遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成

要約

マラリアは、感染した蚊による マラリア原虫 のスポロゾイト段階の接種によって伝染します。トランスジェニックマラリア原虫は、マラリアの生物学をよりよく理解することを可能にし、 マラリア ワクチン開発の取り組みに直接貢献しています。ここでは、トランスジェニック マラリア原虫 のスポロゾイトを生成するための合理化された方法論について説明します。

要約

マラリアは寄生虫マラリア原虫によって引き起こされる致命的な病気で、メスのハマダラカに刺されることで感染します。脊椎動物の宿主の皮膚に蚊によって沈着したマラリア原虫のスポロゾイト段階は、臨床的マラリアを開始する前に肝臓で強制的な発達段階を経ます。肝臓でのマラリア原虫の発生の生物学についてはほとんどわかっていません。スポロゾイト段階へのアクセスと、そのようなスポロゾイトを遺伝子組み換えする能力は、マラリア原虫感染の性質とその結果生じる肝臓の免疫応答を研究するための重要なツールです。ここでは、トランスジェニックPlasmodium berghei sporozoitesを生成するための包括的なプロトコルを紹介します。私たちは、血液期のP. bergheiを遺伝子改変し、この形態を利用して、ハマダラカが血食を摂取すると感染します。トランスジェニック寄生虫が蚊の中で発生した後、蚊の唾液腺から寄生虫のスポロゾイト段階を単離し、in vivoおよびin vitro実験を行います。我々は、緑色蛍光タンパク質(GFP)サブユニット11(GFP₁₁)を発現するP. bergheiの新規株のスポロゾイトを生成することにより、プロトコルの妥当性を実証し、肝臓期マラリアの生物学を調査するためにどのように使用できるかを示します。

概要

マラリアの予防と治療に関する医薬品開発と研究が進歩しているにもかかわらず、マラリアの世界的な疾病負担は依然として高いままです。毎年50万人以上がマラリアで死亡しており、サハラ以南^{のアフリカなどの}マラリア蔓延地域に住む子どもたちの死亡率が最も高い1。マラリアは、寄生虫マラリア原虫によって引き起こされ、唾液腺に寄生虫を宿している雌のハマダラカに刺されることで人間に感染します。マラリア原虫の感染段階であるスポロゾイトは、血食中に脊椎動物の宿主の皮膚に沈着し、血流に乗って肝細胞に感染し、赤血球に感染する前に必須の発達(赤血球性マラリア前症を構成する)を受けます。赤血球の感染はマラリアの血期を開始し、この疾患に関連する罹患率と死亡率のすべてに関与しています^2,3。

マラリア原虫の前赤血球発生の義務的な性質は、予防的ワクチンおよび医薬品^{開発の取り組みの}魅力的な標的となっています4。前赤血球性マラリアの生物学を研究し、肝臓段階を標的とするワクチンや薬を開発するための前提条件は、マラリア原虫スポロゾイトへのアクセスです。さらに、遺伝子組み換えマラリア原虫スポロゾイトを生成する私たちの能力は、そのような研究努力の成功に役立っています5,6,7,8,9。蛍光または発光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックマラリア原虫株は、in vivoおよびin vitroでその発生を追跡することを可能にしました^10,11。マラリア原虫の複数の遺伝子の欠失によって生成される遺伝的弱毒化寄生虫(GAP)も、最も有望なワクチン候補の一部です^12,13。

げっ歯類と非ヒト霊長類のマラリアモデルは、マラリア原虫種間の生物学とライフサイクルの類似性により、ヒトマラリアにおける宿主と寄生虫の相互作用のメカニズムを理解するのに役立っています¹⁴。げっ歯類には感染するがヒトには感染しないマラリア原虫種(例:P. berghei)の使用により、寄生虫のライフサイクル全体を維持し、肝臓期マラリアをバイオセーフティレベル1で研究するための感染性スポロゾイトの生成が可能になります。トランスジェニック血液段階のマラリア原虫の生成¹⁵、蚊^の感染16、およびスポロゾイト¹⁷の単離については、すでにさまざまな個別のプロトコルが存在する。ここでは、新規トランスジェニック株PbGFP₁₁を例に、トランスジェニックP.bergheiスポロゾイトを生成および分離するために、これらの方法論を組み合わせた包括的なプロトコルの概要を説明します。PbGFP 11は、スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質(GFP)の1 β 1本鎖であるGFP₁₁を、宿主肝細胞で生成された寄生胞胞(PV)に輸送します。PbGFP 11は、細胞質(Hepa GFP 1-10細胞)においてGFP 1-10フラグメント(GFP _1-10)を構成する残基を発現するトランスジェニック肝細胞(Hepa1-6バックグラウンド)と組み合わせて使用されます。 PbGFP₁₁は、機能的GFPおよび緑色蛍光シグナルの自己相補および再形成による宿主肝細胞におけるPV溶解を報告する¹⁸。注目すべきは、GFP11は、PbGFP11において一連の7つのタンデム配列としてコードされ、結果として生じる蛍光シグナルを増強することである。PbGFP₁₁ スポロゾイトを細胞質色素CellTrace Violet(CTV)で染色すると、寄生虫を追跡することができます。このようなCTV染色された細胞内寄生虫の溶解自体が、CTVの宿主細胞質への漏出と宿主細胞の染色をもたらす。このシステムは、宿主肝細胞におけるマラリア原虫PVおよび/または寄生虫の溶解を視覚化および区別することに加えて、そのような経路の分子成分の遺伝的または治療的摂動を通じて、これらのプロセスのいずれかに関与する免疫経路を研究するために確実に使用できます。

プロトコル

私たちの研究室における脊椎動物に関するすべての研究は、ジョージア大学の動物使用ガイドラインとプロトコルに準拠して実施されました。

1. P. berghei に感染したマウスの作製

1. 野生型 P. berghei 寄生虫を使用して、雄または雌の 6-8 週齢の C57BL/6 (B6) マウスで血液段階の感染を開始します。これを行うには、凍結保存された P.berghei感染血液(2 x 10⁵ 感染RBC)を、400 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再構成し、1匹または2匹のドナーマウスに腹腔内(i.p.)に移植します。
2. 感染後5日目のドナーマウス(d.p.i.)から眼窩後出血によって採取した新鮮な血液を、2匹のナイーブB6マウスに移植する。これを行うには、200 μLの血液を採取し、300 μLのPBSで再構成し、200 μLのi.p.をレシピエントマウスに注入します。この時点でのドナーの寄生虫血症が2%〜5%^{であることを確認してください19,20}。
3. 以前に説明したように寄生虫血症を監視します^19,20、レシピエントの^2d.p.i.から開始します。寄生虫血症が3%〜5%(約5 d.p.i.)の範囲の場合、レシピエントマウスを安楽死させ、心臓穿刺または眼窩後出血によって採血します。二酸化炭素を吸入した後、子宮頸部脱臼を行うか、施設のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。
   注:寄生虫血症が5%を超えると、多重感染した赤血球の有病率の増加により、トランスフェクション効率が低下する可能性があります。

2.文化におけるシゾントの生成

1. ステップ1.3で感染したマウスから血液を採取し(2匹のマウスから合計約2 mL)、無菌環境で5 mLのAlsever溶液( 材料表を参照)に入れます。ステップ2.1から3.12を無菌条件下で実行します。
   注:無菌状態には、手袋の着用、手袋と表面を70%エタノールで拭くこと、滅菌された消耗品と材料の使用、バイオセーフティキャビネット内での作業が含まれます。
2. 室温(RT)で450 x g で8分間血液を遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを10 mLの完全なRPMI培地(20%ウシ胎児血清[FBS]および1%ペニシリン-ストレプトマイシン、v/vを含むRPMI 1640)に再懸濁します。
3. 室温で450 x g で8分間遠心分離し、ペレットを25 mLの完全なRPMI培地に再懸濁し、フィルターキャップ付きのT75培養フラスコに移します。
4. 36.5°C、5%_CO2のインキュベーターに入れ、静かに振とうしながら細胞を16時間懸濁液に保ちます。
5. 16時間の時点で、統合失調症の発生を確認します。これを行うには、500 μLのサンプルを採取し、450 x g で8分間遠心分離し、ペレットを10 μLの完全なRPMI培地に再懸濁し、薄い血液塗抹標本を調製します。血液塗抹標本をギムザ染色¹⁹ ( 材料表を参照)で染色し、シゾントの頻度を決定します(図1)。
6. 最適なトランスフェクション効率を得るには、寄生虫の60%〜70%がシゾント段階にある必要があります。この閾値を下回ると判断された場合は、ステップ2.4と同様に培養を続行し、1時間ごとに上記の閾値を超えていることを確認してから続行します。

3. Plasmodium schizontsのトランスフェクション

1. 13 mL の密度グラジエントストック培地( 材料表を参照)を 1.44 mL の 1.5 M NaCl および 5.6 mL の 0.15 M NaCl と 50 mL の遠心分離チューブに再溶解して、グラジエント遠心分離バッファーを調製します。
2. 25 mLの血液培養液を新しい50 mLの遠心分離チューブに移します。20 mL のグラジエント遠心分離バッファーを、細いガラスピペットを使用して遠心分離チューブの底部に慎重に層状にし、グラジエントカラムを作成します。液体の層や界面を乱さないように注意し、バッファーと培地を明確に分離してください。
3. 450 x g で20分間遠心分離し、室温でブレーキをかけずに分離します。 パスツールピペットを使用して、培地とグラジエント遠心分離バッファーの界面にあるシゾント層¹⁵ を慎重に除去し、新しい50 mL遠心分離チューブに入れます。
4. 単離したシゾントを完全なRPMI培地に再懸濁し、総容量を40 mLにします。室温で 450 x g で 8 分間遠心分離し、上清を廃棄します。
5. シゾントを10 mLの完全RPMI培地に再懸濁します。次に、トランスフェクションごとにこの溶液1 mLを1.5 mLの微量遠心チューブに移し、16,000 x g で5秒間遠心分離して、感染した赤血球をペレット化します。上記の方法で2匹のマウスに由来する感染した赤血球は、最大10回の別々のトランスフェクションに使用できます。
6. 100 μL のエレクトロポレーションバッファー(エレクトロポレーションキットのヌクレオフェクター溶液、 材料表を参照)を 5 μg の環状または直鎖化ターゲットプラスミド DNA(最大容量 10 μL)と室温で混合し、トランスフェクションごとに別々の 1.5 mL 微量遠心チューブに入れます。「プラスミドなし」のサンプルは、トランスフェクションおよび抗生物質選択のコントロールとして含める必要があります。
7. ステップ3.5から遠心分離後に上清を除去し、調製したヌクレオフェクター溶液+プラスミドDNAに感染した赤血球を慎重に再懸濁します(ステップ3.6から)。
8. 懸濁液(ヌクレオフェクター溶液+プラスミド+シゾント、最大110 μL)をエレクトロポレーションキュベットに移します。適切な核酸プログラム(U-033、材料表を参照)を使用してトランスフェクションします。
   メモ: 手順 3.8 から 3.10 が RT で実行されていることを確認します。
9. 100 μLの完全RPMI培地をキュベットに加え、溶液全体(総容量200 μL)を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、室温で保持します。
10. トランスフェクションした寄生虫の200 μL溶液をマウスに静脈内注射し(i.v.)、トランスフェクションからマウスへの最終注射までの時間を最小化します。
    注:トランスフェクションされたシゾントは、エレクトロポレーション後5分以内にマウスに注入され、プロトコルの効率が最大化されます。

4. トランスフェクションされた寄生虫の選別

1. トランスフェクションしたシゾントを毎日2d.p.i.から接種したマウスの寄生虫血症レベルをチェックし、感染を確認します。
2. 感染が確認されたら、飲料水への薬物の経口投与を使用して薬物の選択を開始し、 アドリビタムで提供されます。
   注:ピリメタミンは、プラスミドの選択可能な薬物マーカーとして採用されました。この場合、250 mLの浄水(最終濃度70 mg/L)に17.5 mgのピリメタミンを添加しました。さらに、この水に10gの砂糖を加えて、マウスによるピリメタミン含有水の適切な消費を促しました。
3. ピリメタミン治療開始から6日後から、5μlの血液で作られた血液塗抹標本を使用して、2日ごとに寄生虫血症を監視します。.15日後に検出可能な寄生虫がない場合は、トランスフェクションの失敗を示します。この場合、手順 1.1 からプロセスを再開して、もう一度やり直してください。
4. 寄生虫血症が少なくとも1%に達したら、寄生虫をナイーブB6マウスに移し、血液期の寄生虫ストックを作成します。寄生虫血症が2%〜5%に達するまで、新たに感染したマウスで選択を続け、その時点でストックを生成して凍結保存します²¹。

5. トランスジェニック株による蚊の感染

1. 選択した寄生虫を含む血液200 μLをB6マウスに感染させます(2 x 10⁵ 感染したRBC/マウス、静脈内)。蚊の摂食と感染の日にこれらのマウスの寄生虫症を決定します。2%〜5%の寄生虫血症は、蚊の感染に最適です。確認したら、手順5.2〜5.4に従って、すぐにメスのハ マダラカ に感染を移します。
   注意: 感染用の蚊を含むインキュベーターは、20.5°C、湿度80%、および12時間の明暗サイクル(午前7:00から午後07:00の間に点灯)に維持する必要があります。
2. 蚊に感染する前日に、37°Cに加熱した水で満たされた薄いプラスチック製の蚢や手袋など、雄と雌の両方の蚊が入ったケージの上に熱源を置いて、雌の蚊を分離します。 熱源に引き寄せられた雌の蚊を、昆虫吸引器で取り除き、別の小さなケージに移して感染させます。
   注:オスの蚊は、体のサイズがわずかに小さく、羽毛の触角によってメスの蚊と区別できます。
3. 感染したマウスに全身麻酔薬(例:.、2%トリブロモエタノール/アベルチン)を注射する。各マウスのフットパッドをしっかりとつまんで、完全な麻酔を確保します。それらが反応しない場合、それらは十分に鎮静され、感染を蚊に移す準備ができています。
4. 麻酔をかけたマウスを、胸骨横臥位下でケージに入れた雌の蚊の上(ステップ5.2から)に置きます。前脚と後脚を手動で広げて、蚊の餌付けに最大の表面積を提供します。感染したマウスを各ケージに合計15分間放置し、5分ごとにマウスが目覚めていないことを確認します。給餌が完了したら、子宮頸管脱臼を使用して、または施設の動物使用プロトコルに従ってマウスを安楽死させ、安全に処分します。

6.スポロゾイトの収集

1. 約10 d.p.i.で蚊の中腸にオーシストがないかチェックし、蚊の感染と蚊内での マラリア原虫 の発生が成功することを確認します。鉗子を使用して腹部末端部分を除去することにより、腹部から蚊の中腸を分離します。偏光下で中腸を可視化し、オーシストの存在を確認します²².
2. 野生型のスポロゾイトは、感染したマウスを食べてから18〜21日後に蚊の唾液腺に存在すると予想されます。18日目に、5〜10匹の蚊を解剖して、スポロゾイトの数を評価します。
   注:蚊はエタノールで洗浄して殺します。その後、死んだ蚊をPBSで2回洗浄し、解剖前に破片を取り除きます。
3. 胞子嚢を分離して数えるには、鉗子または細い解剖針を使用して蚊の胸部に圧力をかけながら、蚊の頭を慎重に取り除きます。唾液腺は、切除した頭部に付着したままです(図2)。
4. 唾液腺から追加の蚊の残骸を取り除き、400 μLの蚊解剖培地(1%マウス血清、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコの改変Ealge培地[DMEM]; 材料表を参照)を含む微量遠心チューブに入れます。
5. 30Gの針付きシリンジを15〜20回通過させることにより、孤立した唾液腺を破壊します。.破壊された唾液腺10 μLを蚊の解剖培地に入れ、血球計算盤に入れてカウントします。マウスへの注射、細胞培養への接種、または長期凍結保存のために、所望の濃度の蚊解剖培地またはPBSに再懸濁します^23,24。

結果

シゾントの頻度と発生を決定することは、十分な生存可能な寄生虫がトランスフェクションに最適な段階にあることを保証するために重要です。未熟なシゾントは、赤血球の細胞内空間全体を埋めないメロゾイトが少ないことで、完全に成熟したシゾントと区別できます(図1B)。培養血液から血液塗抹標本を作成する場合、感染した赤血球が破裂し、血液塗抹標本中に遊...

ディスカッション

私たちの研究室では、上記のプロトコルを使用して、トランスジェニック P.berghei 寄生虫の数系統を作成しました。 P. bergheiに最適化されていますが、このプロトコルを使用してトランスジェニックな P. yoelii sporozoitesを生成することにも成功しています。トランスフェクションしたシゾントをマウスに注入した後、寄生虫は通常、プラスミドなし対照を含むすべてのグル?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3