使用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性

摘要

该方法描述了牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）的产生及其在牛潜在兽用疫苗开发过程中抗原候选物体 外评估中的 应用。

摘要

树突状细胞（DC）是免疫系统中最有效的抗原呈递细胞（APC）。它们在生物体中巡逻寻找病原体，并通过连接先天性和适应性免疫反应在免疫系统中发挥独特的作用。这些细胞可以吞噬细胞，然后将捕获的抗原呈递给效应免疫细胞，从而引发多种免疫反应。本文展示了从牛外周血单核细胞（PBMCs）中分离的牛单核细胞来源的树突状细胞（MoD）的体 外 生成标准化方法及其在疫苗免疫原性评估中的应用。

采用磁性细胞分选从PBMC中分离CD14+单核细胞，并用白细胞介素（IL）-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）补充完全培养基诱导CD14⁺单核细胞分化为幼稚MoDC。通过检测主要组织相容性复合物II（MHC II），CD86和CD40细胞表面标志物的表达来确认未成熟MoDC的产生。市售狂犬病疫苗用于冲击未成熟的MoDC，随后与幼稚淋巴细胞共培养。

抗原脉冲MoDC和淋巴细胞共培养的流式细胞术分析揭示了通过Ki-67，CD25，CD4和CD8标志物的表达刺激T淋巴细胞增殖。使用定量PCR分析 IFN-γ 和 Ki-67的mRNA表达表明，MoDCs可以在该 体外 共培养系统中诱导淋巴细胞的抗原特异性启动。此外，使用 ELISA 评估的 IFN-γ 分泌显示，狂犬病疫苗脉冲 MoDC 淋巴细胞共培养的滴度 （**p < 0.01） 显著高于非抗原脉冲 MoDC 淋巴细胞共培养。这些结果表明，这种 体外 MoDC测定法测量疫苗免疫原性的有效性，这意味着该测定可用于在进行 体内 试验之前确定牛的潜在候选疫苗，以及商业疫苗的疫苗免疫原性评估。

引言

兽医疫苗接种是畜牧业和健康的一个重要方面，因为它通过提供保护，防止影响全球畜牧业的疾病，有助于改善粮食安全和动物福利¹。评估可能候选疫苗的免疫原性的有效体 外 方法将有助于加速疫苗的开发和生产过程。因此，有必要通过基于 体外 研究的创新方法来扩展免疫测定领域，因为这将有助于揭示与免疫和病原体感染相关的免疫过程的复杂性。目前，需要定期取样（例如血液和脾脏）的 体内 动物免疫和激发研究用于测量候选疫苗和佐剂的免疫原性。这些检测昂贵、耗时且具有伦理意义，因为在大多数情况下，动物安乐死是在试验结束时进行的。

作为体内测定的替代方法，外周血单核细胞（PBMC）已被用于评估疫苗诱导的体外免疫反应²。PBMC是由70%-90%的淋巴细胞，10%-20%的单核细胞和有限数量的树突状细胞（DC，1%-^{2%）组成的}异质细胞群3。PBMC含有抗原呈递细胞（APC），例如B细胞，单核细胞和DC，它们不断巡逻生物体，寻找感染或组织损伤的迹象。局部分泌的趋化因子通过与细胞表面受体结合，促进APCs在这些位点的募集和激活。在单核细胞的情况下，趋化因子引导它们的命运分化成DC或巨噬细胞⁴。一旦DC遇到并捕获病原体，它们就会迁移到次级淋巴器官，在那里它们可以分别使用主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类表面蛋白将加工过的病原体肽抗原呈递到CD8 + T细胞或CD4 ⁺ T细胞，从而触发免疫反应^5，6。

DC在协调针对各种病原体的保护性免疫应答中发挥的关键作用使其成为了解细胞内免疫机制的有趣研究目标，特别是在设计针对^{感染因子的}疫苗和佐剂时7。由于可以从PBMC获得的DC比例相当小（1%-2%），因此单核细胞已被用于体外产生^DC。这些单核细胞衍生的DC（MoDC）最初是作为癌症免疫治疗中可能的治疗策略开发的⁹。最近，MoDC已被用于疫苗研究10，¹¹，12^，经典单核细胞是MoDC生产的主要亚型（89%）¹³。MoDCs的体外生产以前是通过添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与其他细胞因子（如白细胞介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）或IL-13^14，15，¹⁶）联合给药来实现的。

体外MoDC测定的成功依赖于抗原刺激的成熟MoDC调节特定于检测到的抗原类型的免疫反应的程度和类型的能力¹⁷。MoDCs识别和呈递的病原体类型决定了CD4⁺ T辅助（Th）细胞分化为Th1，Th2或Th17效应细胞，并且以病原体特异性分泌细胞因子谱为特征。针对细胞内病原体引发Th1反应，并导致干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子β（TNF-β）的分泌，后者调节吞噬细胞依赖性保护。针对寄生生物触发 Th2 反应，其特征在于 IL-4、IL-5、IL-10 和 IL-13 分泌，从而启动吞噬细胞非依赖性体液保护。Th17 提供中性粒细胞依赖性保护，防止由分泌 IL-17、IL-17F、IL-6、IL-22 和 TNF-α^18、19、^20、21 介导的细胞外细菌和真菌感染。根据以前的研究，已经注意到并非所有病原体都属于预期的细胞因子谱。例如，皮肤MoDCs响应利什曼原虫寄生虫感染，刺激CD4 + T细胞和CD8 ⁺ T细胞分泌IFN-γ，从而诱导保护性促炎Th1反应²²。

研究还表明，在用沙门氏菌脂多糖（LPS）引发的鸡MoDC中，可以通过激活Th1和Th2反应来诱导对鼠伤寒沙门氏菌的可变反应，而加里纳鲁沙门氏菌单独诱导Th2反应，这可以解释后者对MoDC清除率的更高抵抗力²³。在犬和人类MoDC中也报道了针对犬布鲁氏菌（B. canis）的MoDCs的激活，这意味着这可能代表人畜共患感染机制²⁴。用犬双歧杆菌引发的人类MoDC诱导强烈的Th1反应，赋予对严重感染的抵抗力，而犬MoDC诱导显性Th17反应，Th1反应降低，随后导致慢性感染的建立²⁵。与单独使用非结合的口蹄疫病毒相比，牛 MoDC 对与免疫球蛋白 G （IgG） 偶联的口蹄疫病毒 （FMDV） 的亲和力增强，因为 MoDC 形成病毒抗体复合物以响应前¹⁰ 种病毒抗体复合物。综上所述，这些研究显示了MoDC如何用于分析病原体感染期间免疫反应的复杂性。适应性免疫应答可以通过量化与淋巴细胞增殖相关的特定标志物来评估。Ki-67是一种仅在分裂细胞中检测到的细胞内蛋白，被认为是增殖研究的可靠标志物²⁶，同样，在活化后期在T细胞表面表达的CD25对应于淋巴细胞增殖^27，28。

本研究展示了一种用于体外产生牛MoDC的标准化方法，然后将其应用于用于测试疫苗免疫原性的体外免疫测定中。市售狂犬病疫苗（RV）用于验证该测定的有效性。通过流式细胞术、实时定量聚合酶链反应（qPCR）和酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定T淋巴细胞活化和增殖，分析成熟的细胞活化标志物（如Ki-67和CD25）以及IFN-γ²⁸，^29，30，31的分泌。在MoDC测定期间不进行动物或人体实验试验。

研究方案

采血由经过认证的兽医服务机构根据奥地利卫生和食品安全局（AGES）的道德准则进行，并符合公认的动物福利标准³²。该研究获得了奥地利农业部的伦理批准。 MoDCs生成的实验设计及其后续应用如图1所示。

1. 生产幼稚的MoDC

注意:全血样本是通过颈静脉穿刺和肝素化真空管从单个无病原体的小牛获得的（本研究使用了八个 9 mL 血管）。将血液装在保温箱中运输。将样品储存在2-4°C以备后用，或立即处理。保持血液旋转以避免血液凝固。用70%乙醇对真空容器进行消毒。以下所有实验均使用一个生物样品和六个技术重复进行。

1. 密度梯度离心，从肝素化血液中分离PBMC
   1. 通过将血液倒置 10 倍来充分混合血液。
   2. 使用 10 mL 移液器将 20 mL 肝素化血液转移到无菌 50 mL 管中，并用 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 稀释。
   3. 将 15 mL 淋巴细胞分离培养基移液到无菌 50 mL 管中。
      注意:在移液前让淋巴细胞分离培养基达到室温。
   4. 将含有淋巴细胞分离培养基的 50 mL 管倾斜至 45° 位置。将 25 mL 移液器的尖端垂直点准，并小心地将 30 mL 的 blood-PBS 层叠在淋巴细胞分离培养基上，不要将两者混合。非常缓慢地将 50 mL 管放回垂直位置。
   5. 在20°C下以800× g 离心35分钟，最大加速度且不制动（减速功能关闭）。
   6. 使用巴斯德移液器收集PBMC层（紧接第一层血浆之后的白色薄层）并将其转移到新的50 mL管中。
      注意:密度梯度离心将全血分离成不同的层。结果，红细胞以沉淀的形式沉淀在底部，单核细胞（PBMC）沉淀在界面层，血浆形成顶层。粒细胞位于沉淀和PBMC层之间。
   7. 通过添加最大体积为 40 mL 的 PBS 并上下移液彻底混合来清洗收获的 PBMC 2 倍。然后，在4°C下以500× g 离心7分钟，最大加速度和最大减速。
   8. 通过倾析弃去上清液，将沉淀重悬于15mL的1x氯化铵钾（ACK）缓冲液中，并在室温下孵育10-15分钟。
      注意:孵育时间不要超过15分钟。市售的ACK缓冲液用于确保PBMC级分中残留红细胞（RBC）的裂解。
   9. 加入PBS至40mL体积，然后在500× g 和4°C下以最大加速和减速离心7分钟。
   10. 倾析弃去上清液，重复步骤1.1.9。
   11. 弃去上清液，并将沉淀重悬于10mL完全培养基中（室温下）。
       注意:完整的培养基由补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素链霉素的RPMI 1640细胞培养基组成。
2. 使用 CD14 偶联磁珠从 PBMC 群体中磁分离 CD14^+/− 细胞
   1. 使用干净的血细胞计数器计数细胞，使用 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝 （0.4%） 溶液混合。
      注意:台盼蓝染料是一种有毒化学物质和潜在的致癌物质。应在佩戴个人防护装备（PPE）时进行处理，以避免接触，废物应丢弃在密封的专用有毒废物容器中。死细胞会呈现蓝色，而活细胞在显微镜下会显得清晰。
   2. 以500 ×g离心7分钟。
   3. 使用移液管弃去上清液，并将沉淀重悬于荧光激活细胞分选缓冲液（FACS）中，每1×10⁷ 个细胞使用40μL的体积。用移液管充分混合。
      注意:FACS缓冲液由溶解在PBS中的2%FBS和2mM乙二胺四乙酸（EDTA）组成。
   4. 每 1 × 10⁷ 个细胞加入 5 μL CD14 微珠缓冲液，并使用移液器充分混合。
   5. 在4-8°C孵育30分钟，以阳性选择牛CD14 ⁺ 单核细胞³³。在孵育期间每15分钟涡旋一次。
   6. 可选步骤（用于流式细胞术分析）:加入10μLCD14-FITC（异硫氰酸荧光素）染色抗体，随后在4-8°C孵育15分钟。 有关详细信息，请参阅步骤 5 中的流式细胞术分析。
   7. 加入 1 mL FACS 缓冲液，并以 500 × g 离心 7 分钟。
   8. 弃去上清液，并将沉淀重悬于每 1 × 10⁸ 个细胞的 500 μL FACS 缓冲液中。
   9. 将免疫磁性细胞分离柱插入分离器（磁性柱支架），并在色谱柱出口下方放置15 mL收集管以收集流出物。
   10. 用 1 mL 脱气的 FACS 缓冲液洗涤色谱柱。冲洗后，用新的管更换用过的 15 mL 管。
   11. 通过一次在500μL缓冲液中移取1×10⁸ 个细胞，使细胞悬液（来自步骤1.2.8）通过色谱柱。
       注意:在允许细胞通过色谱柱之前，请注意在混合细胞时不要产生气泡。
   12. 每次用 3 mL 脱气的 FACS 缓冲液冲洗色谱柱 3 倍。
   13. 收集流出物，并将第一个洗脱部分标记为CD14⁻ 细胞级分（PBMC减去CD14 ⁺ 单核细胞）;这也被称为幼稚淋巴细胞部分。
       注意:CD14⁻ 细胞维持在完整的培养基中，直到产生抗原脉冲MoDC。
   14. 从分隔符中删除列。
   15. 在色谱柱下方放置一个新的无菌 15 mL 管以收集流出物。
   16. 将 5 mL FACS 缓冲液移入色谱柱中，并立即使用柱塞将其推入。
   17. 收集流出物，并将第二个洗脱部分标记为CD14 ⁺ 细胞级分;这也称为幼稚单核细胞分数。
   18. 将完全培养基添加到收获的CD14 ⁺ 单核细胞中，以获得1×10⁶ 个细胞/ mL。
       注意:计数洗脱的CD14 ⁺ 细胞级分中的活细胞，以估计获得所需细胞计数所需的完整培养基的体积。
   19. 取无菌 24 孔板，向每个孔中加入 1 mL 细胞悬液 （1 × 10⁶ 个细胞/mL）。
3. 通过添加 3% w/v 细胞因子混合物 （GM-CSF + IL-4） 将 CD14⁺ 幼稚单核细胞分化为幼稚 MoDC，总共孵育 5 天
   1. 用试剂盒中提供的 40 μL （3% w/v） 细胞因子混合物补充每个含有 CD14⁺ 单核细胞的孔。
   2. 将板在含有5%CO₂ 的加湿培养箱中孵育，并在37°C下孵育48小时。
   3. 在第 2 天，使用移液器将每个孔内容物的一半 （500 μL） 转移到单独的 1.5 mL 管中，并在 4 °C 下以 500 × g 离心 7 分钟。
   4. 弃去上清液，并将沉淀重悬于500μL新鲜完全培养基中。
   5. 将步骤 1.3.4 中的 500 μL 该细胞悬液转移回每个指定孔中，使最终体积为 1 mL。
   6. 用 20 μL 细胞因子混合物富集每个孔。
   7. 将培养物在含有5%CO₂ 的加湿培养箱中并在37°C下孵育72小时。
   8. 在第5天孵育后，从培养箱中取出板。
      注意:每个孔将包含 1 mL 的朴素 MoDC 细胞悬液。MoDC 的数量将是接种的原始单核细胞的百分比 （~20%） （1 ×^{10 6}/mL）。

2. MoDC内吞活性测定

注意:抗原摄取测定或内吞活性测定测量幼稚MoDC内化异物的能力。使用用 3% w/v 细胞因子混合物培养并孵育 5 天的幼稚 MoDC 进行测定，如前所述³⁴。

1. 从 24 孔板中收获朴素的 MoDC 细胞悬液，并将其转移到 15 mL 管中;还通过用PBS冲洗孔来收集任何残留细胞。
2. 离心500× g7 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于补充有1%FBS的1mL培养基中。
3. 对活 MoDC 细胞进行计数，以估计获得所需细胞计数所需的培养基体积（2 × 10⁵ 个细胞/mL）。
4. 在 24 孔板中的 100 μL 完全培养基中培养幼稚的 MoDC，最终细胞浓度为 2 ×^{10 5} 个细胞/mL。
5. 用 1 mg/mL FITC偶联葡聚糖（用作内吞示踪剂的荧光探针）补充每个孔。
   注意:FITC-葡聚糖用作荧光探针，并用作内吞示踪剂。
6. 盖上板，并在5%CO₂ 和37°C的黑暗中孵育60分钟。
   注意:对于背景对照，将额外的MoDC细胞（2×10⁵ 个细胞/mL）与1 mg/mL FITC-葡聚糖在冰上孵育，因为这种类型的孵育可防止示踪分子（FITC-葡聚糖）进入细胞。
7. 孵育后，立即将24孔板转移到冰上以停止FITC-葡聚糖的内吞作用。
8. 用冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞。
9. 收获、离心并将沉淀重悬于 500 μL FACS 缓冲液中。
10. 使用流式细胞术分析细胞内FITC-葡聚糖的荧光强度。有关详细信息，请参阅步骤5.2中的流式细胞术分析。

3. 抗原脉冲MoDC的产生

注意:市售且临床批准的狂犬病病毒 （RV） 疫苗可诱导幼稚 MoDC 分化为成熟的抗原呈递 MoDC。使用单次 RV 疫苗接种剂量的 0.1% （~1 μL） 来生成抗原脉冲 MoDC。此外，优选在用于（在步骤1.3.8中）的相同培养板中生产RV脉冲MoDC，以产生朴素MoDC，因为将朴素MoDC转移到新的24孔板会对它们产生负面影响。

1. 从步骤1.3.8）将1μL / mL的RV悬浮液加入24孔板中的1mL朴素MoDC培养物中，并在5%CO₂ 和37°C下孵育48小时。
   注意:在没有RV刺激的情况下培养的幼稚MoDC用作背景对照（并在后续步骤中用作与淋巴细胞共培养的非特异性刺激）。
2. 孵育后，在第7天，将含有抗原脉冲MoDC的24孔板在冰上保持10分钟。
3. 每孔加入 1 mL 冰冷的 PBS。通过移液彻底混合每个孔，并将悬浮液转移到 15 mL 管中。
4. 用 2 mL 冰冷的 PBS 洗涤孔，以收集每个孔内残留的细胞。
5. 将内容物转移到各自的管中，并以500× g 离心细胞悬液7分钟。
6. 弃去上清液，将细胞沉淀（抗原脉冲MoDC）重悬于完全培养基中，并将体积调节至最终细胞浓度为1×10⁵ 个细胞/ mL。
   注意:对活细胞进行计数以估计达到所需细胞计数所需的培养基体积。从第 7 天开始将右心室脉冲 MoDC 用于 MoDC 淋巴细胞共培养系统。

4. MoDC-淋巴细胞共培养

注意: 体外 MoDC 淋巴细胞共培养系统决定了 MoDC 引发抗原特异性淋巴细胞的能力。共培养16天后细胞的不同处理组包括特异性，非特异性和对照组。特定组定义为与右心室脉冲 MoDC 共培养的淋巴细胞;非特异性组定义为与非抗原脉冲 MoDC 共培养的淋巴细胞;对照组定义为无MoDC培养的淋巴细胞。

1. 将完全培养基加入洗脱的幼稚淋巴细胞组分（CD14⁻ 细胞）中，以达到2×10⁶ 细胞/ mL的细胞浓度。
   注意:计数CD14⁻ 细胞培养物中的活细胞，这些活细胞自收集以来一直保持在24孔板的完整培养基中，以估计获得所需细胞计数所需的培养基体积。
2. 在第 7 天，取无菌 24 孔板，并用 1 mL 幼稚淋巴细胞悬液（2 × 10⁶ 细胞/mL）加上 1 mL 抗原脉冲或非抗原脉冲 MoDC 悬浮液（1 × 10⁵ 细胞/mL）。
   注意:每个孔中的总体积将为 2 mL，每孔与淋巴细胞的比例为 1:20 MoDC。
3. 将板在37°C和5%CO₂下孵育48小时。
4. 使用抗原脉冲 MoDC 进行培养富集和再刺激
   1. 在抗原脉冲MoDC-淋巴细胞共培养物孵育后，在第9天，用20ng / mL重组IL-2补充每个孔，并继续孵育另外120小时（孵育5天）。
   2. 在第 14 天，将 1 mL 共培养物转移到无菌 1.5 mL 管中，并以 500 × g 离心 7 分钟。
   3. 弃去上清液，并用 1 mL 抗原脉冲或非脉冲 MoDC（1 × 10⁵ 细胞/mL）重悬细胞沉淀。通过移液轻轻混合，然后将细胞悬浮液转移回其指定的孔中。
      注意:在此步骤中，每个孔中的总体积为2 mL。
   4. 继续在5%CO₂ 和37°C下孵育48小时。在第16天孵育后，共培养物准备好使用流式细胞术，qPCR和ELISA进行分析。
      注意:对于MoDC-淋巴细胞共培养的每个孔中每2 mL，将1 mL重悬细胞染色用于流式细胞术，1 mL用于RNA提取，并且两者的上清液用于ELISA。

5. 流式细胞术分析

注意:在流式细胞仪上运行样品之前，用适当的标记物/mAb对细胞进行染色。有关用于流式细胞术分析的试剂（染色mAb和同种型对照）、试剂盒、仪器和软件的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 流式细胞仪染色方案
   注意:使用抗CD14 mAb对PBMC和幼稚淋巴细胞和单核细胞进行细胞表面染色（步骤1.2.6）。对于幼稚MoDC的细胞表面染色，请使用抗CD86特异性，抗CD40特异性和抗MHC II特异性mAb。对于第16天共培养的细胞表面染色，使用抗CD4，抗CD8，抗CD25 mAb;对于细胞内染色，使用抗Ki-67 mAb。此外，用阴性同种型对照mAb或不含mAb（FMO:荧光减一）染色细胞。对表面和细胞内标志物进行染色时的主要区别在于，对于细胞表面标志物，必须在活/死（L/D）染色或任何其他过程之前用特定的表面mAb对细胞进行染色。然而，细胞内染色是在L/D染色后进行的，需要固定加透化步骤以允许细胞内渗透。
   1. 使用移液器将 1 mL 细胞悬液转移到无菌 1.5 mL 管中，并以 500 × g 离心 10 分钟。
      注意:离心后，当处理来自MoDC-淋巴细胞共培养物的细胞时，保存上清液用于ELISA分析。
   2. 将沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并将其转移到 15 mL 管中。使用 1 mL PBS 收集残留细胞，并将其与重悬沉淀相结合。
   3. 将 10 mL PBS 加入包含细胞的 15 mL 管中，通过移液混合，并以 850 x g 离心 7 分钟。
   4. 弃去上清液，重复步骤5.1.3。
   5. 弃去上清液，并小心地用倾析上清液后剩余的残留悬浮液（约180μL）重悬细胞沉淀。
   6. 将细胞悬液转移到V底96孔板中，并密封孔以避免溢出。
   7. 将板以1，400× g 离心5分钟。离心后，将板轻弹到废物容器上以清空液体孔，然后将板敲击在吸收纸上以确保去除多余的液体。
   8. 每孔加入 25 μL 表面染色预混液，并使用移液管轻轻混合，然后在 4 °C 下孵育 30 分钟。
      注意:要为单个孔制备表面染色预混液，请将 2.5 μL 表面 mAb 添加到 20 μL FACS 缓冲液中。
   9. 每孔加入 200 μL FACS 缓冲液，并以 1，400 × g 离心 5 分钟。离心后，通过倾析清空液体孔，并在吸收纸上敲击板以除去多余的液体。
   10. 每孔加入 100 μL L/D 染色溶液。使用移液管充分混合，然后在4°C下在黑暗中孵育15分钟。
       注意:对于单个孔，将 0.25 μL L/D 染料溶解在 100 μL FACS 缓冲液中。L/D染料有助于区分活细胞和死细胞。
   11. 加入 100 μL FACS 缓冲液。盖上盖子盖住孔，将板离心1，400 × g5 分钟。通过倾析丢弃上清液，并在吸水纸上敲击板。
   12. 重复步骤 5.1.11。
   13. 每孔加入 50 μL 固定溶液（随试剂盒提供），并与移液管混合，然后将板在室温下在黑暗中孵育 10 分钟。
   14. 加入试剂盒随附的 150 μL 1x 透化洗涤缓冲液 （PW），并盖上盖子覆盖孔。
       注意:要制备 10 mL 的 1x PW 缓冲液，请将 1 mL 的 10x 烫发缓冲液稀释在 10 mL_{dH 2}O 中。
   15. 将板在4°C下以1，400× g 离心5分钟。通过倾析丢弃上清液，并在吸水纸上敲击板。
   16. 加入 200 μL 的 1x PW，然后在 4 °C 下以 1，400 × g 离心 5 分钟。通过倾析丢弃上清液，并在吸水纸上敲击板。
   17. 对于细胞内染色，每孔加入 25 μL 细胞内染色预混液（抗人 Ki-67 mAb）。充分混合，并将板在4°C或在黑暗中的冰上孵育30分钟。
       注意:要为单个孔制备细胞内染色预混液，请将 1 μL Ki-67 mAb 加入 24 μL 1x PW 中。细胞内染色标记仅在处理来自第16天共培养的细胞时使用。在处理 PBMC、幼稚淋巴细胞、单核细胞和幼稚 MoDC 时不进行细胞内染色。
   18. 孵育后，向每个孔中加入 200 μL 1x PW。用移液管混合，离心1，400 × g 5分钟。通过倾析丢弃上清液，并在吸水纸上敲击板。
   19. 加入 200 μL FACS 缓冲液，然后以 1，400 × g 离心 5 分钟。倾析弃去上清液，并在吸收纸上敲击平板。
   20. 将细胞沉淀重悬于 200 μL FACS 缓冲液中，并将每个孔的内容物转移到单独的无菌流式细胞仪管中。每孔使用 300 μL FACS 缓冲液收集残留细胞。细胞现在已准备好进行流式细胞术分析。
2. 在流式细胞仪上运行样品
   注意:根据制造商手册，样品在流式细胞仪（使用488 nm，638 nm和405 nm激光器）上运行³⁵.有关协议的详细信息、故障排除和自定义，请参阅手册。
   1. 在读取样品之前和之后执行常规清洁程序。
      注意: 在仪器中装入试管时不要跳过位置。
      1. 对于清洁周期，总共使用四个管，第一个管子装有流动清洁剂，其余三个管子含有dH₂O;每个试管将有 3 mL。在清洁运行期间，通过捕获每个管子在 330 V 下用于前向散射 （FSC） 和 265 V 用于侧向散射 （SSC） 的每个管捕获 100，000 个事件，以中等流速采集数据约 1 分钟。
         注意:清洁过程中不应报告碎屑或蜂窝事件;如果发生这种情况，请再次执行清洁步骤。对于运行样品，请确保在获取数据之前所有样品都处于均匀悬浮液中，因为这可确保准确的读数。
   2. 要连接并打开细胞仪电源，请单击标题栏左上角的应用程序 按钮 。从 应用程序 下拉菜单中，选择选项 细胞术，然后单击选项开 机。
      注意:从 应用程序 下拉菜单中， 选项打开 允许用户浏览预编程的检测，而 选项新协议 允许用户创建新方案。
   3. 最初将 阴性对照 样品装入多管支架中。选择 "新建协议"，然后观察工作区/屏幕左侧的工作 列表 。
   4. 在工作清单上，定义样品在多管支架中的位置，并为样品命名和方案以进行识别。
   5. 从位于工作区左侧的硬件面板中，调整并选择多个参数，例如检测器（FSC、SSC 和 10 个荧光范围）、光电倍增管的电压 （V） 和增益以及信号的面积-高度-宽度 （AHW）。
      注意:根据所使用的实验和仪器选择以下检测器设置: FSC-AHW:AHW，V:270，G:5; SSC-AHW: A， V: 350， G: 10; FL1 （CD8/FITC 葡聚糖）-AHW: a， v: 400， G: 1; FL2 （CD25/PE）-AHW: A， V: 500， G: 1; FL6 （CD4/Alexa Fluor 647）-AHW: A， V: 700， G: 1; FL7 （Ki-67/Alexa Fluor 700）-AHW: A， V: 625， G: 1; FL9 （长/深）-AHW: A， V: 425， G: 1.
   6. 从位于标题栏下方的仪器采集控制面板中，调整要检测的流速（中）、时间（5 分钟）和事件（参见步骤 5.2.8）选项。单击"采集单个"选项，允许仪器绘制/运行样品并显示检测到的事件的实时预览。
   7. 从实时预览中，调整 荧光阈值 （电压 和 增益）和细胞大小，以最终在所需细胞群周围绘制门，同时排除任何 细胞 碎片。
      注意:FSC有助于根据大小区分细胞，从而允许用户区分免疫系统的细胞，例如单核细胞和淋巴细胞;与淋巴细胞相比，单核细胞更大，FSC强度更高。
   8. 总共获取大约 5，000 个活 MoDC、50，000 个活淋巴细胞和 50，000 个活单核细胞事件。
   9. 参考阴性对照样品调整所有参数后，单击 "停止"，然后保存方案。
   10. 现在将所有样品装载到多管装载器上。定义工作清单上的每个样品，并将参考阴性对照调整的参数应用于实验中的所有样品。单击" 获取" 选项以允许连续运行实验中的所有样品。
   11. 从所有样品中获取数据后，使用适当的数据分析软件保存并转换为可读数据，该软件允许生成顺序双参数和单参数直方图。

6. 信使核糖核酸（mRNA）表达分析

1. 核糖核酸提取
   注意:从抗原脉冲 MoDC 淋巴细胞共培养物（特异性）、非抗原脉冲 MoDC 淋巴细胞共培养物（非特异性）、不含 MoDC 的淋巴细胞培养物（对照）和幼稚淋巴细胞（共培养前分离的 CD14⁻ 细胞）中提取总 RNA。对于RNA提取，使用不含RNA酶的水制备乙醇。有关提取试剂盒和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。
   1. 使用移液管将 1 mL 细胞悬液从 MoDC-淋巴细胞共培养板（~1 × 10⁶ 个细胞/mL）转移到无菌的 1.5 mL 无菌管中，并以 500 × g 离心 10 分钟。
   2. 保存酶联免疫吸附形式的上清液。将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并将其转移到 15 mL 管中。使用 1 mL PBS 收集任何残留细胞。
   3. 以500 ×g离心10分钟。
      注意:所有样品应作为活细胞精心处理，直到使用试剂盒中提供的裂解缓冲液进行细胞裂解。细胞死亡释放的RNA酶可快速水解下游定量所需的RNA模板。RLT缓冲液在抑制RNA酶的溶液中裂解细胞。
   4. 向每个空孔中加入 350 μL 裂解缓冲液，孵育 2-3 分钟以裂解在前面步骤中未收获的贴壁细胞。
   5. 步骤6.1.3中的离心完成后，弃去上清液，并将细胞沉淀与步骤6.1.4中加入的350μL裂解缓冲液合并。
      注意:此时，可以将试管储存在-80°C或继续进行RNA提取（以下步骤）。
   6. 在步骤6.1.5中将350μL的70%乙醇移液到裂解物中。每个样品的最终体积为 700 μL。
   7. 将提取柱插入 2 mL 收集管（随试剂盒提供）中。
   8. 每根萃取柱转移 700 μL 样品，并以 10，000 × g 离心 15 秒。丢弃收集管中的流出物，然后将其放回离心柱中。
   9. 在提取柱中，加入 350 μL 严格的洗涤缓冲液（试剂盒中提供），并以超过 10，000 × g 离心 15 秒。丢弃流出物。
   10. 将每个样品的80μLDNase I孵育混合物添加到提取柱的膜上，并在20-30°C下凝固15分钟。
       注意:要为每个样品制备 DNase I 孵育混合物，请将 10 μL DNase I 储备溶液添加到 70 μL DNase 缓冲液中，最终体积为 80 μL。 通过将试管倒置几次，然后在离心机中短时间旋转来彻底混合。
   11. 用 350 μL 严格的洗涤缓冲液洗涤萃取柱，然后以 10，000 × g 离心 15 分钟。离心后丢弃收集管中的流出物。
   12. 每次用 500 μL 温和洗涤缓冲液洗涤提取柱 2 倍，并以 10，000 × g 离心 15 秒，第二次离心 2 分钟。每次离心后丢弃流出物。
   13. 以最大速度离心柱1分钟以干燥膜，并丢弃收集管。
   14. 将提取柱放入新的 1.5 mL 收集管中。
   15. 将 50 μL 无 RNase 的水移液到柱膜上，并在室温下孵育 3-5 分钟。
       注意:对于低于 100 ng 的 RNA 浓度，将洗脱体积减少至 30 μL，并使用第一次洗脱中的产物重新洗脱提取柱膜以浓缩最终产物。
   16. 以 10，000 × g 离心 1 分钟以洗脱 RNA。
   17. 通过使用 0.5-2 μL 样品检测 260 nm 处的吸光度来测量 RNA 的浓度。使用不含RNA酶的水将最终RNA浓度调节至0.1-1μg/μL。
   18. 将RNA等分试样储存在-80°C以备后用。
2. 互补DNA的合成
   1. 根据试剂盒随附的制造商方案从提取的模板 RNA 中合成互补 DNA （cDNA）（有关详细信息，请参阅 材料表 ）。
      注意:所用试剂和体积的摘要如表 1 和 表2所示。 补充文件 1 中详细介绍了完整的协议。
3. 实时定量聚合酶链反应
   1. 对于qPCR，一式三份运行cDNA样品。参考 GAPDH 基因，使用特定的引物集量化 Ki-67 和 IFN-γ 的牛 mRNA 转录物水平，如 表 3 所示。
      注意: 补充文件 1 中详细介绍了完整的协议。

7. 酶联免疫吸附测定

1. 处理收集的富含分泌蛋白的培养上清液，以通过ELISA定量IFN-γ。
   注意:有关套件使用的详细信息，请参阅 材料表 。 补充文件 1 中详细介绍了完整的协议。

8. 统计分析

1. 分析数据，并使用商业软件制作实验设计的图形说明。使用未配对非参数检验进行比较分析。考虑 P 值< 0.05 具有统计显著性。

结果

该方法描述了牛MoDC的体外生成，用于在进行体内研究之前评估候选疫苗抗原。图1说明了牛MoDC生成的实验方案以及MoDC在体外测定中的应用。使用基于磁性的细胞分选技术，可以从收获的PBMC中收集约2600万个CD14 ⁺肌细胞，这些PBMC以前是从50 mL牛血中分离出来的。不含CD14⁺单核细胞的洗脱细胞组分富含淋巴细胞，可用作幼稚CD4+和CD8⁺ T?...

讨论

本研究展示了一种用于生成和分型牛 MoDC 的标准化体 外 方法，以及随后用于测量商业疫苗（例如 RV）的疫苗免疫原性。牛MoDC可用作筛选针对牛病的潜在疫苗抗原的工具，并在进行 体内 动物试验之前根据免疫反应预测其潜在的临床影响。生成的MoDC是根据其形态，表型和功能特征来鉴定的。我们发现，源自牛CD14 ⁺ 单核细胞的MoDC表现出DC中可见的特征，例如延伸的树突，用于?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK Lysing Buffer	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody	Bio-Rad	MCA2678F	Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA2430PE	Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody	Bio-Rad	MCA1653A647	Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA2431F	Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody	Bio-Rad	MCA837F	Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA2437PE	Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	-	Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA	-	Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube	Falcon Corning	352235	5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Germany	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer	Beckman Coulter	-	Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	HSP9601	96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter, Germany	-	Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column	Miltenyi Bioteck, Germany	130-042-401	Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody	Bio-Rad	MCA2228F	Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube	Sigma Aldrich	HS4325	1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point	Microsoft	-	The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA928F	Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD86 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD25 monoclonal antibody
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody	Bio-Rad	MCA929F	Isotype control for MHC class II monoclonal antibody
Nobivac Rabies	MSD Animal Health, UK	-	1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals	Bi0-Rad	TCS0803	0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software	Dotmatics	-	Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody	Biolegend, USA	350501	Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody	Biolegend	400101	Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide	BD Bio Sciences	1351101	Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D System, USA	202-IL-010/CF	Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier	-	Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24	TPP, Switzerland	92024	24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water	Sigma Aldrich	W3500-1L	Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture