Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Özet

Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium'un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.

Özet

Sıtma, parazit Plasmodium'un neden olduğu ölümcül bir hastalıktır ve dişi Anofel sivrisineklerinin ısırması yoluyla bulaşır. Omurgalı konakçıların derisinde sivrisinekler tarafından biriktirilen Plasmodium'un sporozoit aşaması, klinik sıtmaya başlamadan önce karaciğerde zorunlu bir gelişim aşamasına girer. Karaciğerdeki Plasmodium gelişiminin biyolojisi hakkında çok az şey biliyoruz; sporozoit aşamasına erişim ve bu tür sporozoitleri genetik olarak değiştirme yeteneği, Plasmodium enfeksiyonunun doğasını ve karaciğerde ortaya çıkan bağışıklık tepkisini incelemek için kritik araçlardır. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitlerinin üretimi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Kan evresi P. berghei'yi genetik olarak değiştiriyoruz ve bu formu kan yemeği aldıklarında Anofel sivrisineklerini enfekte etmek için kullanıyoruz. Transgenik parazitler sivrisineklerde geliştikten sonra, in vivo ve in vitro deneyler için parazitin sporozoit aşamasını sivrisinek tükürük bezlerinden izole ediyoruz. Yeşil floresan protein (GFP) alt birimi 11'i (GFP₁₁) eksprese eden yeni bir P. berghei suşunun sporozoitlerini üreterek protokolün geçerliliğini gösteriyoruz ve karaciğer evresi sıtmanın biyolojisini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Giriş

İlaç geliştirme ve sıtmanın önlenmesi ve tedavisine yönelik araştırmalardaki ilerlemelere rağmen, sıtmanın küresel hastalık yükü yüksek olmaya devam etmektedir. Her yıl yarım milyondan fazla insan sıtmadan ölüyor ve en yüksek ölüm oranları Sahra altı Afrika gibi sıtmanın endemik olduğu bölgelerde yaşayan çocuklar arasında görülüyor¹. Sıtmaya, paraziti tükürük bezlerinde taşıyan dişi Anofel sivrisineklerinin ısırması yoluyla insanlara bulaşan parazit Plasmodium neden olur. Plasmodium'un enfeksiyöz aşaması - sporozoitler - bir kan yemeği sırasında omurgalı konakçıların derisinde birikir ve eritrositleri enfekte etmeden önce zorunlu gelişime (eritrosit öncesi sıtma oluşturan) maruz kaldıkları karaciğer hücrelerini enfekte etmek için kan dolaşımından geçer. Eritrositlerin enfeksiyonu sıtmanın kan evresini başlatır ve hastalıkla ilişkili morbidite ve mortalitenin tamamından sorumludur ^2,3.

Plasmodium'un eritrositik gelişiminin zorunlu doğası, onu profilaktik aşı ve ilaç geliştirme çabaları için çekici bir hedef haline getirmiştir⁴. Pre-eritrositik sıtmanın biyolojisinin yanı sıra karaciğer evresini hedef alan aşıların veya ilaçların geliştirilmesini incelemek için bir ön koşul, Plasmodium sporozoitlerine erişimdir. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş Plasmodium sporozoitleri üretme yeteneğimiz, bu tür araştırma çabalarının başarısında etkili olmuştur 5,6,7,8,9. Floresan veya ışıldayan raportör proteinleri eksprese eden Transgenik Plazmodyum hatları, gelişimlerini in vivo ve in vitro olarak izlememize izin verdi ^10,11. Plasmodium'daki çoklu genlerin silinmesi yoluyla üretilen genetik olarak zayıflatılmış parazitler (GAP'ler) de en umut verici aşı adaylarından bazılarıdır^12,13.

Kemirgen ve insan olmayan primat sıtma modelleri, Plasmodium türleri arasındaki biyoloji ve yaşam döngüsündeki benzerlikler nedeniyle insan sıtmasında konak-parazit etkileşimlerinin mekanizmalarını anlamamıza yardımcı olmuştur¹⁴. Kemirgenleri enfekte eden, ancak insanları enfekte etmeyen Plasmodium türlerinin (örneğin, P. berghei) kullanımı, tüm parazit yaşam döngüsünün sürdürülmesine ve kontrollü, biyogüvenlik seviyesi 1 ortamında karaciğer evresi sıtmanın incelenmesi için enfeksiyöz sporozoitlerin üretilmesine izin verir. Transgenik kan evresi Plasmodium parazitlerinin¹⁵, sivrisineklerin¹⁶ enfeksiyonu ve sporozoitlerin¹⁷ izolasyonu için çeşitli ayrı protokoller zaten mevcuttur. Burada, örnek olarak yeni transgenik suş PbGFP_11'i kullanarak, transgenik P. berghei sporozoitlerini üretmek ve izole etmek için bu metodolojileri birleştiren kapsamlı bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. PbGFP 11, süper klasör yeşil floresan proteinin (GFP) 11. β iplikçiğini, GFP_11'i, konakçı hepatositlerde üretilen parazitoforöz vakuole (PV) aktarır. PbGFP 11, sitoplazmada (Hepa GFP 1-10 hücreleri) GFP 1-10 fragmanını (GFP _1-10) oluşturan kalıntıları eksprese eden transgenik hepatositler (Hepa1-6 arka planı) ile birlikte kullanılır. PbGFP₁₁, kendi kendini tamamlama ve fonksiyonel GFP ve yeşil floresan sinyalinin¹⁸ yeniden oluşturulması yoluyla konakçı hepatositlerde PV lizizini bildirir. GFP 11'in, ortaya çıkan floresan sinyalini geliştirmek için PbGFP_11'de yedi tandem dizisinden oluşan bir dizi olarak kodlandığını unutmayın. PbGFP₁₁ sporozoitlerini sitoplazmik boya CellTrace Violet (CTV) ile boyadıktan sonra parazitleri izleyebiliriz. Bu tür CTV ile boyanmış hücre içi parazitlerin parçalanması, CTV'nin konak hücre sitoplazmasına sızmasına ve konak hücrenin boyanmasına neden olur. Plasmodium PV ve/veya konakçı hepatositlerdeki parazitin parçalanmasını görselleştirmeye ve ayırt etmeye ek olarak, bu sistem, bu yolların moleküler bileşenlerinin genetik veya terapötik bozulması yoluyla, bu süreçlerden herhangi birinden sorumlu bağışıklık yollarını incelemek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir.

Protokol

Laboratuvarımızda omurgalı hayvanlarla ilgili tüm araştırmalar, Georgia Üniversitesi hayvan kullanım yönergelerine ve protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. P. berghei ile enfekte farelerin üretimi

1. Vahşi tip P. berghei parazitleri kullanarak erkek veya dişi, 6-8 haftalık C57BL / 6 (B6) farelerinde kan evresi enfeksiyonunu başlatın. Bunu yapmak için, 400 μL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde sulandırılan dondurularak saklanmış P. berghei ile enfekte olmuş kanı (2 x 10⁵ enfekte RBC'ler) intraperitoneal olarak bir veya iki donör fareye aktarın (i.p.).
2. Enfeksiyondan 5 gün sonra (d.p.i.) donör farelerden retro-orbital kanama yoluyla toplanan taze kanı iki saf B6 faresine aktarın. Bunu yapmak için, 200 μL kan toplayın, 300 μL PBS ile sulandırın ve alıcı farelere 200 μL ip enjekte edin. Bu zaman noktasında donörlerde paraziteminin %2-%5 olduğundan emin ^olun19,20.
3. Parazitemiyi daha önce tarif edildiği gibi^{izleyin 19,20,} alıcılarda 2 d.p.i.'den başlayarak. Parazitemi %3-5 (yaklaşık 5 d.p.i.) arasında değiştiğinde, alıcı farelere ötenazi yapın ve ardından kardiyak ponksiyon veya retro-orbital kanama yoluyla kan toplayın. Fareleri karbondioksit inhalasyonu ve ardından servikal çıkık kullanarak veya kurumsal yönergelere göre ötenazi yapın.
   NOT: Parazitemi %5'i aştığında, çoklu enfekte eritrositlerin prevalansının artması nedeniyle transfeksiyon etkinliği azalabilir.

2. Kültürde şizont üretimi

1. Adım 1.3'te enfekte farelerden kan toplayın (iki fareden toplamda yaklaşık 2 mL) steril bir ortamda 5 mL Alsever çözeltisine (Malzeme Tablosuna bakınız). Steril koşullar altında 2.1'den 3.12'ye kadar olan adımları gerçekleştirin.
   NOT: Steril koşullar arasında eldiven giymek, eldiven ve yüzeyleri %70 etanol ile silmek, steril sarf malzemeleri ve malzemeler kullanmak ve bir biyogüvenlik kabini içinde çalışmak yer alır.
2. Kanı oda sıcaklığında (RT) 450 x g'da 8 dakika santrifüj edin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 10 mL tam RPMI ortamında (% 20 fetal sığır serumu [FBS] ve% 1 penisilin-streptomisin, v / v ile RPMI 1640) yeniden süspanse edin.
3. RT'de 450 x g'da 8 dakika santrifüjleyin. Peletin 25 mL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edilmesi ve filtre kapaklı bir T75 kültür şişesine aktarılması.
4. Hücreleri 16 saat askıda tutmak için hafifçe sallarken 36.5 °C ve% 5_CO2'de bir inkübatöre yerleştirin.
5. 16 saatlik zaman noktasında, schizont gelişimini kontrol edin. Bunu yapmak için, 500 μL numune toplayın, 8 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin, peleti 10 μL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin ve ince bir kan yayması hazırlayın. Kan yaymasını Giemsa boyası¹⁹ ile boyayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve şizontların sıklığını belirleyin (Şekil 1).
6. Optimum transfeksiyon verimliliği için, parazitlerin% 60-70'i şizont aşamasında olmalıdır. Bu eşikten daha azı belirlenirse, adım 2.4'teki gibi kültürlemeye devam edin ve devam etmeden önce yukarıdaki eşiğin geçildiğinden emin olmak için her saat kontrol edin.

3. Plasmodium şizontlarının transfeksiyonu

1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 1.44 mL 1.5 M NaCl ve 5.6 mL 0.15 M NaCl ile 13 mL yoğunluk gradyan stok ortamını (Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden oluşturarak bir gradyan santrifüjleme tamponu hazırlayın.
2. 25 mL kan kültürünü 50 mL'lik taze bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir gradyan sütunu oluşturmak için dar bir cam pipet kullanarak santrifüj tüpünün dibine 20 mL gradyan santrifüj tamponunu dikkatlice katmanlayın. Sıvı katmanlarını ve arayüzleri bozmamaya dikkat edin ve tampon ile ortam arasında net bir ayrım sağlayın.
3. RT'de frensiz 450 x g'de 20 dakika santrifüjleyin. Bir Pasteur pipeti kullanarak, kültür ortamının ve gradyan santrifüj tamponunun arayüzünde bulunan şizont tabakayı¹⁵ dikkatlice çıkarın ve yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
4. İzole edilmiş şizontları tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin ve toplam hacmi 40 mL'ye getirin. RT'de 8 dakika boyunca 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
5. Schizontları 10 mL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, bu çözeltinin 1 mL'sini her transfeksiyon için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve enfekte olmuş eritrositleri peletlemek için 5 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Yukarıdaki şekilde iki fareden türetilen enfekte RBC'ler, 10 ayrı transfeksiyona kadar kullanılabilir.
6. RT'de 100 μL elektroporasyon tamponunu (elektroporasyon kitinden nükleofektör çözeltisi; Malzeme Tablosuna bakınız) 5 μg dairesel veya doğrusallaştırılmış hedef plazmit DNA (maksimum 10 μL hacme kadar) ile birleştirin, ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde her transfeksiyon için uygulanabilir. Transfeksiyon ve antibiyotik seçimi için bir kontrol olarak "plazmidsiz" bir numune dahil edilmelidir.
7. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı adım 3.5'ten çıkarın ve enfekte olmuş RBC'leri hazırlanan nükleofektör çözeltisi + plazmit DNA'da (adım 3.6'dan itibaren) dikkatlice yeniden süspanse edin.
8. Süspansiyonu (nükleofektör çözeltisi + plazmid + şizontlar; maksimum 110 μL) elektroporasyon küvetlerine aktarın. Uygun bir nükleofektör programı kullanarak transfekt yapın (U-033, Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: 3.8 ile 3.10 arasındaki adımların RT'de gerçekleştirildiğinden emin olun.
9. Küvete 100 μL tam RPMI ortamı ekleyin ve tüm çözeltiyi (şimdi 200 μL toplam hacim) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve RT'de tutun.
10. Transfekte edilmiş parazitlerin 200 μL çözeltisini intravenöz olarak farelere enjekte edin (i.v.), transfeksiyon ile farelere son enjeksiyon arasındaki süreyi en aza indirmeye çalışın.
    NOT: Transfekte edilen şizontlar, protokolün verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için elektroporasyondan 5 dakikadan daha kısa bir süre sonra farelere enjekte edilir.

4. Transfekte edilen parazitlerin seçimi

1. Enfeksiyonu doğrulamak için transfekte edilmiş şizontlarla aşılanan farelerde parazitemi seviyelerini günlük 2 d.p.i.'den kontrol edin.
2. Enfeksiyon doğrulandıktan sonra, ilacın içme suyunda oral yoldan verilmesini kullanarak ilaç seçimine başlayın.
   NOT: Plazmid için seçilebilir ilaç belirteci olarak pirimetamin kullanılmıştır. Bu durumda, 250 mL temiz suya 17.5 mg pirimetamin ilave edildi (son konsantrasyon 70 mg / L). Ek olarak, pirimetamin içeren suyun fareler tarafından yeterli tüketimini teşvik etmek için bu suya 10 g şeker ilave edildi.
3. Pirimetamin tedavisinin başlamasından 6 gün sonra başlayarak, 5 μl kanla yapılan kan yaymalarını kullanarak parazitemiyi her iki günde bir izleyin. 15 gün sonra saptanabilir parazitlerin olmaması, transfeksiyonun başarısız olduğunu gösterir; Bu durumda, yeni bir deneme için işlemi adım 1.1'den yeniden başlatın.
4. Parazitemi en az% 1'e ulaştığında, kan evresi parazit stoklarının oluşturulması için parazitleri saf B6 farelerine aktarın. Yeni enfekte olmuş farelerde parazitemi %2-5'e ulaşana kadar seçime devam edin, bu noktada stoklar oluşturun ve bunları kriyoprezervasyon^{yapın 21}.

5. Sivrisineklerin transgenik çizgilerle enfeksiyonu

1. B6 farelerini, seçilen parazitleri içeren 200 μL kanla enfekte edin (2 x 10⁵ enfekte RBC/fare, i.v.). Sivrisinek besleme ve enfeksiyon gününde bu farelerde parazitemiyi belirleyin. % 2 -% 5 arasındaki parazitemi, sivrisineklerin enfeksiyonu için idealdir. Doğrulandıktan sonra, enfeksiyonu hemen 5.2-5.4 adımlarına göre dişi Anopheles stephensi sivrisineklerine aktarın).
   NOT: Enfeksiyon için sivrisinek içeren kuluçka makineleri 20.5 °C'de, %80 nemde ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsünde tutulmalıdır (ışıklar 07:00 - 07:00 saatleri arasında açıktır).
2. Sivrisinek enfeksiyonundan bir gün önce, hem erkek hem de dişi sivrisinekleri içeren kafesin üzerine, 37 °C'ye ısıtılmış suyla doldurulmuş ince bir plastik mesane veya eldiven gibi bir ısı kaynağı yerleştirerek dişi sivrisinekleri ayırın. Isı kaynağına çekilen dişi sivrisinekleri bir böcek aspiratörü kullanarak çıkarın ve bunları enfeksiyon için ayrı, daha küçük bir kafese aktarın.
   NOT: Erkek sivrisinekler, biraz küçültülmüş vücut boyutları ve tüylü antenleri ile dişi sivrisineklerden ayırt edilebilir.
3. Enfekte farelere genel anestezik enjekte edin (ör.% 2 tribromoetanol / avertin). Her farenin ayak pedini sıkıca sıkıştırarak tam anestezi sağlayın. Reaksiyona girmezlerse, yeterince yatıştırılırlar ve enfeksiyonu sivrisineklere aktarmaya hazırdırlar.
4. Anestezi uygulanmış fareleri, sternal yaslanma altında kafesli dişi sivrisineklerin üzerine (adım 5.2'den itibaren) yerleştirin. Sivrisinek beslemesi için en büyük yüzey alanını sağlamak için ön ve arka bacakları manuel olarak açın. Enfekte fareleri her kafesin üzerinde toplam 15 dakika bırakın ve farelerin uyanık olmadığından emin olmak için her 5 dakikada bir kontrol edin. Beslenme tamamlandıktan sonra, fareleri servikal çıkık kullanarak veya kurumsal hayvan kullanım protokolüne göre ötenazi yapın ve güvenli bir şekilde atın.

6. Sporozoitlerin toplanması

1. Başarılı enfeksiyonu ve sivrisineklerde Plasmodium gelişimini doğrulamak için yaklaşık 10 d.p.i.'de sivrisinek orta bağırsaklarını ookistler açısından kontrol edin. Forseps kullanarak terminal karın segmentini çıkararak sivrisinek orta bağırsaklarını karından izole edin. Ookistlerin varlığı için orta bağırsakları polarize ışık altında görselleştirin²².
2. Yabani tip sporozoitlerin, enfekte farelerle beslendikten 18-21 gün sonra sivrisineklerin tükürük bezlerinde bulunması beklenir. 18. günde, sporozoit sayılarını değerlendirmek için 5-10 sivrisineği inceleyin.
   NOT: Sivrisinekler etanolde yıkanır ve öldürülür. Daha sonra, ölü sivrisinekler diseksiyondan önce kalıntıları gidermek için PBS ile iki kez yıkanır.
3. Sporozoitleri izole etmek ve saymak için, forseps veya ince bir diseksiyon iğnesi kullanarak sivrisinek göğsüne basınç uygularken sivrisineğin başını dikkatlice çıkarın. Tükürük bezleri çıkarılan kafaya yapışık kalır (Şekil 2).
4. Tükürük bezlerindeki ek sivrisinek kalıntılarını çıkarın ve 400 μL sivrisinek diseksiyon ortamı içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin (Dulbecco'nun %1 fare serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içeren modifiye Ealge ortamı [DMEM]; bkz.
5. İzole edilen tükürük bezlerini 30 G iğneli bir şırıngadan 15-20 kez geçirerek bozun. Sivrisinek diseksiyon ortamındaki bozulmuş tükürük bezlerinin 10 μL'sini bir hemositometreye yerleştirin ve sayın. Farelere enjeksiyon, hücre kültürlerine aşılama veya uzun süreli kriyoprezervasyon için istenen sivrisinek diseksiyon ortamı veya PBS konsantrasyonunda yeniden süspanse edin^23,24.

Sonuçlar

Şizontların sıklığını ve gelişimini belirlemek, yeterli sayıda canlı parazitin transfeksiyon için en uygun aşamada olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Olgunlaşmamış şizontlar, RBC'nin tüm hücre içi boşluğunu doldurmayan daha az merozoitin varlığı ile tamamen olgun şizontlardan ayırt edilebilir (Şekil 1B). Kültürlenmiş kandan kan yayması yapılırken, enfekte olmuş eritrositlerin kırılabileceğini ve bunun da kan yaymasında serbest, hücre dı...

Tartışmalar

Laboratuvarımızda birkaç transgenik P. berghei paraziti hattı oluşturmak için yukarıdaki protokolü kullandık. P. berghei için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu protokolü transgenik P. yoelii sporozoitleri üretmek için de başarıyla kullandık. Transfekte edilen şizontları farelere enjekte ettikten sonra, parazitler tipik olarak en geç 3 d.p.i. plazmid kontrolü de dahil olmak üzere tüm gruplarda. Elektroporasyonu takiben parazitlerin yaşayabilirliğini sağlamak için ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3