Generación de esporozoítos de Plasmodium berghei modificados genéticamente

Resumen

La malaria se transmite a través de la inoculación de la etapa de esporozoíto de Plasmodium por mosquitos infectados. El Plasmodium transgénico nos ha permitido comprender mejor la biología de la malaria y ha contribuido directamente a los esfuerzos de desarrollo de vacunas contra la malaria. En este trabajo se describe una metodología simplificada para generar esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei .

Resumen

La malaria es una enfermedad mortal causada por el parásito Plasmodium y se transmite a través de la picadura de mosquitos Anopheles hembra. La etapa de esporozoíto de Plasmodium depositada por los mosquitos en la piel de los huéspedes vertebrados pasa por una fase de desarrollo obligatorio en el hígado antes de iniciar la malaria clínica. Sabemos poco sobre la biología del desarrollo de Plasmodium en el hígado; El acceso a la etapa de esporozoíto y la capacidad de modificar genéticamente dichos esporozoítos son herramientas críticas para estudiar la naturaleza de la infección por Plasmodium y la respuesta inmunitaria resultante en el hígado. Aquí, presentamos un protocolo integral para la generación de esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei . Modificamos genéticamente el estadio sanguíneo de P. berghei y usamos esta forma para infectar a los mosquitos Anopheles cuando se alimentan de sangre. Después de que los parásitos transgénicos experimentan el desarrollo en los mosquitos, aislamos la etapa de esporozoíto del parásito de las glándulas salivales del mosquito para la experimentación in vivo e in vitro . Demostramos la validez del protocolo mediante la generación de esporozoítos de una nueva cepa de P. berghei que expresa la subunidad 11 de la proteína verde fluorescente (GFP) (GFP₁₁), y mostramos cómo podría usarse para investigar la biología de la malaria en etapa hepática.

Introducción

A pesar de los avances en el desarrollo de medicamentos y la investigación sobre la prevención y el tratamiento del paludismo, la carga mundial de morbilidad del paludismo sigue siendo alta. Más de medio millón de personas mueren de malaria cada año, y los niveles más altos de mortalidad se observan entre los niños que viven en regiones donde la malaria es endémica, como el África subsahariana¹. La malaria es causada por el parásito Plasmodium, que se transmite a los humanos a través de la picadura de mosquitos Anopheles hembra que portan el parásito en sus glándulas salivales. La etapa infecciosa de Plasmodium, los esporozoítos, se depositan en la piel de los huéspedes vertebrados durante una ingesta de sangre y viajan a través del torrente sanguíneo para infectar las células hepáticas, donde experimentan un desarrollo obligatorio (constituyendo malaria preeritrocítica) antes de infectar a los eritrocitos. La infección de los eritrocitos inicia el estadio sanguíneo de la malaria y es responsable de la totalidad de la morbilidad y mortalidad asociada a la enfermedad ^2,3.

La naturaleza obligada del desarrollo preeritrocitario de Plasmodium lo ha convertido en un objetivo atractivo para los esfuerzos de desarrollo de vacunas y fármacos profilácticos⁴. Un requisito previo para estudiar la biología de la malaria preeritrocítica, así como para el desarrollo de vacunas o fármacos dirigidos a la etapa hepática, es el acceso a los esporozoítos de Plasmodium. Además, nuestra capacidad para generar esporozoítos de Plasmodium modificados genéticamente ha sido fundamental para el éxito de tales esfuerzos de investigación 5,6,7,8,9. Las líneas transgénicas de Plasmodium que expresan proteínas reporteras fluorescentes o luminiscentes nos han permitido rastrear su desarrollo in vivo e in vitro^10,11. Los parásitos genéticamente atenuados (GAPs, por sus siglas en inglés), generados a través de la deleción de múltiples genes en Plasmodium, son también algunos de los candidatos vacunales más prometedores^12,13.

Los modelos de malaria en roedores y primates no humanos nos han ayudado a comprender los mecanismos de las interacciones huésped-parásito en la malaria humana debido a las similitudes en la biología y el ciclo de vida entre las especies de Plasmodium ¹⁴. El uso de especies de Plasmodium que infectan a los roedores, pero no a los humanos (por ejemplo, P. berghei) permite mantener el ciclo de vida completo del parásito y la generación de esporozoítos infecciosos para estudiar la malaria en etapa hepática en un entorno controlado de nivel 1 de bioseguridad. Ya existe una variedad de protocolos separados para la generación de parásitos transgénicos de Plasmodium en estadio sanguíneo 15, la infección de mosquitos¹⁶ y el aislamiento de esporozoítos¹⁷. Aquí, describimos un protocolo integral que combina estas metodologías para generar y aislar esporozoítos transgénicos de P. berghei, utilizando la nueva cepa transgénica PbGFP₁₁ como ejemplo. PbGFP 11 transporta la 11ª cadena de β de la proteína fluorescente verde (GFP) de supercarpeta, GFP₁₁, a la vacuola parasitófora (PV) generada en los hepatocitos del huésped. La PbGFP₁₁ se utiliza junto con hepatocitos transgénicos (Hepa1-6 de fondo) que expresan residuos que constituyen el fragmento de GFP 1-10 (GFP _1-10) en el citoplasma (células Hepa GFP _1-10). La PbGFP₁₁ reporta la lisis de PV en los hepatocitos del huésped a través de la autocomplementación y la reformación de la GFP funcional y la señal de fluorescencia verde¹⁸. Cabe destacar que GFP 11 se codifica como una serie de siete secuencias en tándem en PbGFP₁₁ para mejorar la señal de fluorescencia resultante. Al teñir los esporozoítos de PbGFP₁₁ con el colorante citoplasmático CellTrace Violet (CTV), podemos rastrear los parásitos. La lisis de estos parásitos intracelulares teñidos con CTV da lugar a la fuga de CTV en el citoplasma de la célula huésped y a la tinción de la célula huésped. Además de visualizar y distinguir la lisis de Plasmodium PV y/o del parásito en los hepatocitos del huésped, este sistema puede utilizarse de forma fiable para estudiar las vías inmunes responsables de cualquiera de estos procesos, a través de la perturbación genética o terapéutica de los componentes moleculares de dichas vías.

Protocolo

Todas las investigaciones con animales vertebrados en nuestro laboratorio se realizaron de acuerdo con las pautas y protocolos de uso de animales de la Universidad de Georgia.

1. Generación de ratones infectados por P. berghei

1. Iniciar la infección en la etapa sanguínea en ratones C57BL/6 (B6) machos o hembras de 6 a 8 semanas de edad utilizando parásitos de P. berghei de tipo salvaje. Para ello, se transfiere sangre criopreservada infectada con P. berghei (2 x 10⁵ glóbulos rojos infectados), reconstituida en 400 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), a uno o dos ratones donantes por vía intraperitoneal (i.p.).
2. Transferir sangre fresca recolectada a través de sangrado retroorbitario de los ratones donantes a los 5 días después de la infección (d.p.i.) a dos ratones B6 naïve. Para ello, se recogen 200 μL de sangre, se reconstituyen con 300 μL de PBS y se inyectan 200 μL i.p. en los ratones receptores. Asegurar que la parasitemia en los donantes en este momento sea del 2%-5%^19,20.
3. Monitorizar la parasitemia como se ha descrito anteriormente^19,20, a partir de 2 d.p.i. en los receptores. Cuando la parasitemia oscila entre el 3% y el 5% (alrededor de 5 d.p.i.), se sacrifica a los ratones receptores y luego se recolecta sangre mediante punción cardíaca o sangrado retroorbitario. Aplicar la eutanasia a los ratones mediante inhalación de dióxido de carbono seguida de dislocación cervical, o de acuerdo con las pautas institucionales.
   NOTA: Una vez que la parasitemia supera el 5%, la eficiencia de la transfección puede reducirse debido al aumento de la prevalencia de glóbulos rojos infectados múltiplemente.

2. Generación de esquizontes en cultivo

1. Recolectar sangre de los ratones infectados en el paso 1.3 (aproximadamente 2 ml en total de dos ratones) en 5 ml de solución de Alsever (ver Tabla de materiales) en un ambiente estéril. Realice los pasos 2.1 a 3.12 en condiciones estériles.
   NOTA: Las condiciones estériles incluyen el uso de guantes, la limpieza de guantes y superficies con etanol al 70%, el empleo de consumibles y materiales estériles y el trabajo dentro de un gabinete de bioseguridad.
2. Centrifugar la sangre durante 8 min a 450 x g a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 10 mL de medio RPMI completo (RPMI 1640 con 20% de suero fetal bovino [FBS] y 1% de penicilina-estreptomicina, v/v).
3. Centrifugar durante 8 min a 450 x g a RT. Vuelva a suspender el gránulo en 25 ml de medio RPMI completo y transfiéralo a un matraz de cultivo T75 con tapón filtrante.
4. Colocar en una incubadora a 36,5 °C y 5% de CO₂, agitando suavemente para mantener las células en suspensión durante 16 h.
5. En el punto de tiempo de 16 h, verifique el desarrollo de esquizontes. Para ello, recoja 500 μL de la muestra, centrifugue a 450 x g durante 8 min, vuelva a suspender el gránulo en 10 μL de medio RPMI completo y prepare un frotis de sangre fino. Teñir el frotis de sangre con la tinción de Giemsa¹⁹ (ver Tabla de Materiales) y determinar la frecuencia de esquizontes (Figura 1).
6. Para una eficiencia óptima de la transfección, el 60%-70% de los parásitos deben estar en la etapa de esquizonte. Si se determina menos de este umbral, continúe cultivando como en el paso 2.4 y verifique cada hora para asegurarse de que se haya cruzado el umbral anterior antes de continuar.

3. Transfección de Plasmodium schizonts

1. Prepare un tampón de centrifugación en gradiente reconstituyendo 13 mL de medio madre de gradiente de densidad (ver Tabla de Materiales) con 1,44 mL de NaCl 1,5 M y 5,6 mL de NaCl 0,15 M en un tubo de centrifugación de 50 mL.
2. Transfiera 25 ml de hemocultivo a un tubo de centrifugación nuevo de 50 ml. Aplique con cuidado 20 ml de tampón de centrifugación de gradiente en el fondo del tubo de centrifugación con una pipeta de vidrio estrecha para crear una columna de gradiente. Tenga cuidado de no alterar las capas líquidas y las interfaces y asegúrese de una división clara entre el tampón y el medio.
3. Centrifugar durante 20 min a 450 x g sin freno en RT. Con una pipeta Pasteur, retire con cuidado la capa¹⁵ de esquizonte situada en la interfaz del medio de cultivo y el tampón de centrifugación en gradiente, y colóquela en un nuevo tubo de centrifugación de 50 ml.
4. Vuelva a suspender los esquizontes aislados en medios RPMI completos y aumente el volumen total a 40 ml. Centrifugar a 450 x g durante 8 min a RT y desechar el sobrenadante.
5. Vuelva a suspender los esquizontes en 10 ml de medio RPMI completo. A continuación, transfiera 1 ml de esta solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada transfección y centrifugue a 16.000 x g durante 5 s para granular los glóbulos rojos infectados. Los glóbulos rojos infectados derivados de dos ratones de la manera anterior se pueden utilizar para hasta 10 transfecciones separadas.
6. Combine 100 μL del tampón de electroporación (solución nucleofectora del kit de electroporación; ver Tabla de Materiales) a RT con 5 μg de ADN plasmídico diana circular o linealizado (en un volumen máximo de 10 μL), según corresponda para cada transfección en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mL. Se debe incluir una muestra "sin plásmido" como control para la transfección y la selección de antibióticos.
7. Retire el sobrenadante después de la centrifugación del paso 3.5 y vuelva a suspender cuidadosamente los glóbulos rojos infectados en la solución nucleofectora preparada + ADN plasmídico (del paso 3.6).
8. Transferir la suspensión (solución nucleofectora + plásmido + esquizontes; 110 μL máximo) a cubetas de electroporación. Transfectar utilizando un programa nucleofector adecuado (U-033, ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Asegúrese de que los pasos 3.8 a 3.10 se realicen en RT.
9. Agregue 100 μL de medio RPMI completo a la cubeta y transfiera toda la solución (ahora 200 μL de volumen total) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y manténgalo en RT.
10. Inyectar la solución de 200 μL de parásitos transfectados en ratones por vía intravenosa (i.v.), trabajando para minimizar el tiempo entre la transfección y la inyección final en ratones.
    NOTA: Los esquizontes transfectados se inyectan en ratones menos de 5 minutos después de la electroporación para maximizar la eficiencia del protocolo.

4. Selección de los parásitos transfectados

1. Comprobar los niveles de parasitemia en los ratones inoculados con los esquizontes transfectados diariamente a partir de 2 d.p.i. para verificar la infección.
2. Una vez verificada la infección, se debe iniciar la selección del fármaco mediante la administración oral del fármaco en agua de bebida, ofrecida ad libitum.
   NOTA: La pirimetamina se empleó como marcador de fármaco seleccionable para el plásmido. En este caso, se añadieron 17,5 mg de pirimetamina a 250 mL de agua limpia (concentración final de 70 mg/L). Además, se añadieron 10 g de azúcar a esta agua para fomentar el consumo adecuado del agua que contiene pirimetamina por parte de los ratones.
3. Monitorizar la parasitemia cada dos días mediante frotis de sangre realizados con 5 μl de sangre, a partir de los 6 días posteriores al inicio del tratamiento con pirimetamina. La falta de parásitos detectables después de 15 días indica una transfección fallida; En este caso, reinicie el proceso desde el paso 1.1 para un nuevo intento.
4. Cuando la parasitemia alcanza al menos el 1%, transfiere los parásitos a ratones B6 ingenuos para la creación de reservas de parásitos en estadio sanguíneo. Continuar la selección en los ratones recién infectados hasta que la parasitemia alcance el 2%-5%, momento en el que generar existencias y criopreservarlas²¹.

5. Infección de mosquitos con las líneas transgénicas

1. Infectar ratones B6 con 200 μL de sangre que contenga los parásitos seleccionados (2 x 10⁵ glóbulos rojos infectados/ratón, i.v.). Determinar la parasitemia en estos ratones el día de la alimentación y la infección del mosquito. La parasitemia entre el 2% y el 5% es óptima para la infección de mosquitos. Una vez verificada, transfiera inmediatamente la infección a los mosquitos hembra de Anopheles stephensi de acuerdo con los pasos 5.2-5.4).
   NOTA: Las incubadoras que contengan mosquitos infecciosos deben mantenerse a 20,5 °C, al 80% de humedad y en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (luces encendidas entre las 07:00 a.m. y las 07:00 p.m.).
2. El día antes de la infección por mosquitos, separe a los mosquitos hembra colocando una fuente de calor en la parte superior de la jaula que contenga mosquitos machos y hembras, como una vejiga de plástico delgada o un guante lleno de agua calentada a 37 ° C. Retire los mosquitos hembra, que se sienten atraídos por la fuente de calor, usando un aspirador de insectos y transfiéralos a una jaula separada y más pequeña para la infección.
   NOTA: Los mosquitos machos se pueden distinguir de los mosquitos hembra por su tamaño corporal ligeramente reducido y sus antenas plumosas.
3. Inyecte a los ratones infectados un anestésico general (p. ej., tribromoetanol/avertina al 2%). Asegúrese de que la anestesia sea completa pellizcando firmemente la almohadilla para los pies de cada ratón. Si no reaccionan, están lo suficientemente sedados y listos para transferir la infección a los mosquitos.
4. Coloque los ratones anestesiados encima de los mosquitos hembra enjaulados (del paso 5.2) en decúbito esternal. Separe manualmente las patas delanteras y traseras para proporcionar la mayor superficie para la alimentación de los mosquitos. Deje a los ratones infectados sobre cada jaula durante un total de 15 minutos, revisando cada 5 minutos para asegurarse de que los ratones no estén despiertos. Una vez que se complete la alimentación, eutanasiar a los ratones utilizando la dislocación cervical, o según el protocolo institucional de uso de animales, y deséchelos de manera segura.

6. Recolección de esporozoítos

1. Revise el intestino medio de los mosquitos en busca de ooquistes a aproximadamente 10 d.p.i. para verificar la infección exitosa y el desarrollo de Plasmodium dentro de los mosquitos. Aísle el intestino medio del mosquito del abdomen extirpando el segmento abdominal terminal con fórceps. Visualizar el intestino medio bajo luz polarizada para detectar la presencia de ooquistes²².
2. Se espera que los esporozoítos de tipo salvaje estén presentes en las glándulas salivales de los mosquitos entre 18 y 21 días después de alimentarse de ratones infectados. En el día 18, diseccione de 5 a 10 mosquitos para evaluar el número de esporozoítos.
   NOTA: Los mosquitos se lavan y se matan con etanol. Posteriormente, los mosquitos muertos se lavan dos veces con PBS para eliminar los desechos antes de la disección.
3. Para aislar y contar los esporozoítos, retire con cuidado la cabeza del mosquito mientras aplica presión sobre el tórax del mosquito con fórceps o una aguja fina de disección. Las glándulas salivales permanecen adheridas a la cabeza extirpada (Figura 2).
4. Retire cualquier resto adicional de mosquitos de las glándulas salivales y colóquelo en un tubo de microcentrífuga que contenga 400 μL de medios de disección de mosquitos (medio Ealge modificado de Dulbecco [DMEM] con suero de ratón al 1%, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina; consulte la Tabla de materiales).
5. Interrumpa las glándulas salivales aisladas pasando a través de una jeringa agujereada de 30 G 15-20 veces. Coloque 10 μL de las glándulas salivales alteradas en un medio de disección de mosquitos en un hemocitómetro y cuente. Resuspender en la concentración deseada de medios de disección de mosquitos o PBS para inyección en ratones, inoculación en cultivos celulares o criopreservación a largo plazo^23,24.

Resultados

Determinar la frecuencia y el desarrollo de los esquizontes es fundamental para asegurar que suficientes parásitos viables estén en la etapa óptima para la transfección. Los esquizontes inmaduros se pueden diferenciar de los esquizontes completamente maduros por la presencia de menos merozoítos que no llenan todo el espacio intracelular de los glóbulos rojos (Figura 1B). Es importante tener en cuenta que al hacer frotis de sangre a partir de sangre cultivada, los glóbulos rojos infect...

Discusión

Hemos utilizado el protocolo anterior en nuestro laboratorio para crear varias líneas de parásitos transgénicos de P. berghei. Aunque optimizado para P. berghei, también hemos utilizado con éxito este protocolo para generar esporozoítos transgénicos de P. yoelii. Después de inyectar los esquizontes transfectados en ratones, los parásitos son detectables típicamente a más tardar 3 d.p.i. en todos los grupos, incluido el control sin plásmido. La selección se inicia solo una vez que s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3