde podem apresentar antígenos peptídicos patogênicos processados utilizando proteínas de superfície classe I ou II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) para células T CD8+ ou células T CD4⁺, respectivamente, desencadeando uma resposta^imune5,6.

O papel fundamental desempenhado pelas DCs na orquestração de uma resposta imune protetora contra vários patógenos as torna um interessante alvo de pesquisa para a compreensão dos mecanismos imunes intracelulares, especialmente na concepção de vacinas e adjuvantes contra agentes infecciosos⁷. Como a fração de DCs que pode ser obtida a partir de CMSP é bastante pequena (1%-2%), monócitos têm sido usados para gerar CDs in vitro⁸. Essas DCs derivadas de monócitos (MoDCs) foram inicialmente desenvolvidas como uma possível estratégia de tratamento na imunoterapia do câncer⁹. Mais recentemente, as MoDCs têm sido utilizadas para pesquisa de vacinas 10,11,12^, sendo os monócitos clássicos o subtipo predominante (89%) para a produção de MoDC ¹³. A produção de MoDCs in vitro foi previamente obtida através da adição de fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) administrado em combinação com outras citocinas, como interleucina-4 (IL-4), fator de necrose tumoral α (TNF-α) ou IL-13^14,15,16.

O sucesso de um ensaio in vitro de MoDC depende da capacidade das MoDCs maduras estimuladas por antígeno de modular a extensão e o tipo da resposta imune específica para o tipo de antígeno detectado¹⁷. O tipo de patógeno reconhecido e apresentado pelas MoDCs determina a diferenciação de células T helper (Th) CD4⁺ em células Th1, Th2 ou Th17 efetoras e é caracterizado por um perfil de citocinas secretoras específicas do patógeno. Uma resposta Th1 é induzida contra patógenos intracelulares e resulta na secreção de interferon-gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral beta (TNF-β), que modula a proteção fagocitária-dependente. A resposta Th2 é desencadeada contra organismos parasitários e é caracterizada pela secreção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que inicia a proteção humoral fagocítica-independente. Th17 oferece proteção neutrofófila dependente contra infecções bacterianas e fúngicas extracelulares mediadas pela secreção de IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 e TNF-α 18,19,20,21. Com base em estudos anteriores, observou-se que nem todos os patógenos se enquadram no perfil de citocinas esperado. Por exemplo, as MoDCs dérmicas, em resposta à infecção parasitária por Leishmania, estimulam a secreção de IFN-γ de células T CD4+ e células T CD8⁺, induzindo uma resposta Th1 pró-inflamatória protetora²².

Também foi demonstrado que, em MoDCs de frango preparadas com lipopolissacarídeo (LPS) de Salmonella, podem induzir uma resposta variável contra Salmonella typhimurium ativando respostas Th1 e Th2, enquanto Salmonella gallinarum induz uma resposta Th2 isoladamente, o que poderia explicar a maior resistência desta última à depuração de MoDC²³. A ativação de MoDCs contra Brucella canis (B. canis) também foi relatada em MoDCs caninas e humanas, o que significa que isso poderia representar um mecanismo de infecção zoonótica²⁴. As MoDCs humanas preparadas com B. canis induzem uma forte resposta Th1 que confere resistência à infecção grave, enquanto as MoDCs caninas induzem uma resposta Th17 dominante com uma resposta Th1 reduzida, levando subsequentemente ao estabelecimento de infecção crônica²⁵. As MoDCs bovinas apresentam maior afinidade pelo vírus da febre aftosa (FMDV) conjugado com imunoglobulina G (IgG) em comparação com a FMDV não conjugada isoladamente, uma vez que as DCMs formam um complexo vírus-anticorpo em resposta às primeiras¹⁰. Em conjunto, esses estudos mostram como as MoDCs têm sido usadas para analisar a complexidade das respostas imunes durante a infecção por patógenos. As respostas imunes adaptativas podem ser avaliadas pela quantificação de marcadores específicos associados à proliferação linfocitária. O Ki-67, proteína intracelular detectada apenas em células em divisão, é considerado um marcador confiável para estudos de proliferação²⁶ e, da mesma forma, CD25 expresso na superfície das células T durante a fase tardia de ativação corresponde à proliferação linfocitária^27,28.

Este estudo demonstra um método padronizado para a geração in vitro de MoDCs bovinas seguido de sua aplicação em um ensaio imunológico in vitro utilizado para testar a imunogenicidade de vacinas. Uma vacina antirrábica (VR) comercialmente disponível foi utilizada para validar a eficácia deste ensaio. A ativação e proliferação de linfócitos T foram medidas por citometria de fluxo, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e ensaio imunoenzimático (ELISA) por meio da análise de marcadores de ativação celular bem estabelecidos, como Ki-67 e CD25, e da secreção de IFN-γ 28,29,30,31. Nenhum teste experimental em animais ou humanos é realizado durante o ensaio MoDC.

Protocolo

A colheita de sangue é realizada por um serviço veterinário certificado de acordo com as orientações éticas da Agência Austríaca para a Saúde e a Segurança dos Alimentos (AGES) e em conformidade com as normas de bem-estar animal aceites³². O estudo recebeu aprovação ética do Ministério da Agricultura da Áustria. O planejamento experimental para geração de MoDCs e sua posterior aplicação está ilustrado na Figura 1.

1. Produção de MoDCs ingênuos

OBS: Amostras de sangue total foram obtidas de um único bezerro livre de patógenos por punção da veia jugular com vacutadores heparinizados (oito tubos sanguíneos de 9 mL foram usados para este estudo). Transporte o sangue em uma caixa de gelo. Conservar as amostras a 2-4 °C para utilização posterior ou processá-las imediatamente. Mantenha o sangue girando para evitar a coagulação do sangue. Esterilizar os vacutainers com etanol 70%. Todos os experimentos seguintes foram realizados com uma amostra biológica e seis repetições técnicas.

1. Gradiente de densidade centrífuga para isolar CMSP do sangue heparinizado
   1. Misture bem o sangue, invertendo-o 10x.
   2. Com uma pipeta de 10 mL, transferir 20 mL de sangue heparinizado para um tubo estéril de 50 mL e diluí-lo com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   3. Pipetar 15 mL de meio de isolamento de linfócitos para um tubo estéril de 50 mL.
      NOTA: Permitir que o meio de isolamento de linfócitos atinja a temperatura ambiente antes da pipetagem.
   4. Inclinar o tubo de 50 mL contendo o meio de isolamento de linfócitos até uma posição de 45°. Aponte a ponta de uma pipeta de 25 mL perpendicularmente e coloque cuidadosamente os 30 mL de PBS sanguíneo sobre o meio de isolamento de linfócitos, sem misturar os dois. Muito lentamente, traga o tubo de 50 mL de volta à posição vertical.
   5. Centrifugar a 800 × g durante 35 min a 20 °C com aceleração máxima e sem travagem (função de desaceleração desligada).
   6. Use uma pipeta de Pasteur para coletar a camada de PBMC (a fina camada branca logo após a primeira camada de plasma) e transferi-la para um novo tubo de 50 mL.
      NOTA: A centrifugação por gradiente de densidade separa o sangue total em diferentes camadas. Como resultado, os eritrócitos se depositam na parte inferior como uma pelota, as células mononucleares (PBMCs) se depositam na camada de interface e o plasma forma a camada superior. Granulócitos são encontrados entre a pelota e a camada de PBMC.
   7. Lave os PBMCs colhidos 2x adicionando PBS até um volume de 40 mL e misturando completamente pipetando para cima e para baixo. Em seguida, centrifugar a 500 × g a 4 °C por 7 min com aceleração máxima e desaceleração máxima.
   8. Eliminar o sobrenadante por decantação, ressuspender o pellet em 15 mL de tampão 1x amônio-cloreto de potássio (ACK) e incubar à temperatura ambiente por 10-15 min.
      NOTA: Não incubar por mais de 15 min. O tampão ACK comercialmente disponível é usado para garantir a lise das hemácias residuais (hemácias) presentes na fração PBMC.
   9. Adicionar PBS até um volume de 40 mL e, em seguida, centrifugar a 500 × g e 4 °C por 7 min com aceleração e desaceleração máximas.
   10. Eliminar o sobrenadante por decantação e repetir o passo 1.1.9.
   11. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mL de meio de cultura completo (à temperatura ambiente).
       OBS: O meio de cultura completo é composto por meio de cultura de células RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Separação magnética das células CD14^+/− da população PBMC usando esferas magnéticas conjugadas a CD14
   1. Contar as células com um contador de células do hemocitômetro limpo usando 10 μL de suspensão celular misturada com 10 μL de solução de azul de tripano (0,4%).
      NOTA: O corante azul de tripano é um produto químico tóxico e potencialmente cancerígeno. Ele deve ser manuseado com o uso de equipamentos de proteção individual (EPIs) para evitar o contato, e os resíduos devem ser descartados em um recipiente de resíduos tóxicos herméticos. As células mortas aparecerão azuis, enquanto as células vivas aparecerão claras sob o microscópio.
   2. Centrifugar por 7 min a 500 × g.
   3. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda o pellet em tampão de classificação celular ativado por fluorescência (FACS) usando um volume de 40 μL para cada 1 × 10⁷ células. Misture bem usando uma pipeta.
      NOTA: O tampão FACS é composto por 2% de FBS e 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) dissolvido em PBS.
   4. Adicionar 5 μL de tampão de microesferas CD14 por 1 × 10⁷ células e misturar bem usando uma pipeta.
   5. Incubar durante 30 min a 4-8 °C para a selecção positiva de monócitos CD14⁺ bovinos³³. Vórtice a cada 15 min durante o período de incubação.
   6. Etapa opcional (para análise por citometria de fluxo): Adicionar 10 μL de anticorpo corante CD14-FITC (isotiocianato de fluoresceína) com incubação subsequente por 15 min a 4-8 °C. Consulte a análise de citometria de fluxo na etapa 5 para obter detalhes.
   7. Adicionar 1 mL de tampão FACS e centrifugar por 7 min a 500 × g.
   8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão FACS por 1 × 10⁸ células.
   9. Introduzir a coluna de separação de células imunomagnéticas no separador (suporte da coluna magnética) e colocar um tubo de recolha de 15 ml sob a saída da coluna para recolher o fluxo.
   10. Lavar a coluna com 1 ml de tampão FACS desgaseificado. Após o enxágue, substituir o tubo de 15 mL usado por um novo.
   11. Permitir que a suspensão celular (a partir do passo 1.2.8) passe através da coluna pipetando 1 × 10⁸ células em 500 μL de tampão de cada vez.
       NOTA: Preste atenção para não gerar bolhas de ar ao misturar as células antes de deixá-las através da coluna.
   12. Enxaguar a coluna 3x com 3 mL de tampão FACS desgaseificado de cada vez.
   13. Coletar o fluxo e rotular essa primeira fração eluída como a fração de células CD14⁻ (PBMCs menos monócitos CD14⁺ ); Isso também é chamado de fração de linfócitos ingênuos.
       NOTA: As células CD14⁻ são mantidas em meio de cultura completo até que MoDCs pulsadas por antígeno sejam produzidas.
   14. Remova a coluna do separador.
   15. Colocar um novo tubo estéril de 15 mL sob a coluna para a coleta do efluente.
   16. Pipetar 5 mL de tampão FACS para a coluna e empurrá-lo imediatamente usando um êmbolo.
   17. Coletar o fluxo e rotular essa segunda fração eluída como a fração de célula CD14⁺ ; Isso também é chamado de fração ingênua de monócitos.
   18. Adicionar meio de cultura completo aos monócitos CD14⁺ colhidos para atingir 1 × 10⁶ células/mL.
       NOTA: Conte as células vivas na fração de células CD14⁺ eluídas para estimar o volume de meio de cultura completo necessário para atingir a contagem de células desejada.
   19. Pegue uma placa estéril de 24 poços e adicione 1 mL da suspensão celular (1 × 10⁶ células/mL) a cada poço.
3. Diferenciação dos monócitos virgens de CD14⁺ em MoDCs virgens pela adição de 3% p/v de coquetel de citocinas (GM-CSF + IL-4) com um total de 5 dias de incubação
   1. Completar cada poço contendo monócitos CD14⁺ com 40 μL (3% p/v) do coquetel de citocinas fornecido no kit.
   2. Incubar a placa em estufa umidificada com 5% de CO₂ e a 37 °C por 48 h.
   3. No dia 2, transferir metade do conteúdo de cada poço (500 μL) usando uma pipeta para tubos individuais de 1,5 mL e centrifugar a 500 × g a 4 °C por 7 min.
   4. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL de meio de cultura completo fresco.
   5. Transferir 500 μL desta suspensão celular do passo 1.3.4 de volta para cada poço designado, de modo que o volume final seja de 1 mL.
   6. Enriqueça cada poço com 20 μL de coquetel de citocinas.
   7. Incubar a cultura por 72 h em estufa umidificada com 5% de CO₂ e a 37 °C.
   8. Após a incubação no dia 5, retire a placa da incubadora.
      NOTA: Cada poço conterá 1 mL de uma suspensão celular de MoDCs ingênuas. O número de MoDCs será uma porcentagem (~20%) dos monócitos originais plaqueados (1 × 10⁶/mL).

2. Ensaio de atividade endocítica MoDC

NOTA: O ensaio de captação de antígeno ou ensaio de atividade endocítica mede a capacidade de MoDCs ingênuas de internalizar material estranho. Realizar o ensaio utilizando MoDCs virgens cultivadas com coquetel de citocinas 3% p/v e com 5 dias de incubação, conforme descrito anteriormente³⁴.

1. Colher a ingênua suspensão de células MoDC da placa de 24 poços e transferi-la para um tubo de 15 mL; também coletar quaisquer células residuais enxaguando os poços com PBS.
2. Centrífuga para 500 × g por 7 min. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de meio de cultura suplementado com SFB a 1%.
3. Conte as células MoDC vivas para estimar o volume de meio necessário para atingir a contagem de células desejada (2 × 10⁵ células/mL).
4. Cultivar as DCMs virgens em 100 μL de meio de cultura completo em uma placa de 24 poços com uma concentração celular final de 2 × 10⁵ células/mL.
5. Completar cada poço com 1 mg/mL de dextran conjugado com FITC (sonda fluorescente usada como traçador de endocitose).
   NOTA: O FITC-DEXTRAN atua como uma sonda fluorescente e é usado como um traçador de endocitose.
6. Cobrir a placa e incubar no escuro a 5% CO₂ e 37 °C durante 60 min.
   NOTA: Para o controle de fundo, incubar as células MoDC adicionais (2 × 10⁵ células/mL) com 1 mg/mL de FITC-dextran no gelo, pois esse tipo de incubação impede a entrada da molécula traçadora (FITC-dextrano) nas células.
7. Após a incubação, transferir imediatamente a placa de 24 poços no gelo para interromper a endocitose de FITC-dextrano.
8. Lave as células com tampão FACS gelado.
9. Colher, centrifugar e ressuspender o pellet em 500 μL de tampão FACS.
10. Analisar a intensidade de fluorescência do FITC-dextran dentro das células usando citometria de fluxo. Consulte a análise de citometria de fluxo na etapa 5.2 para obter detalhes.

3. Geração de MoDCs pulsadas por antígeno

NOTA: Uma vacina comercialmente disponível e clinicamente aprovada contra o vírus da raiva (RV) pode induzir a diferenciação de MoDCs virgens em MoDCs maduras apresentadoras de antígenos. Use 0,1% (~1 μL) de uma única dose de vacinação de RV para gerar MoDCs pulsadas por antígeno. Além disso, é preferível produzir MoDCs pulsadas por RV na mesma placa de cultura usada (na etapa 1.3.8) para gerar MoDCs ingênuos, pois transferir os MoDCs ingênuos para uma nova placa de 24 poços os afetará negativamente.

1. A partir do passo 1.3.8) Adicionar 1 μL/mL de suspensão de VR a 1 mL de cultura virgens de MoDC na placa de 24 poços e incubar por 48 h a 5% de CO₂ e 37 °C.
   NOTA: MoDCs ingênuas cultivadas sem estimulação do VD são usadas como controle de fundo (e como estimulação inespecífica para co-cultura com linfócitos nas próximas etapas).
2. Após a incubação, no dia 7, manter a placa de 24 poços contendo as MoDCs pulsadas por antígeno no gelo por 10 min.
3. Adicionar 1 mL de PBS gelado por poço. Misture bem cada um deles por pipetagem e transfira a suspensão para um tubo de 15 mL.
4. Lave os poços com 2 mL de PBS gelado para coletar as células residuais deixadas dentro de cada poço.
5. Transfira o conteúdo para seus respectivos tubos e centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 7 min.
6. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular (MoDCs pulsadas por antígeno) em meio de cultura completo e ajuste o volume para uma concentração celular final de 1 × 10⁵ células/mL.
   NOTA: Conte as células vivas para estimar o volume de meio necessário para atingir a contagem de células desejada. Use MoDCs pulsadas por RV a partir do dia 7 para o sistema de co-cultura de linfócitos MoDC.

4. Co-cultura de linfócitos MoDC

NOTA: O sistema de co-cultura de linfócitos MoDC in vitro determina a capacidade das MoDCs de prime linfócitos antígeno-específicos. Os diferentes grupos de tratamento de células após 16 dias de co-cultivo incluem específicos, inespecíficos e controle. O grupo específico é definido como linfócitos co-cultivados com MoDCs pulsadas em RV; o grupo inespecífico é definido como linfócitos cocultivados com MoDCs não pulsadas por antígenos; e o grupo controle é definido como linfócitos cultivados sem CCoM.

1. Adicionar meio de cultura completo à fração de linfócitos virgens de eluídos (células CD14⁻ ) para atingir uma concentração celular de 2 × 10⁶ células/mL.
   NOTA: Conte as células vivas na cultura de células CD14⁻ que foram mantidas em meio de cultura completo em uma placa de 24 poços desde sua coleta para estimar o volume de meio necessário para atingir a contagem de células desejada.
2. No dia 7, pegue uma placa estéril de 24 poços e semeie os poços com 1 mL de suspensão de células linfocitárias virgens (2 × 10⁶ células/mL) mais 1 mL de suspensão de MoDC pulsada por antígeno ou não pulsada por antígeno (1 × 10⁵ células/mL).
   NOTA: O volume total em cada poço será de 2 mL com uma proporção de 1:20 MoDCs para linfócitos por poço.
3. Incubar a placa durante 48 h a 37 °C e 5% CO₂.
4. Enriquecimento e reestimulação de culturas com MoDCs pulsadas por antígeno
   1. Após a incubação da co-cultura antígeno-pulsada de linfócitos MoDC, no dia 9, suplementar cada poço com 20 ng/mL de IL-2 recombinante e continuar incubando por mais 120 h (5 dias de incubação).
   2. No 14º dia, transferir 1 mL da co-cultura para um tubo estéril de 1,5 mL e centrifugar a 500 × g por 7 min.
   3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda a pastilha celular com 1 mL de MoDCs pulsadas ou não pulsadas por antígeno (1 × 10⁵ células/mL). Misture suavemente por pipetagem e transfira as suspensões de células de volta para os poços designados.
      NOTA: Nesta etapa, o volume total em cada poço é de 2 mL.
   4. Continuar com a incubação a 5% CO₂ e 37 °C por 48 h. Após a incubação no 16º dia, a co-cultura está pronta para análise por citometria de fluxo, qPCR e ELISA.
      NOTA: Para cada 2 mL em cada poço da co-cultura de linfócitos MoDC, 1 mL de células ressuspensas é corado para citometria de fluxo, 1 mL é usado para extração de RNA e os sobrenadantes de ambos são usados para ELISA.

5. Análise por citometria de fluxo

NOTA: Manchar as células com marcadores apropriados/mAb antes de executar as amostras em um citômetro de fluxo. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os reagentes (controles de coloração mAb e isotipo), kit, instrumento e software usados para a análise de citometria de fluxo.

1. Protocolo de coloração por citômetro de fluxo
   NOTA: Realizar a coloração da superfície celular para as CMSP e linfócitos e monócitos virgens usando anti-CD14 mAb (passo 1.2.6). Para a coloração da superfície celular de MoDCs virgens, use mAb anti-CD86-específico, anti-CD40-específico e anti-MHC II-específico. Para a coloração da superfície celular das células a partir do 16º dia de co-cultivos, utilizar anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; para coloração intracelular, utilizar anti-Ki-67 mAb. Além disso, corar as células com controle de isotipo negativo mAb ou sem mAb (FMO: fluorescente menos um). A principal diferença na coloração para marcadores de superfície e intracelulares é que, para marcadores de superfície celular, as células devem ser coradas com mAb de superfície específico antes da coloração viva/morta (L/D) ou qualquer outro processo. No entanto, a coloração intracelular é realizada após a coloração L/D e requer uma etapa de fixação mais permeabilização para permitir a penetração intracelular.
   1. Transferir 1 mL de suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mL usando uma pipeta e centrifugar por 10 min a 500 × g.
      NOTA: Após a centrifugação, ao processar as células da co-cultura de linfócitos MoDC, guarde o sobrenadante para análise de ELISA.
   2. Ressuspender o pellet em 1 mL de PBS e transferi-lo para um tubo de 15 mL. Coletar as células residuais usando 1 mL de PBS e combiná-las com o pellet ressuspenso.
   3. Adicionar 10 mL de PBS ao tubo de 15 mL contendo as células, misturar por pipetagem e centrifugar por 7 min a 850 x g.
   4. Eliminar o sobrenadante e repetir o passo 5.1.3.
   5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda cuidadosamente o pellet de células com a suspensão residual (aproximadamente 180 μL) deixada após a decantação do sobrenadante.
   6. Transfira a suspensão da célula para uma placa de 96 poços com fundo em V e sele os poços para evitar derramamento.
   7. Centrifugar a placa a 1.400 × g por 5 min. Após a centrifugação, passe a placa sobre um recipiente de resíduos para esvaziar os poços de líquido e bata a placa em papel absorvente para garantir a remoção do excesso de líquido.
   8. Adicionar 25 μL de mistura mestra de coloração de superfície por poço e misturar suavemente com uma pipeta, seguida de incubação a 4 °C durante 30 minutos.
      NOTA: Para preparar a mistura mestre de coloração de superfície para um único poço, adicione 2,5 μL de mAb de superfície a 20 μL de tampão FACS.
   9. Adicionar 200 μL de tampão FACS por poço e centrifugar a 1.400 × g por 5 min. Após a centrifugação, esvazie os poços de líquido por decantação e bata a placa em papel absorvente para remover o excesso de líquido.
   10. Adicionar 100 μL de solução corante L/D por poço. Misturar cuidadosamente com uma pipeta, seguida de incubação a 4 °C durante 15 minutos no escuro.
       NOTA: Para um único poço, dissolver 0,25 μL de corante L/D em 100 μL de tampão FACS. O corante L/D ajuda a distinguir entre células vivas e mortas.
   11. Adicionar 100 μL de tampão FACS. Cubra os poços com a tampa e centrifugue a placa por 1.400 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante por decantação e bata a placa em papel absorvente.
   12. Repita a etapa 5.1.11.
   13. Adicionar 50 μL de solução de fixação por poço (fornecida com o kit) e misturar com uma pipeta antes de incubar a placa à temperatura ambiente no escuro durante 10 min.
   14. Adicione 150 μL do tampão de lavagem por permeabilização (PW) de 1x fornecido com o kit e cubra os poços com a tampa.
       NOTA: Para preparar 10 mL de tampão 1x PW, diluir 1 mL de tampão 10x perm em 10 mL de dH₂O.
   15. Centrifugar a placa a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante por decantação e bata a placa em papel absorvente.
   16. Adicionar 200 μL de 1x PW, seguido de centrifugação a 1.400 × g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante por decantação e bata a placa em papel absorvente.
   17. Para coloração intracelular, adicionar 25 μL de mistura mestre de coloração intracelular (Ki-67 mAb anti-humano) por poço. Misture bem e incube a placa por 30 min a 4 °C ou no gelo no escuro.
       NOTA: Para preparar a mistura mestre de coloração intracelular para um único poço, adicione 1 μL de Ki-67 mAb a 24 μL de 1x PW. O marcador de coloração intracelular é usado apenas no processamento de células a partir do 16º dia de co-cultivo. A coloração intracelular não é feita durante o processamento de CMSP, linfócitos virgens, monócitos e CCMs virgens.
   18. Após a incubação, adicionar 200 μL de 1x PW a cada poço. Misture com uma pipeta e centrifugue por 1.400 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante por decantação e bata a placa em papel absorvente.
   19. Adicionar 200 μL de tampão FACS, seguido de centrifugação a 1.400 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante por decantação e bata o prato em papel absorvente.
   20. Ressuspender o pellet de células em 200 μL de tampão FACS e transferir o conteúdo de cada poço para separar os tubos estéreis do citômetro de fluxo. Use 300 μL de tampão FACS por poço para coletar as células residuais. As células estão agora prontas para a análise de citometria de fluxo.
2. Executando a amostra em um citômetro de fluxo
   NOTA: As amostras foram executadas em citômetro de fluxo (utilizando lasers de 488 nm, 638 nm e 405 nm) de acordo com o manual do fabricante³⁵. Consulte o manual para obter detalhes, solução de problemas e personalização do protocolo.
   1. Realizar procedimentos de limpeza de rotina antes e após a leitura das amostras.
      NOTA: Não pule uma posição durante o carregamento dos tubos no instrumento.
      1. Para o ciclo de limpeza, utilizar um total de quatro tubos, sendo o primeiro contendo reagente de limpeza de fluxo e os três tubos restantes contendo dH₂O; cada tubo terá 3 mL. Durante a execução de limpeza, adquira dados com uma taxa de fluxo média por aproximadamente 1 minuto capturando 100.000 eventos por tubo sob 330 V para dispersão direta (FSC) contra 265 V para dispersão lateral (SSC).
         NOTA: Nenhum entulho ou eventos celulares devem ser relatados durante a limpeza; Se isso acontecer, execute a etapa de limpeza novamente. Para executar as amostras, certifique-se de que todas as amostras estejam em uma suspensão homogênea antes de adquirir os dados, pois isso garante uma leitura precisa.
   2. Para conectar e ligar o citômetro, clique no botão Aplicativo localizado no canto esquerdo da barra de título. No menu suspenso do aplicativo , selecione a opção Citometria e clique na opção Ligar.
      NOTA: No menu suspenso do aplicativo , a opção Abrir permite que os usuários naveguem pelos ensaios pré-programados, enquanto a opção Novo protocolo permite que os usuários criem novos protocolos.
   3. Inicialmente carregue a amostra de controle negativo no suporte multitubo. Selecione Novo Protocolo e observe a lista de trabalho no lado esquerdo do espaço de trabalho /tela.
   4. Na lista de trabalho, defina a posição da amostra no suporte multitubo e dê um nome à amostra e ao protocolo para identificação.
   5. No Painel de Hardware localizado no lado esquerdo da área de trabalho, ajuste e selecione vários parâmetros, como os detectores (FSC, SSC e 10 faixas de fluorescência), as tensões (V ) e os ganhos dos fotomultiplicadores e a área-altura-largura (AHW) do sinal.
      OBS: Os seguintes ajustes para os detectores foram selecionados com base no experimento e no instrumento utilizado: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; CS-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
   6. No Painel de Controle de Aquisição de Instrumentos, localizado sob a barra de título, ajuste as opções de vazão (média), Tempo (5 min) e Eventos (veja a etapa 5.2.8) que desejam ser detectados. Clique na opção Adquirir Único para permitir que o instrumento desenhe/execute a amostra e mostre a visualização em tempo real dos eventos detectados.
   7. A partir da visualização em tempo real, ajuste o limiar de fluorescência (voltagem e ganho) e o tamanho da célula para, eventualmente, desenhar portas em torno da população celular desejada, excluindo quaisquer detritos celulares.
      NOTA: FSC ajuda a distinguir as células com base no tamanho, permitindo assim que os usuários diferenciem entre as células do sistema imunológico, como monócitos e linfócitos; os monócitos são maiores e apresentam maior intensidade de FSC em relação aos linfócitos.
   8. Adquira aproximadamente um total de 5.000 MoDC vivos, 50.000 linfócitos vivos e 50.000 eventos de monócitos vivos.
   9. Depois que todos os parâmetros estiverem ajustados em referência à amostra de controle negativo, clique em Parar e salve o protocolo.
   10. Agora carregue todas as amostras no carregador multitubo. Defina cada amostra na lista de trabalho e aplique os parâmetros ajustados em referência ao controle negativo a todas as amostras dentro do experimento. Clique na opção Adquirir para permitir que todas as amostras do experimento sejam executadas consecutivamente.
   11. Uma vez que os dados de todas as amostras são adquiridos, salvar e transformar em dados legíveis usando um software de análise de dados apropriado que permite a geração de histogramas sequenciais bi-paramétricos e mono-paramétricos.

6. Análise da expressão do RNA mensageiro (mRNA)

1. Extração de RNA
   NOTA: Extrair o RNA total da co-cultura MoDC-linfócito pulsada antígeno-(específica), da co-cultura MoDC-linfócito não pulsada por antígeno (inespecífica), da cultura de linfócitos sem MoDCs (controle) e de linfócitos virgens (células CD14⁻ isoladas antes do cocultivo). Para a extração de RNA, preparar etanol usando água livre de RNase. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o kit de extração e reagentes.
   1. Transferir 1 mL de suspensão celular da placa de co-cultura de linfócitos MoDC (~1 × 10⁶ células/mL) para um tubo estéril estéril de 1,5 mL usando uma pipeta e centrifugar por 10 min a 500 × g.
   2. Salve o sobrenadante para ELISA. Ressuspender o pellet de células em 1 mL de PBS e transferi-lo para um tubo de 15 mL. Coletar quaisquer células residuais usando 1 mL de PBS.
   3. Centrifugar por 10 min a 500 × g.
      NOTA: Todas as amostras devem ser manuseadas delicadamente como células vivas até que a lise celular seja realizada usando o tampão de lise fornecido no kit. A morte celular libera RNases que hidrolisam rapidamente os modelos de RNA necessários para a quantificação a jusante. O tampão RLT lisa as células em uma solução que inibe as RNases.
   4. Adicionar 350 μL de tampão de lise a cada poço vazio e incubar por 2-3 min para lisar as células aderentes que não foram colhidas nas etapas anteriores.
   5. Uma vez concluída a centrifugação na etapa 6.1.3, eliminar o sobrenadante e combinar a pastilha celular com os 350 μL de tampão de lise adicionados na etapa 6.1.4.
      NOTA: Neste ponto, é possível armazenar os tubos a -80 °C ou prosseguir com a extração de RNA (etapas a seguir).
   6. Pipetar 350 μL de etanol a 70% para o lisado na etapa 6.1.5. O volume final por amostra é de 700 μL.
   7. Insira a coluna de extração dentro de um tubo de coleta de 2 mL (fornecido com o kit).
   8. Transferir os 700 μL de amostra por coluna de extracção e centrifugar a 10.000 × g durante 15 s. Descarte o fluxo no tubo de coleta e coloque-o de volta na coluna de rotação.
   9. Na coluna de extração, adicione 350 μL de tampão de lavagem rigoroso (fornecido no kit) e centrifuja a mais de 10.000 × g por 15 s. Descarte o fluxo.
   10. Adicionar 80 μL da mistura de incubação DNase I por amostra na membrana da coluna de extracção e deixar fixar durante 15 minutos a 20-30 °C.
       NOTA: Para preparar a mistura de incubação de DNase I por amostra, adicione 10 μL de solução-mãe de DNase I a 70 μL de tampão DNase para um volume final de 80 μL. Misture bem invertendo o tubo várias vezes, seguido de um pequeno giro na centrífuga.
   11. Lavar a coluna de extracção com 350 μL de tampão de lavagem rigoroso, seguido de centrifugação a 10.000 × g durante 15 min. Descarte o fluxo no tubo de coleta após a centrifugação.
   12. Lavar a coluna de extracção 2x com 500 μL de tampão de lavagem suave de cada vez e com centrifugação a 10.000 × g durante 15 s e uma segunda vez durante 2 min. Descarte o fluxo após cada centrifugação.
   13. Centrifugar a coluna na velocidade máxima por 1 min para secar a membrana e descartar o tubo de coleta.
   14. Colocar a coluna de extração em um novo tubo de coleta de 1,5 mL.
   15. Pipetar 50 μL de água livre de RNase para a membrana da coluna e incubar por 3-5 min à temperatura ambiente.
       NOTA: Para concentrações de RNA abaixo de 100 ng, reduzir o volume de eluição para 30 μL e reeluir a membrana da coluna de extração usando o produto da primeira eluição para concentrar o produto final.
   16. Centrifugar a 10.000 × g por 1 min para eluir o RNA.
   17. Medir a concentração de RNA detectando a absorbância a 260 nm usando 0,5-2 μL de amostra. Ajustar a concentração final de RNA para 0,1-1 μg/μL usando água livre de RNase.
   18. Armazenar as alíquotas de RNA a -80 °C para uso posterior.
2. Síntese de DNA complementar
   1. Sintetizar DNA complementar (cDNA) a partir do RNA molde extraído de acordo com o protocolo do fabricante fornecido com o kit (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes).
      NOTA: Um resumo dos reagentes e dos volumes utilizados é mostrado na Tabela 1 e na Tabela 2. Um protocolo completo está detalhado no Arquivo Suplementar 1.
3. Reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real
   1. Para qPCR, execute as amostras de cDNA em triplicatas. Quantificar os níveis de transcrição do RNAm bovino para Ki-67 e IFN-γ usando conjuntos de primers específicos em referência ao gene GAPDH , como mostrado na Tabela 3.
      Observação : um protocolo completo é detalhado no arquivo suplementar 1.

7. Ensaio imunoenzimático

1. Processar os sobrenadantes de cultura coletados ricos em proteínas secretoras para a quantificação de IFN-γ através de ELISA.
   NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o uso do kit. Um protocolo completo está detalhado no Arquivo Suplementar 1.

8. Análise estatística

1. Analisar os dados, e fazer ilustrações gráficas de planejamento experimental utilizando software comercial. Use um teste não paramétrico não pareado para a análise comparativa. Considere-se estatisticamente significante valores de P < 0,05.

Resultados

Esta metodologia descreve a geração in vitro de MoDCs bovinos para a avaliação de antígenos vacinais candidatos antes da realização de estudos in vivo. A Figura 1 ilustra o esquema experimental de geração de MoDC bovina e a aplicação das MoDCs para o ensaio in vitro. Utilizando a técnica de triagem celular de base magnética, foi possível coletar aproximadamente 26 milhões de miócitos CD14⁺ das CMSP colhidas, que foram previamente isoladas...

Discussão

Este estudo demonstra um método padronizado in vitro para geração e fenotipagem de MoDCs bovinas e seu uso subsequente na medição da imunogenicidade vacinal de uma vacina comercial (por exemplo, RV). MoDCs bovinas podem ser usadas como uma ferramenta para rastrear antígenos vacinais potenciais contra doenças de bovinos e prever seu potencial impacto clínico com base em respostas imunes antes de prosseguir para testes in vivo em animais. As MoDCs geradas foram identificadas com base em suas carac...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK Lysing Buffer	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody	Bio-Rad	MCA2678F	Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA2430PE	Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody	Bio-Rad	MCA1653A647	Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA2431F	Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody	Bio-Rad	MCA837F	Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA2437PE	Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	-	Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA	-	Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube	Falcon Corning	352235	5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Germany	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer	Beckman Coulter	-	Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	HSP9601	96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter, Germany	-	Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column	Miltenyi Bioteck, Germany	130-042-401	Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody	Bio-Rad	MCA2228F	Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube	Sigma Aldrich	HS4325	1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point	Microsoft	-	The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA928F	Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD86 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD25 monoclonal antibody
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody	Bio-Rad	MCA929F	Isotype control for MHC class II monoclonal antibody
Nobivac Rabies	MSD Animal Health, UK	-	1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals	Bi0-Rad	TCS0803	0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software	Dotmatics	-	Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody	Biolegend, USA	350501	Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody	Biolegend	400101	Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide	BD Bio Sciences	1351101	Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D System, USA	202-IL-010/CF	Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier	-	Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24	TPP, Switzerland	92024	24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water	Sigma Aldrich	W3500-1L	Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture