Determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini

Riepilogo

La metodologia descrive la generazione di cellule dendritiche derivate da monociti bovini (MoDC) e la loro applicazione per la valutazione in vitro di candidati antigenici durante lo sviluppo di potenziali vaccini veterinari nei bovini.

Abstract

Le cellule dendritiche (DC) sono le cellule presentanti l'antigene (APC) più potenti all'interno del sistema immunitario. Pattugliano l'organismo alla ricerca di agenti patogeni e svolgono un ruolo unico all'interno del sistema immunitario collegando le risposte immunitarie innate e adattative. Queste cellule possono fagocitare e quindi presentare antigeni catturati alle cellule immunitarie effettrici, innescando una vasta gamma di risposte immunitarie. Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la generazione in vitro di cellule dendritiche derivate da monociti bovini (MoDC) isolate da cellule mononucleate del sangue periferico del bestiame (PBMC) e la loro applicazione nella valutazione dell'immunogenicità del vaccino.

La selezione cellulare su base magnetica è stata utilizzata per isolare i monociti CD14+ dalle PBMC e l'integrazione di terreno di coltura completo con interleuchina (IL)-4 e fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) è stata utilizzata per indurre la differenziazione dei monociti CD14⁺ in MoDC naïve. La generazione di MoDC immature è stata confermata rilevando l'espressione dei marcatori di superficie cellulare del complesso maggiore di istocompatibilità II (MHC II), CD86 e CD40. Un vaccino antirabbico disponibile in commercio è stato utilizzato per pulsare i MoDC immaturi, che sono stati successivamente co-coltivati con linfociti naïve.

L'analisi citometrica a flusso delle MoDC pulsate dall'antigene e della co-coltura linfocitaria ha rivelato la stimolazione della proliferazione dei linfociti T attraverso l'espressione dei marcatori Ki-67, CD25, CD4 e CD8. L'analisi dell'espressione dell'mRNA di IFN-γ e Ki-67, utilizzando la PCR quantitativa, ha mostrato che i MoDC potrebbero indurre il priming antigene-specifico dei linfociti in questo sistema di co-coltura in vitro . Inoltre, la secrezione di IFN-γ valutata utilizzando ELISA ha mostrato un titolo significativamente più alto (**p < 0,01) nella co-coltura di linfociti MoDC pulsata dal vaccino antirabbico rispetto alla co-coltura di linfociti MoDC non pulsata dall'antigene. Questi risultati mostrano la validità di questo test MoDC in vitro per misurare l'immunogenicità del vaccino, il che significa che questo test può essere utilizzato per identificare potenziali candidati vaccini per i bovini prima di procedere con studi in vivo , nonché nelle valutazioni dell'immunogenicità dei vaccini commerciali.

Introduzione

La vaccinazione veterinaria rappresenta un aspetto cruciale della zootecnia e della salute, in quanto contribuisce a migliorare la sicurezza alimentare e il benessere degli animali conferendo protezione contro le malattie che colpiscono il settore zootecnico a livello globale¹. Un metodo efficace in vitro per valutare l'immunogenicità di possibili candidati vaccini contribuirebbe ad accelerare il processo di sviluppo e produzione del vaccino. È quindi necessario ampliare il campo dei saggi immunitari con metodologie innovative basate su studi in vitro, in quanto ciò contribuirebbe a svelare la complessità dei processi immunitari legati all'immunizzazione e all'infezione da patogeni. Attualmente, gli studi di immunizzazione e di provocazione animale in vivo , che richiedono campionamenti periodici (ad esempio, sangue e milza), vengono utilizzati per misurare l'immunogenicità dei vaccini candidati e degli adiuvanti. Questi test sono costosi, richiedono tempo e hanno implicazioni etiche, perché nella maggior parte dei casi, l'eutanasia animale viene effettuata entro la fine delle prove.

In alternativa ai test in vivo, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state utilizzate per valutare le risposte immunitarie indotte dal vaccino in vitro². Le PBMC sono una popolazione eterogenea di cellule composta per il 70%-90% da linfociti, per il 10%-20% da monociti e da un numero limitato di cellule dendritiche (DC, 1%-2%)³. Le PBMC ospitano cellule presentanti l'antigene (APC) come cellule B, monociti e DC, che pattugliano costantemente l'organismo alla ricerca di segni di infezione o danno tissutale. Le chemochine secrete localmente facilitano il reclutamento e l'attivazione delle APC in questi siti legandosi ai recettori della superficie cellulare. Nel caso dei monociti, le chemochine dirigono il loro destino a differenziarsi in DC o macrofagi⁴. Non appena le DC incontrano e catturano un agente patogeno, migrano verso organi linfoidi secondari, dove possono presentare gli antigeni peptidici patogeni trasformati utilizzando proteine di superficie di classe I o di classe II del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) rispettivamente alle cellule T CD8+ o alle cellule T CD4⁺, innescando così una risposta immunitaria ^5,6.

Il ruolo chiave svolto dalle DC nell'orchestrare una risposta immunitaria protettiva contro vari agenti patogeni le rende un interessante obiettivo di ricerca per la comprensione dei meccanismi immunitari intracellulari, specialmente quando si progettano vaccini e adiuvanti contro agenti infettivi⁷. Poiché la frazione di DC che può essere ottenuta dalle PBMC è piuttosto piccola (1% -2%), i monociti sono stati invece utilizzati per generare DC in vitro⁸. Queste DC derivate da monociti (MoDC) sono state inizialmente sviluppate come possibile strategia di trattamento nell'immunoterapia del cancro⁹. Più recentemente, i MoDC sono stati utilizzati per la ricerca sui vaccini 10,11,12 e i monociti classici sono il sottotipo predominante (89%) per la produzione di MoDC ¹³. La produzione di MoDC in vitro è stata precedentemente ottenuta attraverso l'aggiunta del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) somministrato in combinazione con altre citochine come l'interleuchina-4 (IL-4), il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) o IL-13^14,15,16.

Il successo di un test MoDC in vitro si basa sulla capacità dei MoDC maturi stimolati dall'antigene di modulare l'estensione e il tipo di risposta immunitaria specifica per il tipo di antigene rilevato¹⁷. Il tipo di patogeno riconosciuto e presentato dalle MoDC determina la differenziazione delle cellule T helper (Th) CD4⁺ in cellule effettrici Th1, Th2 o Th17 ed è caratterizzato da un profilo di citochine secretorie specifiche per patogeno. Una risposta Th1 è suscitata contro i patogeni intracellulari e provoca la secrezione di interferone-gamma (IFN-γ) e fattore di necrosi tumorale beta (TNF-β), che modula la protezione fagocitico-dipendente. Una risposta Th2 viene attivata contro gli organismi parassiti ed è caratterizzata dalla secrezione di IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, che avvia la protezione umorale fagocitica-indipendente. Th17 offre protezione neutrofili-dipendente contro le infezioni batteriche e fungine extracellulari mediate dalla secrezione di IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 e TNF-α 18,19,20,21. Sulla base di studi precedenti, è stato notato che non tutti i patogeni rientrano nel profilo di citochine atteso. Ad esempio, le MoDC dermiche, in risposta all'infezione parassitaria da Leishmania, stimolano la secrezione di IFN-γ dalle cellule T CD4+ e dalle cellule T CD8⁺, inducendo così una risposta protettiva proinfiammatoria Th1²².

È stato anche dimostrato che, nei MoDC di pollo innescati con Salmonella lipopolisaccaride (LPS), possono indurre una risposta variabile contro Salmonella typhimurium attivando sia le risposte Th1 che Th2, mentre Salmonella gallinarum induce una risposta Th2 da sola, il che potrebbe spiegare la maggiore resistenza di quest'ultima verso la clearance MoDC²³. L'attivazione di MoDC contro Brucella canis (B. canis) è stata riportata anche in MoDC sia canine che umane, il che significa che questo potrebbe rappresentare un meccanismo di infezione zoonotica²⁴. I MoDC umani innescati con B. canis inducono una forte risposta Th1 che conferisce resistenza a infezioni gravi, mentre i MoDC canini inducono una risposta Th17 dominante con una risposta Th1 ridotta, portando successivamente all'instaurazione di infezione cronica²⁵. Le MoDC bovine mostrano una maggiore affinità per il virus dell'afta epizootica (FMDV) coniugato con immunoglobuline G (IgG) rispetto all'FMDV non coniugato da solo, poiché i MoDC formano un complesso di anticorpi virali in risposta ai primi¹⁰. Nel loro insieme, questi studi mostrano come le MoDC sono state utilizzate per analizzare la complessità delle risposte immunitarie durante l'infezione da patogeni. Le risposte immunitarie adattative possono essere valutate mediante la quantificazione di specifici marcatori associati alla proliferazione linfocitaria. Ki-67, una proteina intracellulare rilevata solo nelle cellule in divisione, è considerata un marker affidabile per gli studi di proliferazione²⁶, e allo stesso modo, CD25 espresso sulla superficie delle cellule T durante la fase tardiva di attivazione corrisponde alla proliferazione linfocitaria^27,28.

Questo studio dimostra un metodo standardizzato per la generazione in vitro di MoDC per bovini seguita dalla loro applicazione in un test immunitario in vitro utilizzato per testare l'immunogenicità dei vaccini. Un vaccino antirabbico disponibile in commercio (RV) è stato utilizzato per convalidare l'efficacia di questo test. L'attivazione e la proliferazione dei linfociti T sono state misurate mediante citometria a flusso, reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) attraverso l'analisi di marcatori di attivazione cellulare ben consolidati come Ki-67 e CD25 e la secrezione di IFN-γ 28,29,30,31. Durante il test MoDC non vengono eseguite prove sperimentali su animali o sull'uomo.

Protocollo

La raccolta del sangue viene eseguita da un servizio veterinario certificato in conformità con le linee guida etiche dell'Agenzia austriaca per la salute e la sicurezza alimentare (AGES) e in conformità con gli standard accettati in materia di benessere degli animali³². Lo studio ha ricevuto l'approvazione etica dal Ministero dell'Agricoltura austriaco. Il progetto sperimentale per la generazione di MoDC e la sua successiva applicazione è illustrato nella Figura 1.

1. Produzione di MoDC ingenui

NOTA: I campioni di sangue intero sono stati ottenuti da un singolo vitello privo di agenti patogeni mediante puntura della vena giugulare con vacutainers eparinizzati. Trasportare il sangue in una ghiacciaia. Conservare i campioni a 2-4 °C per un uso successivo o lavorarli immediatamente. Mantenere il sangue in rotazione per evitare la coagulazione del sangue. Sterilizzare i vacutainers con etanolo al 70%. Tutti i seguenti esperimenti sono stati eseguiti con un campione biologico e sei repliche tecniche.

1. Centrifugazione a gradiente di densità per isolare le PBMC dal sangue eparinizzato
   1. Mescolare bene il sangue invertendolo di 10x.
   2. Utilizzando una pipetta da 10 ml, trasferire 20 ml di sangue eparinizzato in una provetta sterile da 50 ml e diluirla con 10 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
   3. Pipettare 15 mL di terreno di isolamento dei linfociti fino a un tubo sterile da 50 ml.
      NOTA: Lasciare che il mezzo di isolamento dei linfociti raggiunga la temperatura ambiente prima del pipettaggio.
   4. Inclinare il tubo da 50 mL contenente il mezzo di isolamento dei linfociti in posizione 45°. Puntare la punta di una pipetta da 25 ml perpendicolarmente e posizionare con cura i 30 ml di sangue-PBS sopra il mezzo di isolamento dei linfociti, senza mescolare i due. Molto lentamente, riportare il tubo da 50 mL in posizione verticale.
   5. Centrifugare a 800 × g per 35 minuti a 20 °C con accelerazione massima e senza freno (funzione di decelerazione disattivata).
   6. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere lo strato di PBMC (il sottile strato bianco subito dopo il primo strato di plasma) e trasferirlo in una nuova provetta da 50 ml.
      NOTA: La centrifugazione a gradiente di densità separa il sangue intero in diversi strati. Di conseguenza, gli eritrociti si depositano sul fondo come un pellet, le cellule mononucleate (PBMC) si depositano nello strato di interfaccia e il plasma forma lo strato superiore. I granulociti si trovano tra il pellet e lo strato di PBMC.
   7. Lavare i PBMC raccolti 2 volte aggiungendo PBS fino a un volume di 40 ml e mescolando accuratamente pipettando su e giù. Quindi, centrifugare a 500 × g a 4 °C per 7 minuti con la massima accelerazione e la massima decelerazione.
   8. Scartare il surnatante per decantazione, risospendere il pellet in 15 ml di 1x tampone ammonio-cloruro-potassio (ACK) e incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
      NOTA: Non incubare per più di 15 min. Il tampone ACK disponibile in commercio viene utilizzato per garantire la lisi dei globuli rossi residui (RBC) presenti nella frazione PBMC.
   9. Aggiungere PBS fino a un volume di 40 ml, quindi centrifugare a 500 × g e 4 °C per 7 minuti con accelerazione e decelerazione massime.
   10. Scartare il surnatante mediante decantazione e ripetere il punto 1.1.9.
   11. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreno di coltura completo (a temperatura ambiente).
       NOTA: Il terreno di coltura completo è composto da terreno di coltura cellulare RPMI 1640 integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina.
2. Separazione magnetica delle cellule CD14^+/− dalla popolazione PBMC mediante sfere magnetiche coniugate CD14
   1. Contare le cellule con un contatore di cellule emocitometriche pulito utilizzando 10 μL di sospensione cellulare miscelata con 10 μL di soluzione di tripano blu (0,4%).
      NOTA: Il colorante blu di Trypan è una sostanza chimica tossica e potenzialmente cancerogena. Deve essere maneggiato indossando dispositivi di protezione individuale (DPI) per evitare il contatto e i rifiuti devono essere gettati in un contenitore ermetico specializzato per rifiuti tossici. Le cellule morte appariranno blu, mentre le cellule vive appariranno chiare al microscopio.
   2. Centrifugare per 7 min a 500 × g.
   3. Scartare il surnatante con una pipetta e risospendere il pellet in un tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) utilizzando un volume di 40 μL per ogni 1 × 10⁷ celle. Mescolare accuratamente con una pipetta.
      NOTA: Il tampone FACS è composto dal 2% di FBS e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) disciolti in PBS.
   4. Aggiungere 5 μL di tampone microbead CD14 per 1 × 10⁷ celle e mescolare accuratamente con una pipetta.
   5. Incubare per 30 minuti a 4-8 °C per la selezione positiva dei monociti CD14⁺ bovini³³. Vortice ogni 15 minuti durante il periodo di incubazione.
   6. Fase facoltativa (per l'analisi della citometria a flusso): aggiungere 10 μL di anticorpo colorante CD14-FITC (isotiocianato di fluoresceina) con successiva incubazione per 15 minuti a 4-8 °C. Fare riferimento all'analisi della citometria a flusso nel passaggio 5 per i dettagli.
   7. Aggiungere 1 mL di tampone FACS e centrifugare per 7 minuti a 500 × g.
   8. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone FACS per 1 × 10⁸ cellule.
   9. Inserire la colonna di separazione cellulare immunomagnetica nel separatore (portacolonna magnetica) e posizionare un tubo di raccolta da 15 mL sotto l'uscita della colonna per raccogliere il flusso passante.
   10. Lavare la colonna con 1 mL di tampone FACS degassato. Dopo il risciacquo, sostituire il tubo da 15 ml usato con uno nuovo.
   11. Lasciare passare la sospensione cellulare (dal punto 1.2.8) attraverso la colonna pipettando 1 × 10⁸ celle in 500 μL di tampone alla volta.
       NOTA: prestare attenzione a non generare bolle d'aria mentre si mescolano le celle prima di lasciarle passare attraverso la colonna.
   12. Risciacquare la colonna 3x con 3 ml di tampone FACS degassato ogni volta.
   13. Raccogliere il flusso ed etichettare questa prima frazione eluita come frazione cellulare CD14⁻ (PBMC meno monociti CD14⁺ ); Questo è anche chiamato la frazione linfocitaria naïve.
       NOTA: Le cellule CD14⁻ vengono mantenute in terreno di coltura completo fino a quando non vengono prodotte MoDC pulsate dall'antigene.
   14. Rimuovere la colonna dal separatore.
   15. Posizionare un nuovo tubo sterile da 15 ml sotto la colonna per la raccolta dell'effluente.
   16. Pipettare 5 mL di tampone FACS nella colonna e spingerlo immediatamente attraverso usando uno stantuffo.
   17. Raccogliere il flusso ed etichettare questa seconda frazione eluita come frazione cellulare CD14⁺ ; Questa è anche chiamata frazione monocitaria naïve.
   18. Aggiungere un terreno di coltura completo ai monociti CD14⁺ raccolti per ottenere 1 × 10⁶ cellule/ml.
       NOTA: Contare le cellule vive nella frazione cellulare CD14⁺ eluita per stimare il volume del terreno di coltura completo necessario per ottenere la conta cellulare desiderata.
   19. Prendere una piastra sterile a 24 pozzetti e aggiungere 1 mL della sospensione cellulare (1 × 10⁶ cellule/ml) a ciascun pozzetto.
3. Differenziazione dei monociti naïve CD14⁺ in MoDC naïve mediante l'aggiunta del 3% p/v di cocktail di citochine (GM-CSF + IL-4) con un totale di 5 giorni di incubazione
   1. Integrare ciascun pozzetto contenente monociti CD14⁺ con 40 μL (3% p/v) del cocktail di citochine fornito nel kit.
   2. Incubare la piastra in un incubatore umidificato con 5% di CO₂ e a 37 °C per 48 h.
   3. Il giorno 2, trasferire metà del contenuto di ciascun pozzetto (500 μL) utilizzando una pipetta in singoli tubi da 1,5 ml e centrifugare a 500 × g a 4 °C per 7 minuti.
   4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di terreno di coltura completo fresco.
   5. Trasferire 500 μL di questa sospensione cellulare dal punto 1.3.4 a ciascun pozzetto designato in modo che il volume finale sia di 1 ml.
   6. Arricchire ogni pozzetto con 20 μL di cocktail di citochine.
   7. Incubare la coltura per 72 ore in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ e a 37 °C.
   8. Dopo l'incubazione del giorno 5, rimuovere la piastra dall'incubatore.
      NOTA: Ogni pozzetto conterrà 1 mL di sospensione cellulare di MoDC naïve. Il numero di MoDC sarà una percentuale (~20%) dei monociti originali placcati (1 × 10⁶/ml).

2. Saggio dell'attività endocitica MoDC

NOTA: Il test di assorbimento dell'antigene o l'analisi dell'attività endocitica misura la capacità dei MoDC ingenui di internalizzare materiale estraneo. Eseguire il test utilizzando MoDC naïve coltivate con cocktail di citochine al 3% p/v e con 5 giorni di incubazione, come descritto in precedenza³⁴.

1. Raccogliere l'ingenua sospensione cellulare MoDC dalla piastra a 24 pozzetti e trasferirla in un tubo da 15 ml; raccogliere anche eventuali cellule residue risciacquando i pozzetti con PBS.
2. Centrifuga per 500 × g per 7 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno di coltura integrato con FBS all'1%.
3. Contare le cellule MoDC vive per stimare il volume di terreno necessario per ottenere la conta cellulare desiderata (2 × 10⁵ cellule / ml).
4. Coltura dei MoDC naïve in 100 μL di terreno di coltura completo in una piastra a 24 pozzetti con una concentrazione cellulare finale di 2 × 10⁵ cellule/ml.
5. Integrare ciascun pozzetto con 1 mg/mL di destrano coniugato con FITC (sonda fluorescente utilizzata come tracciante dell'endocitosi).
   NOTA: Il FITC-destrano agisce come una sonda fluorescente e viene utilizzato come tracciante per endocitosi.
6. Coprire la piastra e incubare al buio al 5% di CO₂ e 37 °C per 60 minuti.
   NOTA: Per il controllo di fondo, incubare le cellule MoDC aggiuntive (2 × 10⁵ cellule/ml) con 1 mg/ml di FITC-destrano su ghiaccio, poiché questo tipo di incubazione impedisce l'ingresso della molecola tracciante (FITC-destrano) nelle cellule.
7. Dopo l'incubazione, trasferire immediatamente la piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio per fermare l'endocitosi del FITC-destrano.
8. Lavare le celle con tampone FACS ghiacciato.
9. Raccogliere, centrifugare e risospendere il pellet in 500 μL di tampone FACS.
10. Analizzare l'intensità di fluorescenza del destrano FITC all'interno delle cellule utilizzando la citometria a flusso. Fare riferimento all'analisi della citometria a flusso nel passaggio 5.2 per i dettagli.

3. Generazione di MoDC pulsate dall'antigene

NOTA: Un vaccino disponibile in commercio e clinicamente approvato contro il virus della rabbia (RV) può indurre la differenziazione di MoDC naïve in MoDC mature presentanti l'antigene. Utilizzare lo 0,1% (~1 μL) di una singola dose di vaccinazione RV per generare MoDC pulsate dall'antigene. Inoltre, si preferisce produrre MoDC a impulsi RV nella stessa piastra di coltura utilizzata (nella fase 1.3.8) per generare MoDC naïve perché il trasferimento dei MoDC naïve su una nuova piastra a 24 pozzetti li influenzerà negativamente.

1. Dal punto 1.3.8) Aggiungere 1 μL/mL di sospensione RV a 1 mL di coltura MoDC naïve nella piastra a 24 pozzetti e incubare per 48 ore al 5% di CO₂ e 37 °C.
   NOTA: I MoDC naive coltivati senza stimolazione RV vengono utilizzati come controllo di fondo (e come stimolazione non specifica per la co-coltura con linfociti nelle fasi successive).
2. Dopo l'incubazione, il giorno 7, tenere la piastra a 24 pozzetti contenente i MoDC pulsati dall'antigene sul ghiaccio per 10 minuti.
3. Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciato per pozzetto. Mescolare accuratamente ogni pozzetto mediante pipettaggio e trasferire la sospensione in un tubo da 15 ml.
4. Lavare i pozzetti con 2 ml di PBS ghiacciato per raccogliere le cellule residue rimaste all'interno di ciascun pozzetto.
5. Trasferire il contenuto nelle rispettive provette e centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 7 minuti.
6. Scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare (MoDC pulsate dall'antigene) in un terreno di coltura completo e regolare il volume a una concentrazione cellulare finale di 1 × 10⁵ cellule / ml.
   NOTA: Contare le cellule vive per stimare il volume di terreno necessario per ottenere il conteggio delle cellule desiderato. Utilizzare MoDC pulsate RV dal giorno 7 per il sistema di co-coltura MoDC-linfociti.

4. Co-coltura MoDC-linfociti

NOTA: Il sistema di co-coltura in vitro MoDC-linfociti determina la capacità delle MoDC di innescare i linfociti antigene-specifici. I diversi gruppi di trattamento delle cellule dopo 16 giorni di co-coltura includono specifici, non specifici e di controllo. Il gruppo specifico è definito come linfociti co-coltivati con MoDC pulsate RV; il gruppo non specifico è definito come linfociti co-coltivati con MoDC non pulsate dall'antigene; e il gruppo di controllo è definito come linfociti coltivati senza MoDC.

1. Aggiungere terreno di coltura completo alla frazione linfocitaria naïve eluita (cellule CD14⁻ ) per ottenere una concentrazione cellulare di 2 × 10⁶ cellule/ml.
   NOTA: Contare le cellule vive nella coltura cellulare CD14⁻ che sono state mantenute in terreno di coltura completo in una piastra a 24 pozzetti dalla loro raccolta per stimare il volume di terreno necessario per ottenere la conta cellulare desiderata.
2. Il giorno 7, prendere una piastra sterile da 24 pozzetti e seminare i pozzetti con 1 mL di sospensione di cellule linfocitarie naïve (2 × 10⁶ celle/ml) più 1 mL di sospensione MoDC pulsata dall'antigene o non pulsata dall'antigene (1 × 10⁵ celle/ml).
   NOTA: Il volume totale in ciascun pozzetto sarà di 2 ml con un rapporto di 1:20 MoDC per linfociti per pozzetto.
3. Incubare la piastra per 48 ore a 37 °C e 5% CO₂.
4. Arricchimento e restimolazione della coltura con MoDC pulsate dall'antigene
   1. Dopo l'incubazione della co-coltura di linfociti MoDC pulsata dall'antigene, il giorno 9, integrare ciascun pozzetto con 20 ng / mL ricombinante IL-2 e continuare a incubare per altre 120 ore (5 giorni di incubazione).
   2. Il giorno 14, trasferire 1 mL di co-coltura in una provetta sterile da 1,5 mL e centrifugare a 500 × g per 7 minuti.
   3. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di MoDC pulsate dall'antigene o non pulsate (1 × 10⁵ celle/ml). Mescolare delicatamente mediante pipettaggio e trasferire le sospensioni cellulari nei pozzetti designati.
      NOTA: In questa fase, il volume totale in ciascun pozzetto è di 2 ml.
   4. Continuare con l'incubazione al 5% di CO₂ e 37 °C per 48 ore. Dopo l'incubazione il giorno 16, la co-coltura è pronta per l'analisi utilizzando citometria a flusso, qPCR ed ELISA.
      NOTA: Per ogni 2 ml in ciascun pozzetto della co-coltura di linfociti MoDC, 1 mL di cellule risospese viene colorato per la citometria a flusso, 1 mL viene utilizzato per l'estrazione dell'RNA e i surnatanti di entrambi vengono utilizzati per ELISA.

5. Analisi citometrica a flusso

NOTA: Colorare le cellule con marcatori/mAb appropriati prima di eseguire i campioni su un citometro a flusso. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli sui reagenti (controlli mAb e isotipi di colorazione), kit, strumento e software utilizzati per l'analisi della citometria a flusso.

1. Protocollo di colorazione del citometro a flusso
   NOTA: Eseguire la colorazione della superficie cellulare per le PBMC e i linfociti e i monociti naïve utilizzando mAb anti-CD14 (punto 1.2.6). Per la colorazione della superficie cellulare di MoDC naïve, utilizzare mAb anti-CD86-specifici, anti-CD40-specifici e anti-MHC II-specifici. Per la colorazione della superficie cellulare delle cellule dalle co-colture del giorno 16, utilizzare mAbs anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25; per la colorazione intracellulare, utilizzare anti-Ki-67 mAb. Inoltre, colorare le cellule con mAb di controllo isotipo negativo o senza mAb (FMO: fluorescente meno uno). La differenza principale durante la colorazione per marcatori superficiali e intracellulari è che per i marcatori di superficie cellulare, le cellule devono essere colorate con mAb superficiale specifico prima della colorazione viva / morta (L / D) o di qualsiasi altro processo. Tuttavia, la colorazione intracellulare viene eseguita dopo la colorazione L / D e richiede una fase di fissazione più permeabilizzazione per consentire la penetrazione intracellulare.
   1. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare in un tubo sterile da 1,5 mL utilizzando una pipetta e centrifugare per 10 minuti a 500 × g.
      NOTA: Dopo la centrifugazione, durante l'elaborazione delle cellule dalla co-coltura di linfociti MoDC, conservare il surnatante per l'analisi ELISA.
   2. Risospendere il pellet in 1 mL di PBS e trasferirlo in un tubo da 15 ml. Raccogliere le cellule residue utilizzando 1 mL di PBS e combinarlo con il pellet risospeso.
   3. Aggiungere 10 mL di PBS al tubo da 15 mL contenente le celle, miscelare mediante pipettaggio e centrifugare per 7 minuti a 850 x g.
   4. Scartare il surnatante e ripetere il punto 5.1.3.
   5. Scartare il surnatante e risospendere con cautela il pellet cellulare con la sospensione residua (circa 180 μL) rimasta dopo la decantazione del surnatante.
   6. Trasferire la sospensione della cella su una piastra a V da 96 pozzetti e sigillare i pozzetti per evitare fuoriuscite.
   7. Centrifugare la piastra a 1.400 × g per 5 min. Dopo la centrifugazione, scorrere la piastra su un contenitore di rifiuti per svuotare i pozzetti di liquido e picchiettare la piastra su carta assorbente per garantire la rimozione del liquido in eccesso.
   8. Aggiungere 25 μL di miscela master di colorazione superficiale per pozzetto e mescolare delicatamente con una pipetta, quindi incubare a 4 °C per 30 minuti.
      NOTA: Per preparare la miscela master di colorazione superficiale per un singolo pozzetto, aggiungere 2,5 μL di mAb superficiale a 20 μL di tampone FACS.
   9. Aggiungere 200 μL di tampone FACS per pozzetto e centrifugare a 1.400 × g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, svuotare i pozzetti del liquido decantando e picchiettare la piastra su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.
   10. Aggiungere 100 μL di soluzione colorante L/D per pozzetto. Mescolare accuratamente con una pipetta, quindi incubare a 4 °C per 15 minuti al buio.
       NOTA: Per un singolo pozzetto, sciogliere 0,25 μL di colorante L/D in 100 μL di tampone FACS. Il colorante L / D aiuta a distinguere tra cellule vive e morte.
   11. Aggiungere 100 μL di tampone FACS. Coprire i pozzetti con il coperchio e centrifugare la piastra per 1.400 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante decantando e picchiettare la piastra su carta assorbente.
   12. Ripetere il passaggio 5.1.11.
   13. Aggiungere 50 μL di soluzione di fissaggio per pozzetto (fornito con il kit) e mescolare con una pipetta prima di incubare la piastra a temperatura ambiente al buio per 10 minuti.
   14. Aggiungere 150 μL del tampone di permeabilizzazione-lavaggio (PW) 1x fornito con il kit e coprire i pozzetti con il coperchio.
       NOTA: Per preparare 10 mL di tampone 1x PW, diluire 1 mL di tampone permanente 10x in 10 mL di dH₂O.
   15. Centrifugare la piastra a 1.400 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante decantando e picchiettare la piastra su carta assorbente.
   16. Aggiungere 200 μL di 1x PW, seguito da centrifugazione a 1.400 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante decantando e picchiettare la piastra su carta assorbente.
   17. Per la colorazione intracellulare, aggiungere 25 μL di master mix di colorazione intracellulare (anti-umano Ki-67 mAb) per pozzetto. Mescolare bene e incubare la piastra per 30 minuti a 4 °C o sul ghiaccio al buio.
       NOTA: Per preparare la miscela master di colorazione intracellulare per un singolo pozzetto, aggiungere 1 μL di Ki-67 mAb a 24 μL di 1x PW. Il marcatore di colorazione intracellulare viene utilizzato solo durante l'elaborazione delle cellule dalla co-coltura del giorno 16. La colorazione intracellulare non viene eseguita durante l'elaborazione di PBMC, linfociti naïve, monociti e MoDC naïve.
   18. Dopo l'incubazione, aggiungere 200 μL di 1x PW a ciascun pozzetto. Mescolare con una pipetta e centrifugare per 1.400 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante decantando e picchiettare la piastra su carta assorbente.
   19. Aggiungere 200 μL di tampone FACS, seguito da centrifugazione a 1.400 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante decantando e picchiettarlo sulla piastra su carta assorbente.
   20. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone FACS e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in tubi citometrici a flusso sterile separati. Utilizzare 300 μL di tampone FACS per pozzetto per raccogliere le celle residue. Le cellule sono ora pronte per l'analisi citometrica a flusso.
2. Esecuzione del campione su un citometro a flusso
   NOTA: I campioni sono stati eseguiti su un citometro a flusso (utilizzando laser da 488 nm, 638 nm e 405 nm) secondo il manuale del produttore³⁵. Fare riferimento al manuale per i dettagli, la risoluzione dei problemi e la personalizzazione del protocollo.
   1. Eseguire le procedure di pulizia di routine prima e dopo aver letto i campioni.
      NOTA: Non saltare una posizione durante il caricamento dei tubi nello strumento.
      1. Per il ciclo di pulizia, utilizzare un totale di quattro provette, con la prima provetta contenente il reagente di pulizia del flusso e le restanti tre provette contenenti dH₂O; ogni tubo avrà 3 ml. Durante la pulizia, acquisisci dati con una portata media per circa 1 minuto catturando 100.000 eventi per tubo sotto i 330 V per la diffusione diretta (FSC) contro i 265 V per la dispersione laterale (SSC).
         NOTA: nessun detrito o evento cellulare deve essere segnalato durante la pulizia; In questo caso, eseguire nuovamente il passaggio di pulizia. Per eseguire i campioni, assicurarsi che tutti i campioni siano in una sospensione omogenea prima di acquisire i dati perché ciò garantisce una lettura accurata.
   2. Per collegare e accendere il citometro, fare clic sul pulsante Applicazione situato nell'angolo sinistro della barra del titolo. Dal menu a discesa dell'applicazione, selezionare l'opzione Citometria e fare clic sull'opzione Accensione.
      NOTA: dal menu a discesa dell'applicazione , l'opzione Apri consente agli utenti di sfogliare i test preprogrammati, mentre l'opzione Nuovo protocollo consente agli utenti di creare nuovi protocolli.
   3. Caricare inizialmente il campione di controllo negativo nel supporto multitubo. Selezionare Nuovo protocollo e osservare l'elenco di lavoro sul lato sinistro dell'area di lavoro/schermo.
   4. Nell'elenco di lavoro, definire la posizione del campione nel supporto multitubo e assegnare un nome al campione e al protocollo per l'identificazione.
   5. Dal pannello hardware situato sul lato sinistro dell'area di lavoro, regolare e selezionare più parametri come i rilevatori (FSC, SSC e 10 intervalli di fluorescenza), le tensioni (V ) e i guadagni dei fotomoltiplicatori e l'area-altezza-larghezza (AHW) del segnale.
      NOTA: Le seguenti impostazioni per i rivelatori sono state selezionate in base all'esperimento e allo strumento utilizzato: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (Destrano CD8/FITC)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
   6. Dal pannello di controllo per l'acquisizione dello strumento situato sotto la barra del titolo, regolare le opzioni per la portata (media), il tempo (5 min) e gli eventi (vedere il punto 5.2.8) che si desidera rilevare. Clicca sull'opzione Acquisisci singolo per permettere allo strumento di disegnare/eseguire il campione e mostrare l'anteprima in tempo reale degli eventi rilevati.
   7. Dall'anteprima in tempo reale, regolare la soglia di fluorescenza (tensione e guadagno) e la dimensione della cella per disegnare eventualmente porte intorno alla popolazione cellulare desiderata escludendo eventuali detriti cellulari.
      NOTA: FSC aiuta a distinguere le cellule in base alle dimensioni, consentendo così agli utenti di distinguere tra le cellule del sistema immunitario, come monociti e linfociti; i monociti sono più grandi e mostrano una maggiore intensità FSC rispetto ai linfociti.
   8. Acquisire circa un totale di 5.000 eventi di MoDC vivi, 50.000 di linfociti vivi e 50.000 eventi di monociti vivi.
   9. Una volta regolati tutti i parametri in riferimento al campione di controllo negativo, fare clic su Stop e salvare il protocollo.
   10. Ora carica tutti i campioni sul caricatore multitubo. Definire ogni campione nell'elenco di lavoro e applicare i parametri regolati in riferimento al controllo negativo a tutti i campioni all'interno dell'esperimento. Fare clic sull'opzione Acquisisci per consentire l'esecuzione consecutiva di tutti gli esempi dell'esperimento.
   11. Una volta acquisiti i dati di tutti i campioni, salvarli e trasformarli in dati leggibili utilizzando un apposito software di analisi dei dati che consente la generazione di istogrammi sequenziali biparametrici e monoparametrici.

6. Analisi dell'espressione dell'RNA messaggero (mRNA)

1. Estrazione dell'RNA
   NOTA: Estrarre l'RNA totale dalla co-coltura di linfociti MoDC-pulsata dall'antigene (specifica), dalla co-coltura di linfociti MoDC non pulsata dall'antigene (non specifica), dalla coltura linfocitaria senza MoDC (controllo) e dai linfociti naïve (cellule CD14⁻ isolate prima della co-coltura). Per l'estrazione dell'RNA, preparare l'etanolo utilizzando acqua priva di RNasi. Fare riferimento alla tabella dei materiali per i dettagli sul kit di estrazione e sui reagenti.
   1. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare dalla piastra di cocoltura linfocitaria MoDC (~1 × 10⁶ cellule/ml) in una provetta sterile sterile da 1,5 mL utilizzando una pipetta e centrifugare per 10 minuti a 500 × g.
   2. Salvare il surnatante per ELISA. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS e trasferirlo in un tubo da 15 ml. Raccogliere eventuali cellule residue utilizzando 1 mL di PBS.
   3. Centrifugare per 10 min a 500 × g.
      NOTA: Tutti i campioni devono essere trattati delicatamente come cellule viventi fino a quando non viene eseguita la lisi cellulare utilizzando il tampone di lisi fornito nel kit. La morte cellulare rilascia RNasi che idrolizzano rapidamente i modelli di RNA necessari per la quantificazione a valle. Il tampone RLT lisa le cellule in una soluzione che inibisce le RNasi.
   4. Aggiungere 350 μL di tampone di lisi a ciascun pozzetto vuoto e incubare per 2-3 minuti per lisare le cellule aderenti che non sono state raccolte nelle fasi precedenti.
   5. Una volta completata la centrifugazione nella fase 6.1.3, eliminare il surnatante e combinare il pellet cellulare con i 350 μL di tampone di lisi aggiunti al punto 6.1.4.
      NOTA: A questo punto è possibile conservare le provette a -80 °C o procedere con l'estrazione dell'RNA (fasi successive).
   6. Pipettare 350 μL di etanolo al 70% al lisato al punto 6.1.5. Il volume finale per campione è di 700 μL.
   7. Inserire la colonna di estrazione all'interno di una provetta di raccolta da 2 mL (fornita con il kit).
   8. Trasferire i 700 μL di campione per colonna di estrazione e centrifugare a 10.000 × g per 15 s. Scartare il flusso nel tubo di raccolta e reinserirlo nella colonna di rotazione.
   9. Nella colonna di aspirazione, aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio rigoroso (fornito nel kit) e centrifugare a più di 10.000 × g per 15 s. Eliminare il flusso continuo.
   10. Aggiungere 80 μL di miscela di incubazione DNasi I per campione sulla membrana della colonna di estrazione e lasciarla impostare per 15 minuti a 20-30 °C.
       NOTA: Per preparare la miscela di incubazione DNasi I per campione, aggiungere 10 μL di soluzione madre di DNasi I a 70 μL di tampone DNasi per un volume finale di 80 μL. Mescolare accuratamente capovolgendo il tubo più volte, seguito da un breve giro nella centrifuga.
   11. Lavare la colonna di estrazione con 350 μL di tampone di lavaggio rigoroso, seguito da centrifugazione a 10.000 × g per 15 minuti. Scartare il flusso nel tubo di raccolta dopo la centrifugazione.
   12. Lavare la colonna di estrazione 2x con 500 μL di tampone di lavaggio delicato ogni volta e con centrifugazione a 10.000 × g per 15 s e una seconda volta per 2 min. Scartare il flusso dopo ogni centrifugazione.
   13. Centrifugare la colonna alla massima velocità per 1 minuto per asciugare la membrana e gettare il tubo di raccolta.
   14. Posizionare la colonna di estrazione in una nuova provetta di raccolta da 1,5 ml.
   15. Pipettare 50 μL di acqua priva di RNasi sulla membrana della colonna e incubare per 3-5 minuti a temperatura ambiente.
       NOTA: Per concentrazioni di RNA inferiori a 100 ng, ridurre il volume di eluizione a 30 μL e rieluire la membrana della colonna di estrazione utilizzando il prodotto della prima eluizione per concentrare il prodotto finale.
   16. Centrifugare a 10.000 × g per 1 minuto per eluire l'RNA.
   17. Misurare la concentrazione di RNA rilevando l'assorbanza a 260 nm utilizzando 0,5-2 μL di campione. Regolare la concentrazione finale di RNA a 0,1-1 μg/μL utilizzando acqua priva di RNasi.
   18. Conservare le aliquote di RNA a -80 °C per un uso successivo.
2. Sintesi di DNA complementare
   1. Sintetizzare DNA complementare (cDNA) dall'RNA modello estratto secondo il protocollo del produttore fornito con il kit (fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli).
      NOTA: Un riassunto dei reagenti e dei volumi utilizzati è riportato nelle tabelle 1 e 2. Un protocollo completo è dettagliato nel file supplementare 1.
3. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale
   1. Per la qPCR, eseguire i campioni di cDNA in triplice copia. Quantificare i livelli di trascrizione dell'mRNA bovino per Ki-67 e IFN-γ utilizzando specifici set di primer in riferimento al gene GAPDH , come mostrato nella Tabella 3.
      NOTA: un protocollo completo è descritto in dettaglio nel file supplementare 1.

7. Saggio immunoassorbente enzimatico

1. Processare i supernatanti di coltura raccolti ricchi di proteine secretorie per la quantificazione dell'IFN-γ tramite ELISA.
   NOTA: Fare riferimento alla tabella dei materiali per i dettagli sull'uso del kit. Un protocollo completo è dettagliato nel file supplementare 1.

8. Analisi statistica

1. Analizzare i dati e realizzare illustrazioni grafiche di progettazione sperimentale utilizzando software commerciali. Utilizzare un test non parametrico non accoppiato per l'analisi comparativa. Si considerino valori P < 0,05 come statisticamente significativi.

Risultati

Questa metodologia descrive la generazione in vitro di MoDC bovini per la valutazione degli antigeni vaccinali candidati prima di eseguire studi in vivo. La figura 1 illustra lo schema sperimentale della generazione di MoDC bovini e l'applicazione dei MoDC per il saggio in vitro. Utilizzando la tecnica di selezione cellulare basata sul magnetismo, è stato possibile raccogliere circa 26 milioni di miociti CD14⁺ dalle PBMC raccolte, che in precedenza eran...

Discussione

Questo studio dimostra un metodo standardizzato in vitro per generare e fenotipizzare MoDC bovine e il loro successivo utilizzo nella misurazione dell'immunogenicità del vaccino di un vaccino commerciale (ad esempio, RV). I MoDC bovini possono essere utilizzati come strumento per lo screening di potenziali antigeni vaccinali contro le malattie del bestiame e prevedere il loro potenziale impatto clinico sulla base delle risposte immunitarie prima di procedere verso studi in vivo sugli animali. I MoDC ge...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK Lysing Buffer	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody	Bio-Rad	MCA2678F	Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA2430PE	Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody	Bio-Rad	MCA1653A647	Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA2431F	Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody	Bio-Rad	MCA837F	Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA2437PE	Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	-	Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA	-	Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube	Falcon Corning	352235	5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Germany	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer	Beckman Coulter	-	Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	HSP9601	96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter, Germany	-	Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column	Miltenyi Bioteck, Germany	130-042-401	Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody	Bio-Rad	MCA2228F	Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube	Sigma Aldrich	HS4325	1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point	Microsoft	-	The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA928F	Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD86 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD25 monoclonal antibody
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody	Bio-Rad	MCA929F	Isotype control for MHC class II monoclonal antibody
Nobivac Rabies	MSD Animal Health, UK	-	1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals	Bi0-Rad	TCS0803	0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software	Dotmatics	-	Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody	Biolegend, USA	350501	Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody	Biolegend	400101	Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide	BD Bio Sciences	1351101	Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D System, USA	202-IL-010/CF	Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier	-	Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24	TPP, Switzerland	92024	24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water	Sigma Aldrich	W3500-1L	Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture