יצירת פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי ספורוזואיטים

Summary

מלריה מועברת באמצעות חיסון של שלב sporozoite של פלסמודיום על ידי יתושים נגועים. פלסמודיום מהונדס איפשר לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה של המלריה ותרם ישירות למאמצי פיתוח החיסון למלריה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס.

Abstract

מלריה היא מחלה קטלנית הנגרמת על ידי הטפיל פלסמודיום ומועברת באמצעות עקיצה של יתושי אנופלס נקביים. שלב הספורוזואיטים של פלסמודיום המושקע על ידי יתושים בעורם של פונדקאים בעלי חוליות עובר שלב של התפתחות חובה בכבד לפני תחילת המלריה הקלינית. אנו יודעים מעט מאוד על הביולוגיה של התפתחות פלסמודיום בכבד; הגישה לשלב הספורוזואיטים והיכולת לשנות גנטית ספורוזואיטים כאלה הם כלים קריטיים לחקר טבעו של זיהום פלסמודיום והתגובה החיסונית הנובעת מכך בכבד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס. אנו משנים גנטית את שלב הדם P. berghei ומשתמשים בצורה זו כדי להדביק יתושי אנופלס כאשר הם לוקחים ארוחת דם. לאחר שהטפילים הטרנסגניים עוברים התפתחות אצל היתושים, אנו מבודדים את שלב הספורוזואיטים של הטפיל מבלוטות הרוק של היתושים לצורך ניסויים in vivo ו-in vitro . אנו מדגימים את תקפות הפרוטוקול על ידי יצירת ספורוזואיטים של זן חדש של P. berghei המבטא את תת-היחידה 11 של החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) (GFP₁₁), ומראים כיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור את הביולוגיה של מלריה בשלב הכבד.

Introduction

למרות ההתקדמות בפיתוח תרופות ובמחקר למניעה וטיפול במלריה, נטל התחלואה העולמי של המלריה נותר גבוה. יותר מחצי מיליון בני אדם מתים ממלריה מדי שנה, כאשר רמות התמותה הגבוהות ביותר נצפו בקרב ילדים החיים באזורים אנדמיים למלריה, כגון אפריקה שמדרום לסהרה¹. מלריה נגרמת על ידי הטפיל פלסמודיום, המועבר לבני אדם באמצעות עקיצה של יתושי אנופלס נקביים הנושאים את הטפיל בבלוטות הרוק שלהם. השלב הזיהומי של פלסמודיום - הספורוזואיטים - מופקדים בעורם של המארחים בעלי החוליות במהלך ארוחת דם ונוסעים דרך זרם הדם כדי להדביק תאי כבד, שם הם עוברים התפתחות חובה (המהווה מלריה טרום אריתרוציטים) לפני הדבקת אריתרוציטים. זיהום של אריתרוציטים מתחיל את שלב הדם של מלריה והוא אחראי על כל התחלואה והתמותה הקשורים למחלה ^2,3.

אופיו המחייב של הפיתוח הפרה-אריתרוציטי של פלסמודיום הפך אותו למטרה אטרקטיבית למאמצי חיסון מניעתי ופיתוח תרופות⁴. תנאי מוקדם לחקר הביולוגיה של מלריה טרום אריתרוציטית, כמו גם לפיתוח חיסונים או תרופות המכוונות לשלב הכבד, הוא גישה לספורוזואיטים פלסמודיום. יתר על כן, היכולת שלנו לייצר פלסמודיום sporozoites מהונדס גנטית כבר חיוני להצלחה של מאמצי מחקר כאלה 5,6,7,8,9. קווי פלסמודיום טרנסגניים המבטאים חלבוני כתב פלואורסצנטיים או זוהרים אפשרו לנו לעקוב אחר התפתחותם in vivo ו- in vitro^10,11. טפילים מוחלשים גנטית (GAPs), הנוצרים באמצעות מחיקה של גנים מרובים בפלסמודיום, הם גם חלק מהמועמדים המבטיחים ביותר לחיסון^12,13.

מודלים של מכרסמים ומלריה של פרימטים שאינם אנושיים סייעו לנו להבין את המנגנונים של אינטראקציות פונדקאי-טפיל במלריה אנושית בשל הדמיון בביולוגיה ובמחזור החיים בין מיני פלסמודיום ¹⁴. השימוש בזני פלסמודיום המדביקים מכרסמים, אך לא בני אדם (למשל, P. berghei) מאפשר שמירה על מחזור החיים המלא של הטפיל ויצירת ספורוזואיטים זיהומיים לחקר מלריה בשלב הכבד בסביבה מבוקרת של בטיחות ביולוגית ברמה 1. מגוון פרוטוקולים נפרדים כבר קיימים ליצירת טפילי פלסמודיום בשלב הדם המהונדס 15, זיהום יתושים¹⁶ ובידוד ספורוזואיטים¹⁷. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מקיף המשלב מתודולוגיות אלה על מנת ליצור ולבודד sporozoites P. berghei טרנסגני, תוך שימוש בזן המהונדס החדש PbGFP₁₁ כדוגמה. PbGFP 11 מעביר את הגדיל β ה-11 של חלבון פלואורסצנטי ירוק סופר-תיקייה (GFP), GFP₁₁, לתוך הוואקול הטראיטופורי (PV) שנוצר בהפטוציטים המארחים. PbGFP 11 משמש בשילוב עם הפטוציטים טרנסגניים (רקע Hepa1-6) המבטאים שאריות המהוות את מקטע GFP 1-10 (GFP 1-10) בציטופלסמה (תאי Hepa GFP _1-10). PbGFP₁₁ מדווח על ליזה PV בהפטוציטים המארחים באמצעות השלמה עצמית ורפורמה של GFP פונקציונלי ואות פלואורסצנטי ירוק¹⁸. יש לציין כי GFP 11 מקודד כסדרה של שבעה רצפי טנדם ב-PbGFP₁₁ כדי לשפר את האות הפלואורסצנטי המתקבל. לאחר צביעת PbGFP₁₁ sporozoites עם צבע cytoplasmic CellTrace Violet (CTV), אנו יכולים לעקוב אחר הטפילים. הליזה של טפילים תוך-תאיים כאלה המוכתמים ב-CTV גורמת בעצמה לדליפה של CTV לתוך הציטופלסמה של התא המארח ולהכתמה של התא המארח. בנוסף להדמיה ולהבחנה של הליזה של פלסמודיום PV ו / או הטפיל בהפטוציטים המארחים, מערכת זו יכולה לשמש באופן אמין לחקר המסלולים החיסוניים האחראים לכל אחד מהתהליכים הללו, באמצעות הפרעה גנטית או טיפולית של המרכיבים המולקולריים של מסלולים כאלה.

Protocol

כל המחקר שכלל בעלי חוליות במעבדה שלנו בוצע בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים של אוניברסיטת ג'ורג'יה לשימוש בבעלי חיים.

1. דור של P . berghei - עכברים נגועים

1. ליזום זיהום בשלב הדם בעכברים C57BL/6 (B6) בני 6-8 שבועות בני 6-8 שבועות באמצעות טפילי P. berghei פראיים. כדי לעשות זאת, להעביר דם נגוע P. berghei בהקפאה (2 x 10⁵ RBCs נגועים), reconsformed ב 400 μL של מלוחים חוצצים פוספט (PBS), לתוך עכבר תורם אחד או שניים intraperitoneally (i.p).
2. העבירו דם טרי שנאסף באמצעות דימום רטרו-אורביטלי מהעכברים התורמים 5 ימים לאחר ההדבקה (d.p.i.) לשני עכברי B6 תמימים. כדי לעשות זאת, לאסוף 200 μL של דם, לשחזר עם 300 μL של PBS, ולהזריק 200 μL i.p. לתוך העכברים המקבלים. ודא כי הפרזיטמיה אצל התורמים בנקודת זמן זו היא 2%-5%^19,20.
3. ניטור פרזיטמיה כפי שתואר קודם לכן^19,20, החל מ 2 d.p.i. אצל המושתלים. כאשר הפרזיטמיה נעה בין 3%-5% (סביב 5 d.p.i.), יש להרדים את העכברים המקבלים ולאחר מכן לאסוף דם באמצעות ניקוב לב או דימום רטרו-אורביטלי. יש להרדים את העכברים באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני ולאחריה פריקת צוואר הרחם, או על פי הנחיות מוסדיות.
   הערה: ברגע שהפרזיטמיה עולה על 5%, יעילות הטרנספקציה עשויה להיות מופחתת בשל השכיחות המוגברת של RBCs נגועים מרובים.

2. דור סכיזונטים בתרבות

1. איסוף דם מהעכברים הנגועים בשלב 1.3 (כ-2 מ"ל בסך הכל משני עכברים) לתוך 5 מ"ל של תמיסת אלסבר (ראו טבלת חומרים) בסביבה סטרילית. בצע את שלבים 2.1 עד 3.12 בתנאים סטריליים.
   הערה: תנאים סטריליים כוללים לבישת כפפות, ניגוב כפפות ומשטחים עם 70% אתנול, שימוש בחומרים מתכלים סטריליים ועבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
2. צנטריפוגה את הדם במשך 8 דקות ב 450 x גרם בטמפרטורת החדר (RT). יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-10 מ"ל של מדיית RPMI מלאה (RPMI 1640 עם 20% נסיוב בקר עוברי [FBS] ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין, v/v).
3. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב 450 x גרם ב RT. להשהות מחדש את הגלולה ב 25 מ"ל של מדיה RPMI מלאה ולהעביר בקבוק תרבית T75 עם מכסה מסנן.
4. מניחים באינקובטור בטמפרטורה של 36.5 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂, תוך כדי ניעור עדין כדי לשמור על התאים בתרחיף למשך 16 שעות.
5. בנקודת הזמן של 16 שעות, בדוק את התפתחות סכיזונט. כדי לעשות זאת, לאסוף 500 μL של הדגימה, צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 8 דקות, להשעות את הגלולה ב 10 μL של מדיה RPMI מלא, ולהכין כתם דם דק. הכתימו את כתם הדם בכתם Giemsa¹⁹ (ראו טבלת חומרים) וקבעו את תדירות הסכיזונטים (איור 1).
6. לקבלת יעילות העברה אופטימלית, 60%-70% מהטפילים צריכים להיות בשלב סכיזונט. אם נקבע פחות מסף זה, המשיכו לטפח כמו בשלב 2.4 ובדקו כל שעה כדי לוודא שנחצה הסף הנ"ל לפני שתמשיכו.

3. טרנספקציה של סכיזונט פלסמודיום

1. הכן חיץ צנטריפוגה הדרגתי על ידי הרכבה מחדש של 13 מ"ל של מדיום מלאי שיפוע צפיפות (ראה טבלת חומרים) עם 1.44 מ"ל של 1.5 M NaCl ו- 5.6 מ"ל של 0.15 M NaCl בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
2. העבר 25 מ"ל של תרבית דם לצינור צנטריפוגה טרי של 50 מ"ל. שכב בזהירות 20 מ"ל של חיץ צנטריפוגה הדרגתית לתחתית צינור הצנטריפוגה באמצעות פיפטה זכוכית צרה כדי ליצור עמוד הדרגתי. יש להקפיד שלא להפריע לשכבות ולממשקים הנוזליים ולהקפיד על חלוקה ברורה בין החיץ למדיה.
3. צנטריפוגה למשך 20 דקות ב 450 x גרם ללא בלם ב RT. באמצעות פיפטה פסטר, להסיר בזהירות את שכבת סכיזונט¹⁵ הממוקם בממשק של מדיה תרבות ואת חיץ צנטריפוגה הדרגתית, ומניחים אותו בתוך צינור צנטריפוגה חדש 50 מ"ל.
4. השהה מחדש את הסכיזונטים המבודדים במדיית RPMI מלאה והעלה את הנפח הכולל ל -40 מ"ל. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 8 דקות ב RT ולהשליך את supernatant.
5. להשעות מחדש את schizonts ב 10 מ"ל של מדיה RPMI מלא. לאחר מכן, העבר 1 מ"ל של תמיסה זו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל עבור כל טרנספקציה, וצנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 5 שניות כדי לגלול RBCs נגועים. RBCs נגועים נגזר שני עכברים באופן לעיל יכול לשמש עד 10 transfections נפרדים.
6. ערבבו 100 μL של חיץ האלקטרופורציה (תמיסת נוקלאופקטור מערכת האלקטרופורציה; ראו טבלת חומרים) ב-RT עם 5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד מטרה מעגלי או ליניארי (בנפח מרבי של 10 μL), לפי הצורך עבור כל טרנספקציה בצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 1.5 מ"ל. דגימה "ללא פלסמיד" חייבת להיכלל כבקרה עבור טרנספקציה ובחירת אנטיביוטיקה.
7. הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה משלב 3.5 בזהירות להשעות מחדש את RBCs נגועים בתמיסת נוקלאופקטור מוכן + DNA פלסמיד (משלב 3.6).
8. מעבירים את המתלה (תמיסת נוקלאופקטור + פלסמיד + סכיזונט; 110 מיקרוליטר מקסימום) לקוביות אלקטרופורציה. העבר באמצעות תוכנית נוקלאופקטור מתאימה (U-033, ראה טבלת חומרים).
   הערה: ודא ששלבים 3.8 עד 3.10 מבוצעים ב- RT.
9. הוסף 100 μL של מדיה RPMI מלאה לקובט ולהעביר את הפתרון כולו (עכשיו 200 μL נפח כולל) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ולשמור על RT.
10. הזריקו את תמיסה של 200 μL של טפילים נגועים לעכברים תוך ורידי (i.v.), תוך עבודה כדי למזער את הזמן בין הטרנספקציה לבין הזריקה הסופית לעכברים.
    הערה: סכיזונטים נגועים מוזרקים לעכברים פחות מ-5 דקות לאחר אלקטרופורציה כדי למקסם את יעילות הפרוטוקול.

4. בחירת הטפילים הנגועים

1. בדוק את רמות הטפילים בעכברים שחוסנו בסכיזונטים הנגועים מדי יום מ -2 d.p.i. כדי לאמת את ההדבקה.
2. לאחר אימות הזיהום, התחל בבחירת התרופה באמצעות מתן אוראלי של התרופה במי השתייה, המוצע אד ליביטום.
   הערה: Pyrimethamine שימש כסמן התרופה לבחירה עבור פלסמיד. במקרה זה, 17.5 מ"ג של pyrimethamine נוסף 250 מ"ל של מים נקיים (ריכוז סופי של 70 מ"ג / ליטר). בנוסף, 10 גרם סוכר נוסף למים אלה כדי לעודד צריכה נאותה של מים המכילים pyrimethamine על ידי עכברים.
3. לפקח על פרזיטמיה כל יומיים באמצעות מריחות דם שנעשו עם 5 μl של דם, החל מ 6 ימים לאחר תחילת הטיפול pyrimethamine. היעדר טפילים הניתנים לגילוי לאחר 15 יום מצביע על העברה כושלת; במקרה זה, התחל מחדש את התהליך משלב 1.1 עבור ניסיון חדש.
4. כאשר הטפילים מגיעים לפחות ל-1%, מעבירים את הטפילים לעכברי B6 תמימים ליצירת מלאי טפילים בשלב הדם. המשיכו את הסלקציה בעכברים החדשים שנדבקו עד שהטפילים יגיעו ל-2%-5%, ואז ייצרו מלאי וישמרו אותם בהקפאה²¹.

5. זיהום יתושים עם קווים טרנסגניים

1. להדביק עכברי B6 עם 200 μL של דם המכיל את הטפילים שנבחרו (2 x 10⁵ RBCs נגוע / עכבר, i.v). לקבוע טפילים בעכברים אלה ביום האכלת יתושים וזיהום. פרזיטמיה בין 2%-5% היא אופטימלית להדבקת יתושים. לאחר האימות, העבירו מיד את הזיהום לנקבת יתושי אנופלס סטפנסי לפי שלבים 5.2-5.4).
   הערה: אינקובטורים המכילים יתושים להדבקה צריכים להישמר ב 20.5 ° C, ב 80% לחות, ובמחזור אור / חושך 12 שעות (אורות דולקים בין 07: 00 בבוקר עד 07: 00 בערב).
2. יום לפני הדבקת יתושים, להפריד את נקבות היתושים על ידי הנחת מקור חום על גבי הכלוב המכיל יתושים זכרים ונקבות כאחד, כגון שלפוחית פלסטיק דקה או כפפה מלאה במים מחוממים ל 37 מעלות צלזיוס. הוציאו את נקבות היתושים, שנמשכות למקור החום, באמצעות שואב חרקים והעבירו אותן לכלוב נפרד וקטן יותר להדבקה.
   הערה: ניתן להבדיל בין יתושים זכרים ליתושים נקבות על ידי גודל גופם המצומצם מעט ואנטנות פלומוזיות.
3. הזריקו לעכברים הנגועים חומר הרדמה כללי (למשל, 2% טריברומואתנול/אברטין). ודא הרדמה מלאה על ידי צביטה חזקה של כרית כף הרגל של כל עכבר. אם הם לא מגיבים, הם מורדמים מספיק ומוכנים להעביר את הזיהום ליתושים.
4. הניחו את העכברים המורדמים על נקבות היתושים הכלואות בכלוב (משלב 5.2) תחת שכיבה עצם החזה. פזרו ידנית את הרגליים הקדמיות והאחוריות כדי לספק את שטח הפנים הגדול ביותר להאכלת יתושים. השאירו את העכברים הנגועים מעל כל כלוב למשך 15 דקות בסך הכל, בדקו כל 5 דקות כדי לוודא שהעכברים אינם ערים. לאחר השלמת ההאכלה, יש להרדים את העכברים באמצעות נקע צוואר הרחם, או בהתאם לפרוטוקול השימוש המוסדי בבעלי חיים, ולהשליך אותם בבטחה.

6. אוסף של sporozoites

1. בדוק את midguts יתושים עבור ביציות בערך 10 d.p.i. כדי לוודא זיהום מוצלח ואת התפתחות פלסמודיום בתוך היתושים. בודדו את היתושים מהבטן על ידי הסרת מקטע הבטן הסופי באמצעות מלקחיים. דמיינו את אמצע המעי תחת אור מקוטב לנוכחות ביציות²².
2. ספורוזואיטים מסוג בר צפויים להימצא בבלוטות הרוק של יתושים 18-21 ימים לאחר האכלתם בעכברים נגועים. ביום ה-18, נתחו 5-10 יתושים כדי להעריך את מספר הספורוזואיטים.
   הערה: יתושים נשטפים ומומתים באתנול. לאחר מכן, יתושים מתים נשטפים פעמיים עם PBS כדי להסיר פסולת לפני נתיחה.
3. כדי לבודד ולספור את הספורוזואיטים, הסירו בזהירות את ראש היתוש תוך הפעלת לחץ על בית החזה של היתוש באמצעות מלקחיים או מחט ניתוח עדינה. בלוטות הרוק נשארות מחוברות לראש שהוסר (איור 2).
4. הסירו פסולת יתושים נוספת מבלוטות הרוק והניחו אותה בצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 400 מיקרוליטר של אמצעי דיסקציה של יתושים (מדיום Ealge של דולבקו [DMEM] עם 1% נסיוב עכברים, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין; ראו טבלת חומרים).
5. לשבש את בלוטות הרוק המבודדות על ידי מעבר דרך מזרק מחט 30 גרם 15-20 פעמים. מניחים 10 μL של בלוטות הרוק המשובשות במדיה דיסקציה של יתושים לתוך hemocytometer וספירה. השהיה מחדש בריכוז הרצוי של אמצעי דיסקציה של יתושים או PBS להזרקה לעכברים, חיסון לתרביות תאים, או שימור בהקפאה לטווח ארוך^23,24.

תוצאות

קביעת התדירות וההתפתחות של סכיזונטים היא קריטית כדי להבטיח כי מספיק טפילים קיימא נמצאים בשלב האופטימלי עבור transfection. סכיזונטים לא בוגרים יכולים להיות מובחנים מסכיזונטים בוגרים לחלוטין על-ידי נוכחות של פחות מרוזואיטים שאינם ממלאים את כל החלל התוך-תאי של ה-RBC (איור 1B). חשוב ל?...

Discussion

השתמשנו בפרוטוקול הנ"ל במעבדה שלנו כדי ליצור מספר שורות של טפילי P. berghei טרנסגניים. למרות אופטימיזציה עבור P. berghei, השתמשנו בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור P. yoelii sporozoites טרנסגני. לאחר הזרקת סכיזונטים נגועים לעכברים, טפילים ניתנים לגילוי בדרך כלל לא יאוחר מ 3 d.p.i. בכל הקבוצות, כולל בקר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3