Determinación de la inmunogenicidad de la vacuna utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos

Resumen

La metodología describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) y su aplicación para la evaluación in vitro de candidatos antigénicos durante el desarrollo de posibles vacunas veterinarias en bovinos.

Resumen

Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno (APC) más potentes dentro del sistema inmunitario. Patrullan el organismo en busca de patógenos y desempeñan un papel único dentro del sistema inmune al vincular las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Estas células pueden fagocitar y luego presentar antígenos capturados a las células inmunes efectoras, desencadenando una amplia gama de respuestas inmunes. Este documento demuestra un método estandarizado para la generación in vitro de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) aisladas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ganado y su aplicación en la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna.

Se utilizó la clasificación celular magnética para aislar monocitos CD14+ de PBMC, y se utilizó la suplementación de medio de cultivo completo con interleucina (IL)-4 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) para inducir la diferenciación de monocitos CD14⁺ en MoDC naïve. La generación de MoDC inmaduros se confirmó mediante la detección de la expresión de marcadores de superficie celular del complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II), CD86 y CD40. Se utilizó una vacuna contra la rabia disponible comercialmente para pulsar los MoDC inmaduros, que posteriormente se cocultivaron con linfocitos naïve.

El análisis de citometría de flujo de las MoDC pulsadas por antígeno y el cocultivo de linfocitos reveló la estimulación de la proliferación de linfocitos T a través de la expresión de marcadores Ki-67, CD25, CD4 y CD8. El análisis de la expresión de ARNm de IFN-γ y Ki-67, utilizando PCR cuantitativa, mostró que los MoDCs podrían inducir el cebado específico de antígeno de linfocitos en este sistema de cocultivo in vitro . Además, la secreción de IFN-γ evaluada mediante ELISA mostró un título significativamente mayor (**p < 0,01) en el cocultivo de linfocitos MoDC pulsado por la vacuna antirrábica que en el cocultivo de linfocitos MoDC sin antígeno. Estos resultados muestran la validez de este ensayo in vitro MoDC para medir la inmunogenicidad de la vacuna, lo que significa que este ensayo se puede utilizar para identificar posibles candidatos a vacunas para el ganado antes de proceder con ensayos in vivo , así como en evaluaciones de inmunogenicidad de vacunas comerciales.

Introducción

La vacunación veterinaria representa un aspecto crucial de la cría y la salud de los animales, ya que contribuye a mejorar la seguridad alimentaria y el bienestar animal al conferir protección contra las enfermedades que afectan al sector ganadero a nivel mundial¹. Un método in vitro eficaz para evaluar la inmunogenicidad de posibles vacunas candidatas ayudaría a acelerar el proceso de desarrollo y producción de vacunas. Por lo tanto, es necesario ampliar el campo de los ensayos inmunes con metodologías innovadoras basadas en estudios in vitro , ya que esto ayudaría a revelar la complejidad de los procesos inmunes relacionados con la inmunización y la infección por patógenos. Actualmente, la inmunización animal in vivo y los estudios de provocación, que requieren muestreos periódicos (por ejemplo, sangre y bazo), se utilizan para medir la inmunogenicidad de las vacunas candidatas y los adyuvantes. Estos ensayos son costosos, requieren mucho tiempo y tienen implicaciones éticas, porque en la mayoría de los casos, la eutanasia animal se lleva a cabo al final de los ensayos.

Como alternativa a los ensayos in vivo, se han utilizado células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para evaluar las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna in vitro². Las PBMC son una población heterogénea de células compuestas por 70%-90% de linfocitos, 10%-20% de monocitos y un número limitado de células dendríticas (DC, 1%-2%)³. Las PBMC albergan células presentadoras de antígeno (APC) como células B, monocitos y DC, que patrullan constantemente el organismo en busca de signos de infección o daño tisular. Las quimiocinas secretadas localmente facilitan el reclutamiento y la activación de APC en estos sitios al unirse a los receptores de la superficie celular. En el caso de los monocitos, las quimiocinas dirigen su destino para diferenciarse en CD o macrófagos⁴. Tan pronto como las CD encuentran y capturan un patógeno, migran a órganos linfoides secundarios, donde pueden presentar los antígenos peptídicos patógenos procesados utilizando proteínas de superficie de clase I o clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) a las células T CD8+ o a las células T CD4⁺, respectivamente, desencadenando así una respuesta inmune ^5,6.

El papel clave desempeñado por las CD en la orquestación de una respuesta inmune protectora contra diversos patógenos las convierte en un objetivo de investigación interesante para comprender los mecanismos inmunes intracelulares, especialmente cuando se diseñan vacunas y adyuvantes contra agentes infecciosos⁷. Dado que la fracción de CD que se puede obtener de PBMC es bastante pequeña (1% -2%), los monocitos se han utilizado para generar DC in vitro⁸. Estas CD derivadas de monocitos (MoDC) se desarrollaron inicialmente como una posible estrategia de tratamiento en la inmunoterapia contra el cáncer⁹. Más recientemente, los MoDC se han utilizado para la investigación de vacunas 10,11,12^, y los monocitos clásicos son el subtipo predominante (89%) para la producción de MoDC ¹³. La producción de MoDCs in vitro se ha logrado previamente mediante la adición de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) administrado en combinación con otras citocinas como la interleucina-4 (IL-4), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) o IL-13^14,15,16.

El éxito de un ensayo in vitro de MoDC depende de la capacidad de los MoDC maduros estimulados por antígeno para modular el alcance y el tipo de respuesta inmune específica para el tipo de antígeno detectado¹⁷. El tipo de patógeno reconocido y presentado por los MoDC determina la diferenciación de las células CD4⁺ T auxiliares (Th) en células efectoras Th1, Th2 o Th17 y se caracteriza por un perfil de citoquinas secretoras específicas del patógeno. Se provoca una respuesta Th1 contra patógenos intracelulares y da como resultado la secreción de interferón-gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral beta (TNF-β), que modula la protección dependiente fagocítica. Una respuesta Th2 se desencadena contra organismos parásitos y se caracteriza por la secreción de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que inicia la protección humoral independiente fagocítica. Th17 ofrece protección dependiente de neutrófilos contra infecciones bacterianas y fúngicas extracelulares mediadas por la secreción de IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 y TNF-α 18,19,20,21. Sobre la base de estudios previos, se ha observado que no todos los patógenos caen dentro del perfil de citoquinas esperado. Por ejemplo, las MoDC dérmicas, en respuesta a la infección parasitaria por Leishmania, estimulan la secreción de IFN-γ de las células T CD4+ y las células T CD8⁺, induciendo así una respuesta Th1 proinflamatoria^{protectora 22}.

También se ha demostrado que, en pollos MoDCs preparados con lipopolisacárido de Salmonella (LPS), pueden inducir una respuesta variable contra Salmonella typhimurium activando las respuestas Th1 y Th2, mientras que Salmonella gallinarum induce una respuesta Th2 sola, lo que podría explicar la mayor resistencia de este último hacia el aclaramiento de MoDC²³. La activación de MoDCs contra Brucella canis (B. canis) también ha sido reportada tanto en MoDCs caninos como humanos, lo que significa que esto podría representar un mecanismo de infección zoonótica²⁴. Las MoDC humanas preparadas con B. canis inducen una fuerte respuesta Th1 que confiere resistencia a la infección grave, mientras que las MoDC caninas inducen una respuesta Th17 dominante con una respuesta Th1 reducida, lo que posteriormente conduce al establecimiento de una infección crónica²⁵. Los MoCD bovinos muestran una mayor afinidad por el virus de la fiebre aftosa (FMDV) conjugado con inmunoglobulina G (IgG) en comparación con el FMDV no conjugado solo, ya que los MoDC forman un complejo de anticuerpos virales en respuesta a los^{10 primeros}. Tomados en conjunto, estos estudios muestran cómo se han utilizado los MoDC para analizar la complejidad de las respuestas inmunes durante la infección por patógenos. Las respuestas inmunes adaptativas pueden evaluarse mediante la cuantificación de marcadores específicos asociados con la proliferación de linfocitos. Ki-67, una proteína intracelular detectada sólo en células en división, es considerada como un marcador confiable para estudios de proliferación²⁶, y de manera similar, CD25 expresado en la superficie de las células T durante la fase tardía de activación corresponde a la proliferación de linfocitos^27,28.

Este estudio demuestra un método estandarizado para la generación in vitro de MoCD de ganado vacuno seguido de su aplicación en un ensayo inmune in vitro utilizado para probar la inmunogenicidad de las vacunas. Se utilizó una vacuna antirrábica (VD) disponible comercialmente para validar la eficacia de este ensayo. La activación y proliferación de linfocitos T se midió mediante citometría de flujo, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) mediante el análisis de marcadores de activación celular bien establecidos como Ki-67 y CD25 y la secreción de IFN-γ 28,29,30,31. No se realizan ensayos experimentales en animales o humanos durante el ensayo del MoDC.

Protocolo

La extracción de sangre es realizada por un servicio veterinario certificado de acuerdo con las directrices éticas de la Agencia Austriaca de Salud y Seguridad Alimentaria (AGES) y de conformidad con las normas aceptadas de bienestar animal³². El estudio recibió la aprobación ética del Ministerio de Agricultura de Austria. El diseño experimental para la generación de MoDCs y su posterior aplicación se ilustra en la Figura 1.

1. Producción de modCD ingenuos

NOTA: Se obtuvieron muestras de sangre entera de un solo ternero libre de patógenos mediante punción de vena yugular con vacutainers heparinizados (se utilizaron ocho tubos de sangre de 9 ml para este estudio). Transporta la sangre en una nevera. Almacenar las muestras a 2-4 °C para su uso posterior, o procesarlas inmediatamente. Mantenga la sangre girando para evitar la coagulación de la sangre. Esterilizar los vacutainers con etanol al 70%. Todos los siguientes experimentos se realizaron con una muestra biológica y seis réplicas técnicas.

1. Centrifugación por gradiente de densidad para aislar las PBMC de la sangre heparinizada
   1. Mezclar bien la sangre invirtiéndola 10x.
   2. Con una pipeta de 10 ml, transfiera 20 ml de sangre heparinizada a un tubo estéril de 50 ml y dilúyalo con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   3. Pipetear 15 ml de medio de aislamiento de linfocitos a un tubo estéril de 50 ml.
      NOTA: Permita que el medio aislante de linfocitos alcance la temperatura ambiente antes del pipeteo.
   4. Incline el tubo de 50 ml que contiene el medio de aislamiento de linfocitos a una posición de 45°. Apunte la punta de una pipeta de 25 ml perpendicularmente y coloque cuidadosamente los 30 ml de PBS en sangre sobre el medio de aislamiento de linfocitos, sin mezclar los dos. Muy lentamente, vuelva a colocar el tubo de 50 ml en posición vertical.
   5. Centrífuga a 800 × g durante 35 min a 20 °C con aceleración máxima y sin frenado (función de deceleración desactivada).
   6. Utilice una pipeta Pasteur para recoger la capa de PBMC (la capa blanca delgada justo después de la primera capa de plasma) y transfiérala a un nuevo tubo de 50 ml.
      NOTA: La centrifugación por gradiente de densidad separa la sangre entera en diferentes capas. Como resultado, los eritrocitos se asientan en la parte inferior como un gránulo, las células mononucleares (PBMC) se asientan en la capa de interfaz y el plasma forma la capa superior. Los granulocitos se encuentran entre el pellet y la capa de PBMC.
   7. Lave las PBMC cosechadas 2 veces agregando PBS hasta un volumen de 40 ml y mezclando bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 7 min con aceleración máxima y desaceleración máxima.
   8. Deseche el sobrenadante por decantación, resuspenda el pellet en 15 ml de 1x tampón de cloruro de amonio-potasio (ACK) e incube a temperatura ambiente durante 10-15 min.
      NOTA: No incubar por más de 15 min. El tampón ACK disponible comercialmente se utiliza para garantizar la lisis de los glóbulos rojos residuales (RBC) presentes en la fracción PBMC.
   9. Añadir PBS hasta un volumen de 40 ml y, a continuación, centrifugar a 500 × g y 4 °C durante 7 min con aceleración y desaceleración máximas.
   10. Desechar el sobrenadante por decantación y repetir el paso 1.1.9.
   11. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de medio de cultivo completo (a temperatura ambiente).
       NOTA: El medio de cultivo completo está compuesto por medio de cultivo celular RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Separación magnética de las células CD14^+/− de la población PBMC utilizando perlas magnéticas conjugadas CD14
   1. Contar las células con un contador celular hemocitómetro limpio utilizando 10 μL de suspensión celular mezclada con 10 μL de solución de azul de tripano (0,4%).
      NOTA: El colorante azul de tripano es un químico tóxico y potencialmente carcinógeno. Debe manipularse mientras se usa equipo de protección personal (EPP) para evitar el contacto, y los desechos deben desecharse en un contenedor hermético especializado en desechos tóxicos. Las células muertas aparecerán azules, mientras que las células vivas aparecerán claras bajo el microscopio.
   2. Centrifugar durante 7 min a 500 × g.
   3. Desechar el sobrenadante con una pipeta y resuspender el pellet en tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) utilizando un volumen de 40 μL por cada 1 × 10⁷ células. Mezclar bien con una pipeta.
      NOTA: El tampón FACS está compuesto por 2% de FBS y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) disuelto en PBS.
   4. Añadir 5 μL de tampón de microperlas CD14 por 1 × 10⁷ células, y mezclar bien con una pipeta.
   5. Incubar durante 30 min a 4-8 °C para la selección positiva de monocitos bovinos CD14^{+ 33}. Vórtice cada 15 min durante el período de incubación.
   6. Paso opcional (para análisis de citometría de flujo): Añadir 10 μL de anticuerpo de tinción CD14-FITC (isotiocianato de fluoresceína) con posterior incubación durante 15 min a 4-8 °C. Consulte el análisis de citometría de flujo en el paso 5 para obtener más detalles.
   7. Añadir 1 ml de tampón FACS y centrifugar durante 7 min a 500 × g.
   8. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de tampón FACS por 1 × 10⁸ células.
   9. Inserte la columna de separación de células inmunomagnéticas en el separador (soporte de columna magnética) y coloque un tubo de recolección de 15 ml debajo de la salida de la columna para recoger el flujo.
   10. Lave la columna con 1 ml de tampón FACS desgasificado. Después del enjuague, reemplace el tubo usado de 15 ml por uno nuevo.
   11. Dejar pasar la suspensión celular (a partir del paso 1.2.8) a través de la columna pipeteando 1 × 10⁸ celdas en 500 μL de tampón a la vez.
       NOTA: Preste atención a no generar burbujas de aire mientras mezcla las celdas antes de permitirlas pasar por la columna.
   12. Enjuague la columna 3 veces con 3 ml de tampón FACS desgasificado cada vez.
   13. Recoja el flujo y etiquete esta primera fracción eluyida como la fracción de células CD14⁻ (PBMC menos monocitos CD14⁺ ); Esto también se denomina fracción de linfocitos naïve.
       NOTA: Las células CD14⁻ se mantienen en un medio de cultivo completo hasta que se producen las MoDC pulsadas por antígeno.
   14. Retire la columna del separador.
   15. Coloque un nuevo tubo estéril de 15 ml debajo de la columna para la recolección del efluente.
   16. Pipetear 5 ml de tampón FACS en la columna e inmediatamente empujarlo a través de un émbolo.
   17. Recoja el flujo y etiquete esta segunda fracción eluyida como la fracción de células CD14⁺ ; Esto también se llama fracción de monocitos ingenua.
   18. Agregue un medio de cultivo completo a los monocitos CD14⁺ cosechados para alcanzar 1 × 10⁶ células/ml.
       NOTA: Cuente las células vivas en la fracción de células CD14⁺ eluyidas para estimar el volumen de medio de cultivo completo requerido para alcanzar el recuento de células deseado.
   19. Tome una placa estéril de 24 pocillos y agregue 1 ml de la suspensión celular (1 × 10⁶ células/ml) a cada pocillo.
3. Diferenciación de los monocitos naïve CD14⁺ en MoDCs naïve mediante la adición de un cóctel de citoquinas p/v al 3% (GM-CSF + IL-4) con un total de 5 días de incubación
   1. Complemente cada pocillo que contenga monocitos CD14⁺ con 40 μL (3% p/v) del cóctel de citoquinas proporcionado en el kit.
   2. Incubar la placa en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 y a 37 °C durante 48 h.
   3. El día 2, transferir la mitad del contenido de cada pocillo (500 μL) utilizando una pipeta a tubos individuales de 1,5 ml, y centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 7 min.
   4. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de medio de cultivo fresco completo.
   5. Transfiera 500 μL de esta suspensión celular del paso 1.3.4 a cada pocillo designado de modo que el volumen final sea de 1 ml.
   6. Enriquecer cada pocillo con 20 μL de cóctel de citoquinas.
   7. Incubar el cultivo durante 72 h en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 y a 37 °C.
   8. Después de la incubación el día 5, retire la placa de la incubadora.
      NOTA: Cada pocillo contendrá 1 ml de una suspensión celular de MoDC ingenuos. El número de MoDCs será un porcentaje (~20%) de los monocitos originales plateados (1 × 10⁶/mL).

2. Ensayo de actividad endocítica MoDC

NOTA: El ensayo de captación de antígenos o el ensayo de actividad endocítica mide la capacidad de los MoDC ingenuos para internalizar material extraño. Realizar el ensayo utilizando MoDCs naïve cultivadas con cóctel de citoquinas al 3% p/v y con 5 días de incubación, como se describió anteriormente³⁴.

1. Recolecte la suspensión de células MoDC ingenua de la placa de 24 pocillos y transfiérala a un tubo de 15 ml; también recoja las células residuales enjuagando los pocillos con PBS.
2. Centrífuga durante 500 × g durante 7 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo suplementado con FBS al 1%.
3. Contar las células MoDC vivas para estimar el volumen de medio requerido para alcanzar el recuento de células deseado (2 × 10⁵ células/ml).
4. Cultivar las MoDC naïve en 100 μL de medio de cultivo completo en una placa de 24 pocillos con una concentración celular final de 2 × 10⁵ células/ml.
5. Complementar cada pocillo con 1 mg/ml de dextrano conjugado con FITC (sonda fluorescente utilizada como marcador de endocitosis).
   NOTA: El FITC-dextrano actúa como una sonda fluorescente y se utiliza como un trazador de endocitosis.
6. Cubrir el plato e incubar en la oscuridad al 5% de_CO2 y 37 °C durante 60 min.
   NOTA: Para el control de fondo, incubar las células MoDC adicionales (2 × 10⁵ células/ml) con 1 mg/ml de FITC-dextrano en hielo, ya que este tipo de incubación impide la entrada de la molécula trazadora (FITC-dextrano) en las células.
7. Después de la incubación, transfiera inmediatamente la placa de 24 pocillos en hielo para detener la endocitosis de FITC-dextrano.
8. Lave las celdas con tampón FACS helado.
9. Cosechar, centrifugar y resuspender el pellet en 500 μL de tampón FACS.
10. Analizar la intensidad de fluorescencia del FITC-dextrano dentro de las células mediante citometría de flujo. Consulte el análisis por citometría de flujo en el paso 5.2 para obtener más información.

3. Generación de MoDCs pulsados por antígeno

NOTA: Una vacuna comercialmente disponible y clínicamente aprobada contra el virus de la rabia (VD) puede inducir la diferenciación de las MoDC naïve en MoDC portadoras de antígenos maduros. Use 0.1% (~ 1 μL) de una dosis única de vacunación contra el VD para generar MoDC pulsados por antígeno. Además, se prefiere producir MoDC pulsados por RV en la misma placa de cultivo utilizada (en el paso 1.3.8) para generar MoDC ingenuos porque la transferencia de los MoDC ingenuos a una nueva placa de 24 pocillos los afectará negativamente.

1. A partir del paso 1.3.8) Añadir 1 μL/ml de suspensión del VD a 1 ml de cultivo de MoDC naïve en la placa de 24 pocillos e incubar durante 48 h al 5% de_CO2 y 37 °C.
   NOTA: Los MoDC ingenuos cultivados sin estimulación del VD se utilizan como control de fondo (y como estimulación no específica para el cocultivo con linfocitos en los siguientes pasos).
2. Después de la incubación, el día 7, mantenga la placa de 24 pocillos que contiene los MoDC pulsados por antígeno en hielo durante 10 minutos.
3. Agregue 1 ml de PBS helado por pocillo. Mezclar bien cada pocillo mediante pipeteo y transferir la suspensión a un tubo de 15 ml.
4. Lave los pocillos con 2 ml de PBS helado para recoger las células residuales que quedan dentro de cada pocillo.
5. Transfiera el contenido a sus respectivos tubos y centrifugue la suspensión celular a 500 × g durante 7 min.
6. Desechar el sobrenadante, resuspender el pellet celular (MoDC pulsadas por antígeno) en medio de cultivo completo y ajustar el volumen a una concentración celular final de 1 × 10⁵ células/ml.
   NOTA: Cuente las células vivas para estimar el volumen de medio requerido para alcanzar el recuento de células deseado. Use MoDC pulsadas por RV desde el día 7 para el sistema de cocultivo de linfocitos MoDC.

4. Cocultivo de linfocitos MoDC

NOTA: El sistema de cocultivo de linfocitos MoDC in vitro determina la capacidad de los MoDC para preparar linfocitos específicos de antígeno. Los diferentes grupos de tratamiento de células después de 16 días de cocultivo incluyen específicos, no específicos y control. El grupo específico se define como linfocitos cocultivados con MoDC pulsados por RV; el grupo no específico se define como linfocitos cocultivados con MoCD no pulsadas por antígeno; y el grupo control se define como linfocitos cultivados sin MoDC.

1. Añadir medio de cultivo completo a la fracción de linfocitos naïve eluyentes (células CD14⁻ ) para alcanzar una concentración celular de 2 × 10⁶ células/ml.
   NOTA: Cuente las células vivas en el cultivo celular CD14⁻ que se han mantenido en medio de cultivo completo en una placa de 24 pocillos desde su recolección para estimar el volumen de medio requerido para alcanzar el recuento celular deseado.
2. El día 7, tome una placa estéril de 24 pocillos y siembre los pocillos con 1 ml de suspensión de células linfocitarias naïve (2 × 10⁶ células/ml) más 1 ml de suspensión de MoDC pulsada por antígeno o no pulsada por antígeno (1 × 10⁵ células/ml).
   NOTA: El volumen total en cada pocillo será de 2 ml con una proporción de 1:20 MoDCs a linfocitos por pocillo.
3. Incubar la placa durante 48 h a 37 °C y 5% de_CO2.
4. Enriquecimiento y reestimulación del cultivo con MoDC pulsados por antígeno
   1. Después de la incubación del cocultivo de linfocitos MoDC pulsados por antígeno, el día 9, complementar cada pocillo con 20 ng/ml de IL-2 recombinante y continuar incubando durante otras 120 h (5 días de incubación).
   2. El día 14, transferir 1 ml del cocultivo a un tubo estéril de 1,5 ml y centrifugar a 500 × g durante 7 min.
   3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 ml de MoDC pulsadas o no pulsadas por antígeno (1 × 10⁵ células/ml). Mezclar suavemente mediante pipeteo y transferir las suspensiones celulares a sus pozos designados.
      NOTA: En este paso, el volumen total en cada pocillo es de 2 ml.
   4. Continuar con la incubación al 5% de_CO2 y 37 °C durante 48 h. Después de la incubación el día 16, el cocultivo está listo para el análisis mediante citometría de flujo, qPCR y ELISA.
      NOTA: Por cada 2 ml en cada pocillo del cocultivo de linfocitos MoDC, se tiñe 1 ml de células resuspendidas para citometría de flujo, 1 ml se usa para la extracción de ARN y los sobrenadantes de ambos se usan para ELISA.

5. Análisis citométrico de flujo

NOTA: Tiñe las células con marcadores apropiados/mAb antes de ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos (mAb de tinción y controles de isotipo), el kit, el instrumento y el software utilizados para el análisis de citometría de flujo.

1. Protocolo de tinción del citómetro de flujo
   NOTA: Realice la tinción de la superficie celular para las PBMC y los linfocitos y monocitos naïve utilizando anti-CD14 mAb (paso 1.2.6). Para la tinción de la superficie celular de MoDC ingenuas, use mAb anti-CD86-específico, anti-CD40-específico y anti-MHC II-específico. Para la tinción de la superficie celular de las células del día 16 cocultivos, use anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; para la tinción intracelular, use anti-Ki-67 mAb. Además, tiñe las células con control de isotipo negativo mAb o sin mAb (FMO: fluorescente menos uno). La principal diferencia al teñir los marcadores superficiales e intracelulares es que para los marcadores de superficie celular, las células deben teñirse con mAb de superficie específica antes de la tinción viva / muerta (L / D) o cualquier otro proceso. Sin embargo, la tinción intracelular se realiza después de la tinción L / D y requiere un paso de fijación más permeabilización para permitir la penetración intracelular.
   1. Transfiera 1 ml de suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 ml con una pipeta y centrifugar durante 10 minutos a 500 × g.
      NOTA: Después de la centrifugación, al procesar las células del cocultivo de linfocitos MoDC, guarde el sobrenadante para el análisis ELISA.
   2. Resuspender el pellet en 1 ml de PBS y transferirlo a un tubo de 15 ml. Recoja las células residuales usando 1 ml de PBS y combínelo con el pellet resuspendido.
   3. Añadir 10 ml de PBS al tubo de 15 ml que contiene las células, mezclar por pipeteo y centrifugar durante 7 min a 850 x g.
   4. Deseche el sobrenadante y repita el paso 5.1.3.
   5. Desechar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente el pellet celular con la suspensión residual (aproximadamente 180 μL) que queda después de decantar el sobrenadante.
   6. Transfiera la suspensión celular a una placa de 96 pocillos con fondo en V y selle los pozos para evitar derrames.
   7. Centrifugar la placa a 1.400 × g durante 5 min. Después de la centrifugación, mueva la placa sobre un contenedor de residuos para vaciar los pocillos de líquido y golpee la placa con papel absorbente para garantizar la eliminación del exceso de líquido.
   8. Añadir 25 μL de mezcla maestra de tinción superficial por pocillo y mezclar suavemente con una pipeta, seguida de incubación a 4 °C durante 30 min.
      NOTA: Para preparar la mezcla maestra de tinción superficial para un solo pocillo, agregue 2,5 μL de mAb superficial a 20 μL de tampón FACS.
   9. Añadir 200 μL de tampón FACS por pocillo y centrifugar a 1.400 × g durante 5 min. Después de la centrifugación, vacíe los pocillos de líquido por decantación y golpee la placa con papel absorbente para eliminar el exceso de líquido.
   10. Añadir 100 μL de solución de tinción L/D por pocillo. Mezclar bien con una pipeta, seguida de la incubación a 4 °C durante 15 minutos en la oscuridad.
       NOTA: Para un solo pocillo, disuelva 0,25 μL de colorante L/D en 100 μL de tampón FACS. El tinte L/D ayuda a distinguir entre células vivas y muertas.
   11. Añadir 100 μL de tampón FACS. Cubra los pocillos con la tapa y centrifugue la placa durante 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
   12. Repita el paso 5.1.11.
   13. Añadir 50 μL de solución de fijación por pocillo (suministrado con el kit) y mezclar con una pipeta antes de incubar la placa a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min.
   14. Agregue 150 μL del tampón de permeabilización y lavado (PW) 1x provisto con el kit y cubra los pocillos con la tapa.
       NOTA: Para preparar 10 ml de 1x tampón PW, diluir 1 ml de tampón permanente 10x en 10 ml de_dH2O.
   15. Centrifugar la placa a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
   16. Añadir 200 μL de 1x PW, seguido de centrifugación a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
   17. Para la tinción intracelular, agregue 25 μL de mezcla maestra de tinción intracelular (Ki-67 mAb antihumano) por pocillo. Mezclar bien e incubar el plato durante 30 min a 4 °C o en hielo en la oscuridad.
       NOTA: Para preparar la mezcla maestra de tinción intracelular para un solo pocillo, agregue 1 μL de Ki-67 mAb a 24 μL de 1x PW. El marcador de tinción intracelular se utiliza solo cuando se procesan células del cocultivo del día 16. La tinción intracelular no se realiza mientras se procesan PBMC, linfocitos naïve, monocitos y MoDC ingenuos.
   18. Después de la incubación, agregue 200 μL de 1x PW a cada pocillo. Mezclar con una pipeta y centrifugar durante 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
   19. Añadir 200 μL de tampón FACS, seguido de centrifugación a 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee el plato sobre papel absorbente.
   20. Resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón FACS y transferir el contenido de cada pocillo a tubos de citómetro de flujo estéril separados. Utilice 300 μL de tampón FACS por pocillo para recoger las células residuales. Las células ahora están listas para el análisis de citometría de flujo.
2. Ejecución de la muestra en un citómetro de flujo
   NOTA: Las muestras se ejecutaron en un citómetro de flujo (utilizando láseres de 488 nm, 638 nm y 405 nm) de acuerdo con el manual del fabricante³⁵. Consulte el manual para obtener más información, solución de problemas y personalización del protocolo.
   1. Realice procedimientos de limpieza de rutina antes y después de leer las muestras.
      NOTA: No se salte una posición mientras carga los tubos en el instrumento.
      1. Para el ciclo de limpieza, utilice un total de cuatro tubos, con el primer tubo que contiene el reactivo de limpieza de flujo y los tres tubos restantes que contienen dH₂O; cada tubo tendrá 3 mL. Durante la ejecución de limpieza, adquiera datos con un caudal medio durante aproximadamente 1 minuto capturando 100.000 eventos por tubo por debajo de 330 V para dispersión directa (FSC) contra 265 V para dispersión lateral (SSC).
         NOTA: No se deben reportar residuos o eventos celulares durante la limpieza; Si esto sucede, vuelva a realizar el paso de limpieza. Para ejecutar las muestras, asegúrese de que todas las muestras estén en una suspensión homogénea antes de adquirir los datos, ya que esto garantiza una lectura precisa.
   2. Para conectar y encender el citómetro, haga clic en el botón Aplicación ubicado en la esquina izquierda de la barra de título. En el menú desplegable de la aplicación , seleccione la opción Citometría y haga clic en la opción Encender.
      NOTA: En el menú desplegable de la aplicación , la opción Abrir permite a los usuarios navegar a través de los ensayos preprogramados, mientras que la opción Nuevo protocolo permite a los usuarios crear nuevos protocolos.
   3. Cargue inicialmente la muestra de control negativo en el soporte multitubo. Seleccione Nuevo protocolo y observe la lista de trabajo en el lado izquierdo del espacio de trabajo /pantalla.
   4. En la lista de trabajo, defina la posición de la muestra en el soporte multitubo y asigne un nombre a la muestra y el protocolo para su identificación.
   5. Desde el panel de hardware ubicado en el lado izquierdo del espacio de trabajo, ajuste y seleccione múltiples parámetros, como los detectores (FSC, SSC y 10 rangos de fluorescencia), los voltajes (V ) y las ganancias de los fotomultiplicadores, y el área-altura-ancho (AHW) de la señal.
      NOTA: Los siguientes ajustes para los detectores se seleccionaron en función del experimento y el instrumento utilizado: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
   6. Desde el Panel de control de adquisición de instrumentos situado debajo de la barra de título, ajuste las opciones de caudal (medio), Tiempo (5 min) y Eventos (consulte el paso 5.2.8) que desea detectar. Haga clic en la opción Adquirir Single para permitir que el instrumento dibuje/ejecute la muestra y muestre la vista previa en tiempo real de los eventos detectados.
   7. Desde la vista previa en tiempo real, ajuste el umbral de fluorescencia (voltaje y ganancia) y el tamaño de la celda para eventualmente dibujar puertas alrededor de la población celular deseada mientras excluye cualquier residuo celular.
      NOTA: FSC ayuda a distinguir las células en función del tamaño, lo que permite a los usuarios diferenciar entre las células del sistema inmune, como los monocitos y los linfocitos; los monocitos son más grandes y muestran una mayor intensidad de FSC en comparación con los linfocitos.
   8. Adquirir aproximadamente un total de 5.000 MoDC en vivo, 50.000 linfocitos vivos y 50.000 eventos de monocitos en vivo.
   9. Una vez ajustados todos los parámetros en referencia a la muestra de control negativo, haga clic en Detener y guarde el protocolo.
   10. Ahora cargue todas las muestras en el cargador multitubular. Defina cada muestra en la lista de trabajo y aplique los parámetros ajustados en referencia al control negativo a todas las muestras dentro del experimento. Haga clic en la opción Adquirir para permitir que todas las muestras del experimento se ejecuten consecutivamente.
   11. Una vez adquiridos los datos de todas las muestras, guardar y transformar en datos legibles utilizando un software de análisis de datos adecuado que permita la generación de histogramas biparamétricos y monoparamétricos secuenciales.

6. Análisis de expresión de ARN mensajero (ARNm)

1. Extracción de ARN
   NOTA: Extraiga el ARN total del cocultivo de linfocitos MoDC pulsados por antígeno (específico), el cocultivo de linfocitos MoDC no pulsados con antígeno (no específico), el cultivo de linfocitos sin MoDC (control) y de linfocitos naïve (células CD14⁻ aisladas antes del cocultivo). Para la extracción de ARN, prepare etanol con agua libre de RNasa. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el kit de extracción y los reactivos.
   1. Transfiera 1 ml de suspensión celular de la placa de cocultivo de linfocitos MoDC (~1 × 10⁶ células/ml) a un tubo estéril estéril de 1,5 ml con una pipeta y centrifugar durante 10 min a 500 × g.
   2. Guarde el sobrenadante para ELISA. Resuspender el pellet celular en 1 ml de PBS y transferirlo a un tubo de 15 ml. Recoja cualquier célula residual usando 1 ml de PBS.
   3. Centrifugar durante 10 min a 500 × g.
      NOTA: Todas las muestras deben manipularse delicadamente como células vivas hasta que la lisis celular se lleve a cabo utilizando el tampón de lisis proporcionado en el kit. La muerte celular libera RNasas que hidrolizan rápidamente las plantillas de ARN necesarias para la cuantificación aguas abajo. El tampón RLT lisa las células en una solución que inhibe las RNasas.
   4. Agregue 350 μL de tampón de lisis a cada pocillo vacío e incube durante 2-3 minutos para lisar las células adherentes que no se cosecharon en los pasos anteriores.
   5. Una vez completada la centrifugación de la etapa 6.1.3, desechar el sobrenadante y combinar el pellet celular con los 350 μL de tampón de lisis añadidos en el paso 6.1.4.
      NOTA: En este punto, es posible almacenar los tubos a -80 °C o proceder con la extracción de ARN (siguiendo los pasos).
   6. Pipetear 350 μL de etanol al 70% al lisado en la etapa 6.1.5. El volumen final por muestra es de 700 μL.
   7. Inserte la columna de extracción dentro de un tubo de recolección de 2 ml (incluido con el kit).
   8. Transfiera los 700 μL de muestra por columna de extracción y centrifuga a 10.000 × g durante 15 s. Deseche el flujo en el tubo de recolección y vuelva a colocarlo en la columna de centrifugado.
   9. En la columna de extracción, agregue 350 μL de tampón de lavado estricto (incluido en el kit) y centrifugar a más de 10,000 × g durante 15 s. Deseche el flujo continuo.
   10. Añadir 80 μL de mezcla de incubación de DNasa I por muestra sobre la membrana de la columna de extracción y dejar reposar durante 15 min a 20-30 °C.
       NOTA: Para preparar la mezcla de incubación de DNasa I por muestra, agregue 10 μL de solución madre de DNasa I a 70 μL de tampón DNasa para un volumen final de 80 μL. Mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces, seguido de un breve giro en la centrífuga.
   11. Lavar la columna de extracción con 350 μL de tampón de lavado estricto, seguido de centrifugación a 10.000 × g durante 15 min. Deseche el flujo en el tubo de recolección después de la centrifugación.
   12. Lavar la columna de extracción 2x con 500 μL de tampón de lavado suave cada vez y con centrifugación a 10.000 × g durante 15 s y una segunda vez durante 2 min. Deseche el flujo después de cada centrifugación.
   13. Centrifugar la columna a velocidad máxima durante 1 min para secar la membrana y desechar el tubo de recolección.
   14. Coloque la columna de extracción en un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml.
   15. Pipetear 50 μL de agua libre de RNasa sobre la membrana de la columna e incubar durante 3-5 min a temperatura ambiente.
       NOTA: Para concentraciones de ARN inferiores a 100 ng, reducir el volumen de elución a 30 μL y volver a eluyir la membrana de la columna de extracción utilizando el producto de la primera elución para concentrar el producto final.
   16. Centrifugar a 10.000 × g durante 1 min para eluyir el ARN.
   17. Mida la concentración de ARN detectando la absorbancia a 260 nm utilizando 0,5-2 μL de muestra. Ajuste la concentración final de ARN a 0.1-1 μg/μL usando agua libre de RNasa.
   18. Conservar las alícuotas de ARN a −80 °C para su uso posterior.
2. Síntesis de ADN complementario
   1. Sintetice ADN complementario (ADNc) a partir del ARN plantilla extraído de acuerdo con el protocolo del fabricante proporcionado con el kit (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
      NOTA: En la Tabla 1 y la Tabla 2 se muestra un resumen de los reactivos y los volúmenes utilizados. Un protocolo completo se detalla en el Archivo Suplementario 1.
3. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
   1. Para qPCR, ejecute las muestras de ADNc por triplicado. Cuantificar los niveles de transcripción del ARNm bovino para Ki-67 e IFN-γ utilizando conjuntos de cebadores específicos en referencia al gen GAPDH , como se muestra en la Tabla 3.
      NOTA: Un protocolo completo se detalla en el Archivo Suplementario 1.

7. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

1. Procesar los sobrenadantes de cultivo recolectados ricos en proteínas secretoras para la cuantificación de IFN-γ a través de ELISA.
   NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el uso del kit. Un protocolo completo se detalla en el Archivo Suplementario 1.

8. Análisis estadístico

1. Analizar los datos y hacer ilustraciones gráficas de diseño experimental utilizando software comercial. Utilice una prueba no paramétrica no pareada para el análisis comparativo. Considere que los valores de p < 0.05 son estadísticamente significativos.

Resultados

Esta metodología describe la generación in vitro de MoDCs de ganado para la evaluación de antígenos vacunales candidatos antes de realizar estudios in vivo. La Figura 1 ilustra el esquema experimental de generación de MoDC bovino y la aplicación de los MoDC para el ensayo in vitro. Utilizando la técnica de clasificación celular de base magnética, fue posible recolectar aproximadamente 26 millones de miocitos CD14 ⁺ de las PBMC recolectadas, que ...

Discusión

Este estudio demuestra un método in vitro estandarizado para generar y fenotipificar MoCD bovinos y su posterior uso en la medición de la inmunogenicidad de la vacuna de una vacuna comercial (por ejemplo, RV). Los MoDC bovinos se pueden utilizar como una herramienta para detectar posibles antígenos de vacunas contra enfermedades del ganado y predecir su posible impacto clínico en función de las respuestas inmunes antes de proceder a ensayos in vivo en animales. Los MoDCs generados fueron identifica...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK Lysing Buffer	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody	Bio-Rad	MCA2678F	Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA2430PE	Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody	Bio-Rad	MCA1653A647	Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA2431F	Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody	Bio-Rad	MCA837F	Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA2437PE	Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	-	Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA	-	Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube	Falcon Corning	352235	5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Germany	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer	Beckman Coulter	-	Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	HSP9601	96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter, Germany	-	Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column	Miltenyi Bioteck, Germany	130-042-401	Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody	Bio-Rad	MCA2228F	Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube	Sigma Aldrich	HS4325	1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point	Microsoft	-	The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA928F	Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD86 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD25 monoclonal antibody
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody	Bio-Rad	MCA929F	Isotype control for MHC class II monoclonal antibody
Nobivac Rabies	MSD Animal Health, UK	-	1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals	Bi0-Rad	TCS0803	0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software	Dotmatics	-	Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody	Biolegend, USA	350501	Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody	Biolegend	400101	Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide	BD Bio Sciences	1351101	Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D System, USA	202-IL-010/CF	Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier	-	Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24	TPP, Switzerland	92024	24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water	Sigma Aldrich	W3500-1L	Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture