توليد المتصورة المعدلة وراثيا بيرغي سبوروزويتات

Summary

تنتقل الملاريا عن طريق تلقيح مرحلة sporozoite من البلازموديوم بواسطة البعوض المصاب. لقد سمحت لنا البلازموديوم المعدلة وراثيا بفهم بيولوجيا الملاريا بشكل أفضل وساهمت بشكل مباشر في جهود تطوير لقاح الملاريا. هنا ، نصف منهجية مبسطة لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا.

Abstract

الملاريا مرض قاتل يسببه طفيلي البلازموديوم وينتقل عن طريق لدغة أنثى بعوض الأنوفيلة . تخضع مرحلة sporozoite من Plasmodium التي يرسبها البعوض في جلد مضيفات الفقاريات لمرحلة من التطور الإلزامي في الكبد قبل بدء الملاريا السريرية. نحن نعرف القليل عن بيولوجيا تطور البلازموديوم في الكبد. يعد الوصول إلى مرحلة sporozoite والقدرة على تعديل هذه الأسبوروزويتات وراثيا من الأدوات الحاسمة لدراسة طبيعة عدوى المتصورة والاستجابة المناعية الناتجة في الكبد. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا. نقوم بتعديل مرحلة الدم وراثيا P. berghei ونستخدم هذا النموذج لإصابة بعوض الأنوفيليس عندما يتناولون وجبة دم. بعد أن تخضع الطفيليات المعدلة وراثيا للتطور في البعوض ، نقوم بعزل مرحلة sporozoite من الطفيلي من الغدد اللعابية للبعوض لإجراء تجارب في الجسم الحي وفي المختبر . لقد أثبتنا صحة البروتوكول من خلال توليد sporozoites من سلالة جديدة من P. berghei تعبر عن الوحدة الفرعية 11 من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (GFP₁₁) ، ونوضح كيف يمكن استخدامها للتحقيق في بيولوجيا الملاريا في مرحلة الكبد.

Introduction

وعلى الرغم من التقدم المحرز في تطوير الأدوية والبحوث في مجال الوقاية من الملاريا وعلاجها، لا يزال عبء الملاريا العالمي مرتفعا. يموت أكثر من نصف مليون شخص بسبب الملاريا كل عام، مع أعلى مستويات الوفيات بين الأطفال الذين يعيشون في المناطق الموبوءة بالملاريا، مثل أفريقيا جنوب الصحراء^{الكبرى 1}. تحدث الملاريا بسبب طفيلي البلازموديوم ، الذي ينتقل إلى البشر من خلال لدغة أنثى بعوض الأنوفيليس التي تحمل الطفيلي في الغدد اللعابية. تترسب المرحلة المعدية من المتصورة - sporozoites - في جلد مضيفات الفقاريات أثناء تناول وجبة الدم وتنتقل عبر مجرى الدم لإصابة خلايا الكبد ، حيث تخضع لتطور إلزامي (تشكل الملاريا قبل كرات الدم الحمراء) قبل إصابة كريات الدم الحمراء. تبدأ عدوى كريات الدم الحمراء مرحلة الدم من الملاريا وهي مسؤولة عن مجمل المراضة والوفيات المرتبطة بالمرض ^2,3.

جعلت الطبيعة الإلزامية لتطور البلازموديوم قبل كريات الدم الحمراء هدفا جذابا لجهود تطوير اللقاح والأدوية^{الوقائية 4}. شرط أساسي لدراسة بيولوجيا الملاريا قبل كريات الدم الحمراء ، وكذلك تطوير اللقاحات أو الأدوية التي تستهدف مرحلة الكبد ، هو الوصول إلى Plasmodium sporozoites. علاوة على ذلك ، كانت قدرتنا على توليد Plasmodium sporozoites المعدلة وراثيا مفيدة في نجاح هذه المساعي البحثية⁵،^6،7،^8،9. سمحت لنا خطوط البلازموديوم المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات مراسل الفلورسنت أو الإنارة بتتبع تطورها في الجسم الحي وفي المختبر^10,11. الطفيليات الموهنة وراثيا (GAPs) ، الناتجة عن حذف جينات متعددة في البلازموديوم ، هي أيضا بعض من أكثر اللقاحات الواعدة^{المرشحة 12,13}.

ساعدتنا نماذج ملاريا الرئيسيات القوارض وغير البشرية على فهم آليات التفاعلات بين الطفيليات المضيفة في الملاريا البشرية بسبب أوجه التشابه في علم الأحياء ودورة الحياة بين أنواع المتصورة ¹⁴. يسمح استخدام أنواع البلازموديوم التي تصيب القوارض ، ولكن ليس البشر (على سبيل المثال ، P. berghei) بالحفاظ على دورة حياة الطفيليات الكاملة وتوليد sporozoites المعدية لدراسة الملاريا في مرحلة الكبد في بيئة خاضعة للرقابة من مستوى السلامة البيولوجية 1. توجد بالفعل مجموعة متنوعة من البروتوكولات المنفصلة لتوليد طفيليات البلازموديوم في مرحلة الدم المعدلة وراثيا 15 ، وعدوى البعوض¹⁶ ، وعزل sporozoites¹⁷. هنا ، نحدد بروتوكولا شاملا يجمع بين هذه المنهجيات من أجل توليد وعزل P. berghei sporozoites المعدلة وراثيا ، باستخدام السلالة المعدلة وراثيا الجديدة PbGFP₁₁ كمثال. يتاجر PbGFP 11 بالشريط الحادي عشر β من بروتين الفلورسنت الأخضر فائق المجلد (GFP) ، GFP₁₁ ، في الفجوة الطفيلية (PV) المتولدة في خلايا الكبد المضيفة. يستخدم PbGFP 11 جنبا إلى جنب مع خلايا الكبد المعدلة وراثيا (خلفية Hepa1-6) التي تعبر عن المخلفات التي تشكل جزء GFP 1-10 (GFP 1-10) في السيتوبلازم (خلايا Hepa GFP _1-10). يبلغ PbGFP₁₁ عن تحلل PV في خلايا الكبد المضيفة من خلال التكامل الذاتي وإصلاح GFP الوظيفي وإشارة التألق الخضراء¹⁸. وتجدر الإشارة إلى أن GFP 11 مشفر كسلسلة من سبعة تسلسلات ترادفية في PbGFP₁₁ لتعزيز إشارة التألق الناتجة. عند تلطيخ PbGFP₁₁ sporozoites مع صبغة السيتوبلازم CellTrace Violet (CTV) ، يمكننا تتبع الطفيليات. يؤدي تحلل هذه الطفيليات داخل الخلايا الملطخة ب CTV نفسها إلى تسرب CTV إلى سيتوبلازم الخلية المضيفة وتلطيخ الخلية المضيفة. بالإضافة إلى تصور وتمييز تحلل Plasmodium PV و / أو الطفيلي في خلايا الكبد المضيفة ، يمكن استخدام هذا النظام بشكل موثوق لدراسة المسارات المناعية المسؤولة عن أي من هذه العمليات ، من خلال الاضطراب الجيني أو العلاجي للمكونات الجزيئية لهذه المسارات.

Protocol

تم إجراء جميع الأبحاث التي شملت الحيوانات الفقارية في مختبرنا وفقا لإرشادات وبروتوكولات استخدام الحيوانات بجامعة جورجيا.

1. جيل من الفئران المصابة ب P. berghei

1. بدء عدوى مرحلة الدم في ذكور أو إناث ، الفئران C57BL / 6 (B6) البالغة من العمر 6-8 أسابيع باستخدام طفيليات P. berghei من النوع البري. للقيام بذلك ، قم بنقل الدم المصاب ب P. berghei المحفوظ بالتبريد (2 × 10⁵ كرات الدم الحمراء المصابة) ، المعاد تشكيله في 400 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، إلى واحد أو اثنين من الفئران المانحة داخل الصفاق (i.p.).
2. نقل الدم الطازج الذي تم جمعه من خلال النزيف الحجاجي الخلفي من الفئران المانحة في 5 أيام بعد الإصابة (d.p.i.) إلى فأرين ساذجين من B6. للقيام بذلك ، اجمع 200 ميكرولتر من الدم ، وأعد تكوينه باستخدام 300 ميكرولتر من PBS ، وحقن 200 ميكرولتر i.p. في الفئران المتلقية. تأكد من أن الطفيليات في المتبرعين في هذه المرحلة الزمنية هي 2٪ -5٪ ^19،20.
3. مراقبة الطفيليات كما هو موضح سابقا¹⁹،^{20 ،} بدءا من 2 d.p.i. في المتلقين. عندما يتراوح الطفيلي من 3٪ -5٪ (حوالي 5 d.p.i.) ، القتل الرحيم للفئران المتلقية ثم جمع الدم من خلال ثقب القلب أو النزيف خلف الحجاج. القتل الرحيم للفئران باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم ، أو وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
   ملاحظة: بمجرد أن يتجاوز الطفيلي 5٪ ، قد تنخفض كفاءة النقل بسبب زيادة انتشار كرات الدم الحمراء المصابة بالضرب.

2. جيل الفصام في الثقافة

1. اجمع الدم من الفئران المصابة في الخطوة 1.3 (حوالي 2 مل في المجموع من فأرين) إلى 5 مل من محلول Alsever (انظر جدول المواد) في بيئة معقمة. قم بتنفيذ الخطوات من 2.1 إلى 3.12 في ظل ظروف معقمة.
   ملاحظة: تشمل الظروف المعقمة ارتداء القفازات ، ومسح القفازات والأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واستخدام المواد الاستهلاكية والمواد المعقمة ، والعمل داخل خزانة السلامة البيولوجية.
2. جهاز طرد مركزي الدم لمدة 8 دقائق عند 450 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT). تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسائط RPMI الكاملة (RPMI 1640 مع 20٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين ، v / v).
3. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 450 × جم في RT. أعد تعليق الحبيبات في 25 مل من وسائط RPMI الكاملة وانقلها إلى دورق ثقافة T75 بغطاء مرشح.
4. ضعه في حاضنة عند 36.5 درجة مئوية و 5٪ CO₂ ، مع رجه برفق لإبقاء الخلايا معلقة لمدة 16 ساعة.
5. عند النقطة الزمنية 16 ساعة ، تحقق من تطور schizont. للقيام بذلك ، اجمع 500 ميكرولتر من العينة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 8 دقائق ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة ، وقم بإعداد مسحة دم رقيقة. تلطيخ لطاخة الدم مع صبغة Giemsa¹⁹ (انظر جدول المواد) وتحديد وتيرة الفصام (الشكل 1).
6. لتحقيق الكفاءة المثلى للتنقل ، يجب أن يكون 60٪ -70٪ من الطفيليات في مرحلة الفصام. إذا تم تحديد أقل من هذا الحد ، فاستمر في الزراعة كما في الخطوة 2.4 وتحقق كل ساعة للتأكد من تجاوز العتبة المذكورة أعلاه قبل المتابعة.

3. نقل شيزونتس البلازموديوم

1. قم بإعداد مخزن مؤقت للطرد المركزي متدرج عن طريق إعادة تكوين 13 مل من وسط مخزون تدرج الكثافة (انظر جدول المواد) مع 1.44 مل من 1.5 M NaCl و 5.6 مل من 0.15 M NaCl في أنبوب طرد مركزي 50 mL.
2. نقل 25 مل من مزرعة الدم إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل. ضع بعناية 20 مل من المخزن المؤقت للطرد المركزي المتدرج في قاع أنبوب الطرد المركزي باستخدام ماصة زجاجية ضيقة لإنشاء عمود متدرج. احرص على عدم إزعاج طبقات السائل والواجهات وتأكد من وجود فصل واضح بين المخزن المؤقت والوسائط.
3. جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 450 × جم بدون فرامل في RT. باستخدام ماصة باستور ، قم بإزالة طبقة schizont¹⁵ الموجودة في واجهة وسائط الثقافة ومخزن الطرد المركزي المتدرج بعناية ، وضعها في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.
4. أعد تعليق schizonts المعزولة في وسائط RPMI كاملة وارفع الحجم الإجمالي إلى 40 مل. أجهزة الطرد المركزي في 450 × ز لمدة 8 دقائق في RT والتخلص من المادة الطافية.
5. أعد تعليق schizonts في 10 مل من وسائط RPMI الكاملة. بعد ذلك ، قم بنقل 1 مل من هذا المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لكل عملية نقل ، وأجهزة طرد مركزي عند 16000 × جم لمدة 5 ثوان لتكوير كرات الدم الحمراء المصابة. يمكن استخدام كرات الدم الحمراء المصابة المشتقة من فأرين بالطريقة المذكورة أعلاه لما يصل إلى 10 عمليات نقل منفصلة.
6. اجمع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي (محلول nucleofector من مجموعة التثقيب الكهربائي ؛ انظر جدول المواد) في RT مع 5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد المستهدف الدائري أو الخطي (بحد أقصى 10 ميكرولتر) ، حسب الاقتضاء لكل نقل في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة 1.5 مل. يجب تضمين عينة "بدون بلازميد" كعنصر تحكم في الانتقال واختيار المضادات الحيوية.
7. قم بإزالة المادة الطافية بعد الطرد المركزي من الخطوة 3.5 وأعد تعليق كرات الدم الحمراء المصابة بعناية في محلول nucleofector المحضر + الحمض النووي البلازميد (من الخطوة 3.6).
8. انقل المعلق (محلول nucleofector + بلازميد + شيزونت ؛ 110 ميكرولتر كحد أقصى) إلى كوفيت التثقيب الكهربائي. Transfect باستخدام برنامج nucleofector مناسب (U-033 ، انظر جدول المواد).
   ملاحظة: تأكد من تنفيذ الخطوات من 3.8 إلى 3.10 في RT.
9. أضف 100 ميكرولتر من وسائط RPMI الكاملة إلى كوفيت وانقل المحلول بالكامل (الآن الحجم الإجمالي 200 ميكرولتر) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واحتفظ به في RT.
10. حقن محلول 200 ميكرولتر من الطفيليات المنقولة في الفئران عن طريق الوريد (IV) ، والعمل على تقليل الوقت بين النقل والحقن النهائي في الفئران.
    ملاحظة: يتم حقن الفصاميات المنقولة في الفئران بعد أقل من 5 دقائق من التثقيب الكهربائي لزيادة كفاءة البروتوكول إلى أقصى حد.

4. اختيار الطفيليات المنقولة

1. تحقق من مستويات الطفيليات في الفئران الملقحة بالفصام المنقولة يوميا من 2 d.p.i. للتحقق من العدوى.
2. بمجرد التحقق من العدوى ، ابدأ في اختيار الدواء باستخدام تناول الدواء عن طريق الفم في مياه الشرب ، المقدمة حسب الطلب.
   ملاحظة: تم استخدام بيريميثامين كعلامة دواء قابلة للاختيار للبلازميد. في هذه الحالة ، تمت إضافة 17.5 ملغ من البيريميثامين إلى 250 مل من الماء النظيف (التركيز النهائي 70 ملغ / لتر). بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة 10 غرام من السكر إلى هذا الماء لتشجيع الاستهلاك الكافي للمياه المحتوية على البيريميثامين من قبل الفئران.
3. مراقبة الطفيليات كل يومين باستخدام مسحات الدم المصنوعة من 5 ميكرولتر من الدم ، بدءا من 6 أيام بعد بدء علاج البيريميثامين. يشير عدم وجود طفيليات يمكن اكتشافها بعد 15 يوما إلى فشل عملية النقل. في هذه الحالة، أعد بدء العملية من الخطوة 1.1 لمحاولة جديدة.
4. عندما يصل الطفيلي إلى 1٪ على الأقل ، قم بنقل الطفيليات إلى فئران B6 الساذجة لإنشاء مخزون طفيلي في مرحلة الدم. استمر في الانتقاء في الفئران المصابة حديثا حتى يصل الطفيلي إلى 2٪ -5٪ ، وعند هذه النقطة يولد مخزونا ويحفظها بالتبريد²¹.

5. إصابة البعوض بالخطوط المعدلة وراثيا

1. تصيب الفئران B6 ب 200 ميكرولتر من الدم تحتوي على الطفيليات المختارة (2 × 10⁵ كرات الدم الحمراء / الفئران المصابة ، أي IV.). تحديد الطفيليات في هذه الفئران في يوم تغذية البعوض والعدوى. الطفيليات بين 2 ٪ -5 ٪ هو الأمثل لعدوى البعوض. بمجرد التحقق ، قم بنقل العدوى على الفور إلى أنثى البعوض Anopheles stephensi وفقا للخطوات 5.2-5.4).
   ملاحظة: يجب الحفاظ على الحاضنات التي تحتوي على البعوض للعدوى عند 20.5 درجة مئوية ، عند رطوبة 80٪ ، وفي دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة (تضيء الأضواء بين الساعة 07:00 صباحا و 07:00 مساء).
2. في اليوم السابق لإصابة البعوض ، افصل أنثى البعوض عن طريق وضع مصدر حرارة فوق القفص يحتوي على كل من البعوض الذكور والإناث ، مثل المثانة البلاستيكية الرقيقة أو القفاز المملوء بالماء الساخن إلى 37 درجة مئوية. قم بإزالة البعوض الأنثوي ، الذي ينجذب إلى مصدر الحرارة ، باستخدام شفاط الحشرات ونقله إلى قفص منفصل أصغر للعدوى.
   ملاحظة: يمكن تمييز ذكور البعوض عن إناث البعوض من خلال انخفاض حجم جسمها قليلا وهوائيات البرقوق.
3. حقن الفئران المصابة بمخدر عام (على سبيل المثال ، 2٪ ثلاثي برومو إيثانول / أفيرتين). تأكد من التخدير الكامل عن طريق الضغط بقوة على وسادة القدم لكل ماوس. إذا لم تتفاعل ، فهي مخدرة بما فيه الكفاية وجاهزة لنقل العدوى إلى البعوض.
4. ضع الفئران المخدرة فوق أنثى البعوض المحبوسة (من الخطوة 5.2) تحت راقد القص. انشر الأرجل الأمامية والخلفية يدويا لتوفير أكبر مساحة سطح لتغذية البعوض. اترك الفئران المصابة فوق كل قفص لمدة 15 دقيقة ، وتحقق كل 5 دقائق للتأكد من أن الفئران ليست مستيقظة. بمجرد اكتمال التغذية ، قم بالقتل الرحيم للفئران باستخدام خلع عنق الرحم ، أو وفقا لبروتوكول استخدام الحيوانات المؤسسي ، وتخلص منها بأمان.

6. مجموعة من sporozoites

1. افحص الأمعاء الوسطى للبعوض بحثا عن البويضات عند حوالي 10 d.p.i. للتحقق من نجاح العدوى وتطور البلازموديوم داخل البعوض. عزل البعوض midguts من البطن عن طريق إزالة الجزء البطني النهائي باستخدام ملقط. تصور الأمعاء الوسطى تحت الضوء المستقطب لوجود البويضات²².
2. من المتوقع أن تكون sporozoites من النوع البري موجودة في الغدد اللعابية للبعوض بعد 18-21 يوما من التغذية على الفئران المصابة. في اليوم 18 ، تشريح 5-10 البعوض لتقييم أعداد sporozoite.
   ملاحظة: يتم غسل البعوض وقتله في الإيثانول. بعد ذلك ، يتم غسل البعوض الميت مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة الحطام قبل التشريح.
3. لعزل وعدد sporozoites ، قم بإزالة رأس البعوض بعناية أثناء الضغط على صدر البعوض باستخدام ملقط أو إبرة تشريح دقيقة. تظل الغدد اللعابية متصلة بالرأس الذي تمت إزالته (الشكل 2).
4. قم بإزالة أي حطام إضافي للبعوض من الغدد اللعابية وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 400 ميكرولتر من وسائط تشريح البعوض (وسط Ealge المعدل من Dulbecco [DMEM] مع مصل فأر 1٪ ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ؛ انظر جدول المواد).
5. تعطيل الغدد اللعابية المعزولة عن طريق المرور عبر حقنة إبرة 30 غرام 15-20 مرة. ضع 10 ميكرولتر من الغدد اللعابية المعطلة في وسائط تشريح البعوض في مقياس الدم والعد. إعادة التعليق في التركيز المطلوب لوسائط تشريح البعوض أو PBS للحقن في الفئران ، أو التلقيح في مزارع الخلايا ، أو الحفظ بالتبريد على المدى^{الطويل 23,24}.

النتائج

يعد تحديد تواتر وتطور الفصام أمرا بالغ الأهمية لضمان وجود ما يكفي من الطفيليات القابلة للحياة في المرحلة المثلى للنقل. يمكن تمييز الفصاميات غير الناضجة عن الفصاميات الناضجة تماما من خلال وجود عدد أقل من الميروزويتات التي لا تملأ المساحة داخل الخلايا بالكامل لكرات الدم الحمراء (

Discussion

لقد استخدمنا البروتوكول أعلاه في مختبرنا لإنشاء عدة خطوط من طفيليات P. berghei المعدلة وراثيا. على الرغم من أنه تم تحسينه ل P. berghei ، فقد استخدمنا هذا البروتوكول بنجاح لتوليد P. yoelii sporozoites المعدلة وراثيا. بعد حقن الفصاميات المنقولة في الفئران ، يمكن اكتشاف الطفيليات عادة في موعد لا ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3